本發(fā)明屬生物藥物領(lǐng)域，涉及續(xù)隨子二萜烷型化合物的轉(zhuǎn)化方法，具體涉及利用已知微生物對續(xù)隨子二萜烷進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，制備具有抗癌活性的結(jié)構(gòu)重排衍生物。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開了續(xù)隨子二萜烷型化合物屬于二萜骨架的天然產(chǎn)物，具有較明顯的抗腫瘤活性與逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性(mdr)活性。構(gòu)效關(guān)系研究表明，其母核上取代基的差異能明顯改變該類化合物的抗腫瘤活性和mdr活性。
有研究公開了從大戟科植物續(xù)隨子euphorbialathyrisl.中首次分離得到續(xù)隨子二萜烷型化合物(tetrahedronletters,1971,18:1325-1328)；隨后從其他植物中陸續(xù)分離得到多種續(xù)隨子二萜烷型衍生物，如從大戟科植物euphorbialagascae中分離得到5個具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗腫瘤多藥耐藥性的續(xù)隨子二萜醇酯衍生物(plantamedica,2005,72:162-168)。研究表明，續(xù)隨子二萜烷型化合物的結(jié)構(gòu)特征具有5/11/3駢合的多元環(huán)體系，其中c-9、c-10、與c-11駢合的三元環(huán)是與其他大環(huán)二萜的主要不同點(diǎn)。雖然已經(jīng)從植物中分離得到多種結(jié)構(gòu)豐富的續(xù)隨子二萜烷型化合物，但至今尚未獲得c-9、c-10和c-11三元環(huán)開環(huán)的化合物，更無從得知該三元環(huán)裂環(huán)后的續(xù)隨子二萜烷衍生物的抗腫瘤活性及mdr活性。
微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物生長過程中合成的特異酶完成特定的生化反應(yīng)。據(jù)報道，微生物在生長過程中可以合成多種酶，催化不同反應(yīng)，例如氧化反應(yīng)、還原反應(yīng)、水解反應(yīng)、脫氫反應(yīng)等。此外，微生物還可以催化多種特異性的結(jié)構(gòu)重排反應(yīng)，生成新型的化合物結(jié)構(gòu)骨架。這種酶催化的結(jié)構(gòu)重排反應(yīng)，相對于化學(xué)反應(yīng)，更高效環(huán)保，可能得到活性更好、副反應(yīng)更低、具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物。迄今為止尚未見有關(guān)二萜骨架三元環(huán)開環(huán)的續(xù)隨子二萜類化合物的報道。
因此，本申請的發(fā)明人擬利用微生物對續(xù)隨子二萜烷型類化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)，以期獲得新型的c-9、c-10和c-11三元環(huán)開環(huán)的新型續(xù)隨子二萜結(jié)構(gòu)重排衍生物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供續(xù)隨子二萜烷型化合物骨架重排產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)改造方法，具體涉及續(xù)隨子二萜烷型化合物c-9、c-10和c-11三元環(huán)開環(huán)的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物的微生物轉(zhuǎn)化方法。
本發(fā)明涉及的續(xù)隨子烷二萜結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物具有式(i)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，經(jīng)鑒定所獲得的續(xù)隨子烷型二萜結(jié)構(gòu)重排化合物為：
化合物1c-10(11)裂環(huán)千金子二萜醇：r1＝h
化合物2c-10(11)裂環(huán)7β-羥基千金子二萜醇：r1＝oh
本發(fā)明中，續(xù)隨子二萜烷型化合物骨架重排產(chǎn)物包括式(i)續(xù)隨子二萜烷型化合物及其衍生物、立體異構(gòu)體，以及其所形成的在藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物或一種藥物組合物，
其中，所述結(jié)構(gòu)為5/11元環(huán)駢合，c-11位存在β-羥基，c-9位存在β構(gòu)型2-丙烯基；r1是氫或羥基；
本發(fā)明中，所述的化合物由續(xù)隨子二萜烷型化合物生物轉(zhuǎn)化得到，續(xù)隨子二萜骨架中原有的c-9、c-10和c-11三元環(huán)開環(huán)伴隨重排反應(yīng)；
所述的生物轉(zhuǎn)化法中，利用拉曼被孢霉mortierellaramanniana對續(xù)隨子二萜烷型化合物進(jìn)行酶催化反應(yīng)；
本發(fā)明中，所述的藥學(xué)上可接受的鹽是指與鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、富馬酸、酒石酸、甲基磺酸、對甲基苯磺酸，二乙醇胺、三乙醇胺形成的化學(xué)計量形式和非化學(xué)計量形式的鹽。
本發(fā)明采用現(xiàn)代藥理篩選方法，進(jìn)行續(xù)隨子烷二萜經(jīng)拉曼被孢霉mortierellaramanniana轉(zhuǎn)化得到的兩個結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物1和2的細(xì)胞試驗，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化得到的兩個結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物1和2對人乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)和人結(jié)腸癌細(xì)胞(caco-2)有抑制活性，證實其具有抗癌活性；所述的化合物或其藥物組合物可用于制備抗腫瘤活性藥物。
