本發(fā)明屬于天然藥物或天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種竹葉蘭茋類化合物提取物及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
：竹葉蘭(arundinagraminifolia)，別名長桿蘭，為蘭科竹葉蘭屬多年生草本植物，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。在中國西雙版納地區(qū)，傣族人民稱之為“農(nóng)尚嗨”、“百樣解”?！稗r(nóng)尚嗨”意為吃了就好，“百樣解”意為解百毒，是一種傣醫(yī)別具特色的解毒良藥。《中藥大辭典》中記載竹葉蘭具有清熱解毒，祛風除濕，散瘀止痛，消炎、利尿的作用，用于治療黃疸，熱淋，水腫，腳氣水腫，疝氣腹痛，風濕痹痛，胃痛，尿路感染，毒蛇咬傷，瘡癰腫毒，跌打損傷等。技術(shù)實現(xiàn)要素：
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種竹葉蘭茋類化合物提取物的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法制備得到的竹葉蘭茋類化合物提取物。本發(fā)明的再一目的在于提供上述竹葉蘭茋類化合物提取物的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種竹葉蘭茋類化合物提取物的制備方法，包括如下步驟：(1)竹葉蘭干燥切碎，按每克原料藥1～100ml的用量加入體積濃度30％～100％乙醇溶劑浸泡0～24h，熱回流提取1～4次，每次0.5～4h，過濾，合并提取液，減壓濃縮，得到竹葉蘭乙醇提取物濃縮液；(2)將步驟(1)得到的竹葉蘭乙醇提取物濃縮液與100～400目硅膠按干膏與硅膠質(zhì)量比1:0.1～1:20，拌勻，蒸干，先用石油醚熱回流洗脫0.5～48h，除去脂溶性雜質(zhì)，然后用乙酸乙酯熱回流洗脫0.5～48h，收集乙酸乙酯洗脫液；(3)將步驟(2)收集的乙酸乙酯洗脫液，減壓濃縮至干，即得到竹葉蘭茋類化合物提取物。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的切碎為切碎至2～3cm長度的小段，更優(yōu)選為3cm長度的小段。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的乙醇溶劑的體積濃度為70％～100％。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的乙醇溶劑的用量為5～15ml/g竹葉蘭；更優(yōu)選為8～11ml/g竹葉蘭。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的浸泡的時間為2～12h。優(yōu)選的，步驟(1)中所述的提取是提取次數(shù)2～3次，每次2h；更優(yōu)選是提取次數(shù)3次，每次2h。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的硅膠為100～200目硅膠，所述的濃縮液干膏與硅膠質(zhì)量比1:1～1:5；更優(yōu)選為1:1～1:3。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的用石油醚熱回流洗脫的時間為10～30h；更優(yōu)選為20h；優(yōu)選的，步驟(2)中所述的用乙酸乙酯熱回流洗脫的時間為20～40h；更優(yōu)選為20h。優(yōu)選的，步驟(3)中收集乙酸乙酯洗脫液，減壓濃縮干燥后，得到竹葉蘭茋類化合物提取物。一種竹葉蘭茋類化合物提取物，通過上述制備方法制備得到。所述的竹葉蘭茋類化合物提取物中含有多種活性茋類化合物，主要包括但不局限于blestriarenea(1)，shancidin(2)，densiflorolb(3)，ephemeranthouinone(4)，coelonin(5)，lusianthridin(6)，所述的竹葉蘭茋類化合物結(jié)構(gòu)式如下：所述的竹葉蘭茋類化合物提取物在生物醫(yī)藥方面的應用。所述的竹葉蘭茋類化合物提取物具有抑菌、抗感染的作用，用于制備抑菌、抗感染的產(chǎn)品。優(yōu)選的，所述的菌為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌或大腸桿菌；更優(yōu)選的，所述的菌為金黃色葡萄球菌。優(yōu)選的，所述的抗感染為抗金黃色葡萄球菌感染。優(yōu)選的，所述的產(chǎn)品的劑型為膠囊、口服液等。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明采用一定濃度的乙醇溶劑進行提取，提取濃縮液用粗硅膠吸附分散后，裝入恒壓分液漏斗，通過“液固萃取法”，先用石油醚加熱回流洗脫除去脂溶性雜質(zhì)，然后用乙酸乙酯洗脫，收集乙酸乙酯洗脫物，減壓干燥，得到具抑菌、抗感染作用的茋類化合物提取物。