本發(fā)明的實施例中，采用微生物轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化所述的續(xù)隨子二萜烷型化合物結(jié)構(gòu)重排衍生物，包括以下步驟：
1)生產(chǎn)菌株為拉曼被孢霉mortierellaramanniana，該菌株在瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，將生長在瓊脂培養(yǎng)基上的拉曼被孢霉菌絲劃線接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基上，在20-28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7天，得到試管種；其中，所述拉曼被孢霉mortierellaramanniana菌種微生物還包括其功能等同的變異體和突變體。其中，固體培養(yǎng)基包含組分：馬鈴薯液體培養(yǎng)基加入1％瓊脂，加熱溶解并分裝，121℃高壓滅菌20分鐘后，放涼使用；
2)將試管種中的菌絲接種到250ml的三角瓶中，每瓶含有50ml液體馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28℃，轉(zhuǎn)速為130-180rpm，培養(yǎng)時間為24小時，獲得種子液；
3)將種子液按2％～5％體積比接入新鮮馬鈴薯培養(yǎng)基，28℃，130-180rpm條件下培養(yǎng)24-72小時后，加入轉(zhuǎn)化底物千金子二萜醇或7β-羥基千金子二萜醇，在20-28℃、130-180rpm的條件下轉(zhuǎn)化培養(yǎng)72-240小時；
其中，液體培養(yǎng)基包括組分：200g馬鈴薯去皮，切成1立方厘米小丁，經(jīng)1l水微沸煎煮20分鐘，隨后用8層紗布趁熱過濾，放涼后濾液用水補(bǔ)齊到1l，加入20g葡萄糖，攪拌溶解；分裝后121℃高壓滅菌20分鐘后，放涼使用；
4)將發(fā)酵液用布氏漏斗減壓過濾，獲得發(fā)酵濾液，按照1:1.5體積比用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓蒸干，發(fā)酵產(chǎn)物用硅膠柱層析法分離得到千金子二萜醇的發(fā)酵產(chǎn)物c-10(11)裂環(huán)千金子二萜醇(1)和7β-羥基千金子二萜醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物c-10(11)裂環(huán)7β-羥基千金子二萜醇(2)。
本發(fā)明還提供一種抗腫瘤活性的藥物或藥物組合物，其中含有式(i)的續(xù)隨子二萜烷型化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
提供了新型續(xù)隨子二萜烷型化合物，所述化合物的結(jié)構(gòu)特征是續(xù)隨子二萜烷中駢合的三元環(huán)發(fā)生開環(huán)并重排，得到羥基和丙烯基取代的開環(huán)化合物，此類化合物是由5/11/3環(huán)系的續(xù)隨子二萜烷型化合物經(jīng)過拉曼被孢霉mortierellaramanniana生物轉(zhuǎn)化得到；該類續(xù)隨子二萜烷型化合物經(jīng)重排羥化后水溶性增強(qiáng)，提高成藥性。
具體實施方式
實施例1高效液相色譜法(hplc)檢視拉曼被孢霉mortierellaramanniana將千金子二萜醇(lathyrol)和7β-羥基千金子二萜醇轉(zhuǎn)化為各自結(jié)構(gòu)重排的產(chǎn)物
所述菌種篩選培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基：將200g去皮馬鈴薯切成1立方厘米小丁，用1l水煮沸20分鐘，馬鈴薯液過濾后加入20g葡萄糖，分裝于250ml三角瓶，每瓶50ml，在121℃、0.15mpa下滅菌20分鐘；
菌種接種于斜面固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7天，保存于4℃冰箱內(nèi)，采用兩步活化法活化菌種，先將菌種接種于馬鈴薯培養(yǎng)基，28℃，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h后，獲得種子液；種子液以1％-3％體積比接種于另一馬鈴薯培養(yǎng)基內(nèi)，同條件培養(yǎng)48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml的千金子二萜醇或7β-羥基千金子二萜醇乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml，空白對照組加入同體積乙醇溶液；同條件培養(yǎng)72h后，抽濾發(fā)酵液后得濾液，加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，殘渣加1ml甲醇溶解作為待測樣品；
用微孔濾膜將樣品甲醇溶液過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行hplc檢測。液相條件為：
流動相：40％的甲醇-水至80％的甲醇-水于40分鐘內(nèi)線性梯度洗脫，流速：1ml/min
色譜柱：ods-c18柱(250×4.6mm,5μm)，柱溫：25℃
檢測器：二極管陣列檢測器(dad)