本發(fā)明采用“液固萃取”技術(shù)，可以特異性富集竹葉蘭中茋類化合物，采用的提取和萃取溶劑環(huán)保、無毒或毒性很小，石油醚脫脂除雜處理后，再用乙酸乙酯洗脫，即可得到富含茋類化合物的提取物，操作簡單，回流連續(xù)提取，減少了溶劑的消耗。(2)本發(fā)明的制備方法工藝簡單環(huán)保，效率高，節(jié)約溶劑。本發(fā)明的提取物可用于制備抑菌、抗感染產(chǎn)品。附圖說明圖1是竹葉蘭茋類化合物提取物及對照品的hplc液相圖；其中，a：竹葉蘭茋類化合物提取物，b：對照品；1、densiflorolb，2、coelonin，3、ephemeranthouinone，4、lusianthridin，5、shancidin，6、blestriarenea。圖2是竹葉蘭茋類化合物提取物對金黃色葡萄球菌s.aureus、枯草芽孢桿菌b.subtilis、大腸桿菌e.coli的抑菌效果圖。圖3是竹葉蘭茋類化合物提取物對金黃色葡萄球菌溶血毒素所致紅細胞損傷的保護作用；其中，(a)正常紅細胞；(b)金黃色葡萄球菌溶血毒素損傷的紅細胞；(c)竹葉蘭茋類化合物提取物與金黃色葡萄球菌溶血毒素共同作用后的紅細胞。具體實施方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1竹葉蘭茋類化合物提取物的制備取干燥切碎的竹葉蘭全草100g，用體積分數(shù)70％的乙醇溶劑800ml浸泡2h后，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，得到的濃縮液與100～200目硅膠，按照干膏與硅膠質(zhì)量比1:1拌勻，蒸干后，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫20h，洗脫除去雜質(zhì)，再用乙酸乙酯加熱回流洗脫20h，收集乙酸乙酯部分流出洗脫液，減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭茋類化合物提取物。實施例2竹葉蘭茋類化合物提取物的制備取干燥切碎的竹葉蘭全草100g，用體積分數(shù)80％的乙醇溶劑900ml浸泡4h，然后加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，得到的濃縮液與100～200目硅膠，按照干膏與硅膠質(zhì)量比1:2拌勻，蒸干后，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫10h，洗脫除去雜質(zhì)，再用乙酸乙酯加熱回流洗脫30h，收集乙酸乙酯洗脫，液減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭茋類化合物提取物。實施例3竹葉蘭茋類化合物提取物的制備取干燥切碎的竹葉蘭全草100g，用體積分數(shù)95％的乙醇溶劑1000ml浸泡5h，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，得到的濃縮液與200～300目硅膠，按照干膏與硅膠質(zhì)量比1:3拌勻，蒸干后，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫10h，洗脫除去雜質(zhì)，再用乙酸乙酯加熱回流洗脫40h，收集乙酸乙酯洗脫，液減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭茋類化合物提取物。實施例4竹葉蘭茋類化合物提取物的制備取干燥切碎的竹葉蘭全草100g，用體積分數(shù)100％的乙醇1100ml浸泡12h，加熱回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮，得到的濃縮液與300～400目硅膠，按照干膏與硅膠質(zhì)量比1:3拌勻，蒸干后，裝入恒壓分液漏斗，先用石油醚熱回流洗脫30h，洗脫除去雜質(zhì)，再用乙酸乙酯加熱回流洗脫40h，收集乙酸乙酯洗脫，液減壓濃縮干燥，得到竹葉蘭茋類化合物提取物。實施例5高效液相色譜分析竹葉蘭茋類化合物提取物成分供試品溶液的配制：按實施例1方法制得竹葉蘭茋類化合物提取物用適量的甲醇溶解；分析方法：高相液相色譜儀：agilent色譜柱：bdcc18(4.6×200mm，5μm)；流動相：乙腈-水30:70；檢測波長：279nm；柱溫：30℃；進樣量：10μl。對10批不同產(chǎn)地、批次的竹葉蘭制備的茋類化合物提取物進行分析，建立指紋圖譜進行匹配，結(jié)果保留時間4.6、11.1、15.2、18.4、23.2、33.8min的峰在10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)，因此標定6個峰為共有指紋峰，據(jù)此建立該提取物的hplc指紋圖譜，結(jié)果如圖1所示。實施例6竹葉蘭茋類化合物提取物膠囊的制備按實施例1方法制得竹葉蘭茋類化合物提取物，加入適量二氧化硅，混勻，制成膠囊。實施例7竹葉蘭茋類化合物提取物口服液的制備按實施例1方法制得竹葉蘭茋類化合物提取物，加入適量水稀釋，靜置濾過，加入糖漿、苯甲酸鈉，再加水攪勻，冷藏，濾過，封裝于10ml易拉瓶中，滅菌，即得。實施例8竹葉蘭茋類化合物提取物的抗菌活性研究按照實施例1中的方法制備竹葉蘭茋類化合物提取物，測定該提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌的抑菌圈。菌種及試劑來源：金黃色葡萄球菌s.aureusatcc29213，枯草芽孢桿菌b.subtiliscmcc63501，大腸桿菌e.colicmcc44825購自廣東省菌種保藏中心。dmso由天津市富宇精細化工有限公司提供。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基依藥典配制。菌種活化：從保存完好的固體培養(yǎng)基上挑取單個菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)16～18h，轉(zhuǎn)速100rpm。采用牛津杯法測定抑菌圈大小。取100μl106cfu/ml菌懸液加入滅菌凝固后的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，均勻涂布。將直徑為6mm的牛津杯置于平板上，每個牛津杯中加入100μl10mg/ml的供試品溶液，37℃恒溫培養(yǎng)24h后用直尺測量抑菌圈大小。每個平板放三個牛津杯作為平行。以dmso為陰性對照。結(jié)果如表1和圖2所示。表1竹葉蘭茋類化合物提取物(10mg/ml)的抑菌圈直徑。抑菌圈直徑/mm金黃色葡萄球菌11枯草芽孢桿菌12大腸桿菌13竹葉蘭茋類化合物提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌的最小抑菌濃度及最小殺菌濃度測定。二倍稀釋法測最小抑菌濃度：100μl牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基逐孔加入96孔板，然后取100μl供試品溶液(10mg/ml)加入第1孔，吹打均勻后，吸取100μl加入第2孔，第2孔混勻后，取100μl加入第3孔，依次類推至第6孔。第7孔和第8孔不加藥液。取100μl制備好的105cfu/ml的菌懸液加入第1至7孔，第8孔不加菌液。將96孔板置于恒溫震蕩器中37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)后培養(yǎng)液澄清，即無明顯細菌生長的最低濃度為最小抑菌濃度。吸取培養(yǎng)24h后仍然澄清的培養(yǎng)液100μl，涂布于固體平板上，37℃代培養(yǎng)24h。無菌落生長的最低濃度記為最小殺菌濃度。每組實驗三個平行樣，以5％～0.16％的dmso為陰性對照。結(jié)果如表2所示。表2竹葉蘭茋類化合物提取物最小抑菌濃度及最小殺菌濃度最小抑菌濃度(μg/ml)最小殺菌濃度(μg/ml)金黃色葡萄球菌6252500枯草芽孢桿菌625>2500大腸桿菌625>2500從表1、表2中得知，通過抑菌圈、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度的測定，表明竹葉蘭茋類化合物提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌有一定的抑制作用，尤其是金黃色葡萄球菌。本發(fā)明通過如下實驗說明竹葉蘭茋類化合物提取物具有抗感染作用。竹葉蘭茋類化合物提取物對金黃色葡萄球菌外毒素誘導的紅細胞損傷的保護作用。溶血毒素的收集：活化后的金黃色葡萄球菌，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37℃，150rpm條件下，培養(yǎng)3天(確保細菌已進入對數(shù)生長末期，溶血毒素大量釋放于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中)。然后3000rpm離心10min，收集上清液，0.22μm濾膜過濾除菌，備用。取0.225ml4％紅細胞與樣品混合，37℃保溫10min后，加入0.05ml溶血毒素溶液，用磷酸鹽緩沖溶液補加體積至0.5ml(提取物終濃度為0，400，500，600，700，800μg/ml)，37℃孵育1h，3000rpm離心10min，上清液在540nm處測吸光度，紅細胞置于倒置顯微鏡下觀察形態(tài)(圖3)。紅細胞溶血抑制率計算公式如下：紅細胞的溶血抑制率i％＝(1-a/a0)×100％表3竹葉蘭茋類化合物提取物對金黃色葡萄球菌外毒素誘導的紅細胞溶血的抑制率(n＝3)表3及圖3的實驗結(jié)果表明，竹葉蘭茋類化合物提取物能夠緩解由金黃色葡萄球菌溶血毒素對紅細胞造成的損傷，有助于維持紅細胞的形態(tài)特征。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12