新型續(xù)隨子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物樣品峰的保留時間小于千金子二萜醇(lathyrol)樣品峰的保留時間；且該新型續(xù)隨子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物的紫外圖譜中最大吸收波長(λmax)為254nm，而千金子二萜醇或7β-羥基千金子二萜醇的λmax為280nm；與空白對照組相比，待測樣品出現(xiàn)λmax為254nm且保留時間小于各自底物的色譜峰，表明拉曼被孢霉mortierellaramanniana已經(jīng)將該底物轉(zhuǎn)化為新型續(xù)隨子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物。
實施例2制備千金子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(1)
采用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以1％體積比接種于裝有250ml馬鈴薯培養(yǎng)基、體積為1l三角瓶中，28℃，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml的千金子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml，同條件培養(yǎng)108h后，發(fā)酵液抽濾，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到發(fā)酵液總提物；
發(fā)酵液總提物用少量乙酸乙酯溶解，以1g硅膠拌樣，二氯甲烷濕法上樣于裝有40g柱層析硅膠的硅膠柱內(nèi)，用二氯甲烷-甲醇(30:1)洗脫，得到含千金子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(1)的流分，回收溶劑，用甲醇溶解殘渣，將樣品溶液用微孔濾膜過濾，續(xù)濾液采用配有ods色譜柱的高效液相色譜檢測。流動相為40％～80％的甲醇-水，40min內(nèi)線性梯度洗脫，在保留時間(tr)14min左右出現(xiàn)一個λmax為254nm的樣品峰，即為化合物1；化合物1的nmr結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如表1所示。
實施例3制備7β-羥基千金子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(2)
采用兩步活化法活化菌種，獲得的種子液以1％體積比接種于裝有250ml馬鈴薯培養(yǎng)基、體積為1l三角瓶中，28℃，180rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48h，每瓶活化后的菌液加入5mg/ml的7β-羥基千金子二萜醇的乙醇溶液，終濃度為0.1mg/ml，同條件培養(yǎng)108h后，發(fā)酵液抽濾，濾液加乙酸乙酯萃取3次，合并后回收乙酸乙酯，得到發(fā)酵液總提物；
發(fā)酵液總提物用少量乙酸乙酯溶解，以1g硅膠拌樣，二氯甲烷濕法上樣裝有40g柱層析硅膠的硅膠柱內(nèi)，用二氯甲烷-甲醇(30:1)洗脫，得到含7β-羥基千金子二萜醇的結(jié)構(gòu)重排產(chǎn)物(2)的流分，回收溶劑，用甲醇溶解殘渣，將樣品溶液用微孔濾膜過濾，續(xù)濾液采用配有ods色譜柱的高效液相色譜檢測。流動相為40％～80％的甲醇-水，40min內(nèi)線性梯度洗脫，在保留時間(tr)17min左右出現(xiàn)一個λmax為254nm的樣品峰，即為化合物2；化合物2的nmr結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如表1所示。
表1.化合物1和2的1h-和13cnmr數(shù)據(jù)(cdcl3,400mhz)
實施例4化合物1和2的體外抗腫瘤活性試驗
采用人乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)及人結(jié)腸癌細(xì)胞(caco-2)作為測試化合物1和2的體外抗腫瘤模型；mcf-7細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10％小牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基，caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基為含有10％小牛血清、1％谷氨酸的dmem培養(yǎng)基。細(xì)胞經(jīng)10％胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)基吹散制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為105/ml，將細(xì)胞接種于96孔板，每孔體積為100μl。經(jīng)過37℃、5％co2孵育24h后，棄去上清液，細(xì)胞分組加含藥培養(yǎng)基200μl，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔。實驗組加入不同濃度的化合物1和2的dmso溶液(100.0、80.0、50.0、40.0、25.0、20.0、12.5、10.0、6.25、5.0μm)，空白組加入同體積不含藥dmso溶液；將96孔板置于37℃，含5％co2的細(xì)胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl5mg/ml的mtt，37℃避光孵育4h，棄去上清液，每孔加入150μldmso，用平板振蕩儀振蕩15min，使結(jié)晶溶解。用酶標(biāo)儀在570nm波長下檢測每孔光吸收值(od值)；計算化合物1和2對mcf-7及caco-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(ic50)；根據(jù)mtt比色法結(jié)果顯示，化合物2在實驗濃度內(nèi)對mcf-7及caco-2細(xì)胞均有抑制作用，其ic50分別為51.3±2.8μm和16.5±1.6μm。