本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及一種從中藥梔子中高效同時(shí)制備6種環(huán)烯醚萜苷類成分的分離純化方法，主要分離純化去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、龍船花苷、雞屎藤次苷甲酯、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷和京尼平苷等6個(gè)單體化合物。

背景技術(shù)：

梔子為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis ）的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒，外用消腫止痛的功效。藥理學(xué)研究表明，梔子具有解熱鎮(zhèn)靜、保肝利膽等功效，臨床上用于治療急性黃疸性肝炎、止痛、扭挫傷、冠心病等。

以京尼平苷為代表的環(huán)烯醚萜類成分為梔子的主要藥效成分，包括雞屎藤次苷甲酯、羥異梔子苷、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷等，具有保肝、抗炎等多方面的藥理活性，《中國(guó)藥典》收載了以梔子苷為對(duì)照品的定性定量分析方法。隨著對(duì)梔子的深入研究，迫切需要開(kāi)發(fā)一種從梔子中高效分離純化多種環(huán)烯醚萜類成分的方法，從而為梔子的質(zhì)量評(píng)價(jià)、藥效物質(zhì)研究、臨床應(yīng)用及梔子相關(guān)制劑的深入研發(fā)奠定基礎(chǔ)。但該類成分結(jié)構(gòu)類似，極性相近，水溶性大，穩(wěn)定性差，分離純化較為困難。

目前，從梔子中提取純化環(huán)烯醚萜苷類成分多有報(bào)道，傳統(tǒng)分離方法多采用柱色譜法，以有毒有機(jī)溶劑洗脫分離，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，純度不夠理想，易造成環(huán)境污染。中國(guó)專利（一種用梔子果實(shí)制備高純度梔子苷的方法，CN1706859A）采用大孔吸附樹(shù)脂、低濃度乙醇選擇性洗脫，僅得到純度為98.9%的梔子苷一個(gè)單體成分。中國(guó)專利（用梔子果實(shí)制備梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷的方法，CN1706858A）采用大孔樹(shù)脂、高速逆流色譜和制備液相相結(jié)合的方法，僅分離得到了梔子苷、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷2個(gè)高純度成分，且大量使用乙酸乙酯、正丁醇等有機(jī)溶劑。中國(guó)專利（一種提取去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯和雞屎藤次苷甲酯的方法，CN103242390A）通過(guò)大孔樹(shù)脂除雜、硅膠柱洗脫除雜和中低壓制備液相分離得到去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯和雞屎藤次苷甲酯2個(gè)單體類成分，操作過(guò)程繁瑣，且對(duì)環(huán)境有污染。中國(guó)專利（一種用梔子果實(shí)制備總環(huán)烯醚萜苷的方法，CN1706860A）采用大孔樹(shù)脂、低濃度乙醇洗脫的方法，得到環(huán)烯醚萜總苷的純度為85.7%，其中梔子苷的含量為55-65%，未得到純度大于95%以上的單體化合物。中國(guó)專利（梔子環(huán)烯醚萜總提取物及其制備方法和用途，CN1517326A）通過(guò)乙醇滲漉、乙醇回流提取或水煎煮方法得到環(huán)烯醚萜總提取物，該提取工藝較為粗放，未得到如京尼平苷等單體化合物。中國(guó)專利（梔子果實(shí)中環(huán)烯醚萜苷和藏紅花素的分離富集方法，CN101012248A）通過(guò)大孔樹(shù)脂分離，30%乙醇梯度洗脫富集得到環(huán)烯醚萜苷類組分，得率為6.5%，其中梔子苷含量為65%，60%乙醇梯度洗脫得到藏紅花素類組分，得率為4.5%，其中藏紅花素Ⅰ的含量為13%，未得到高純度的單體類成分。上述幾種方法僅能得到一種或少數(shù)幾種環(huán)烯醚萜苷類成分，操作繁瑣，目前還未見(jiàn)從梔子中同步制備6種環(huán)烯醚萜苷類成分的方法。

本發(fā)明以梔子果實(shí)醇提物為原料，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱粗分離、反相中壓液相色譜富集和反相高壓液相色譜制備純化等3步高效分離、純化，在線檢測(cè)收集相應(yīng)流份，冷凍干燥，即可同時(shí)得到6個(gè)純度大于95%的環(huán)烯醚萜苷類成分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種工藝簡(jiǎn)單、分離量大、成本低、易規(guī)?；目焖僦苽涠喾N高純度梔子環(huán)烯醚萜苷類成分的方法，經(jīng)3步分離純化即可得到高純度的雞屎藤次苷甲酯、羥異梔子苷、龍船花苷、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷和京尼平苷等6個(gè)單體化合物，技術(shù)方法簡(jiǎn)單、新穎、高效。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)施：

1．梔子醇提物的制備：取梔子果實(shí)粗顆粒，以40-60%的乙醇回流提取，盡可能將梔子中的化學(xué)成分提取完全，過(guò)濾，合并濾液。減壓回收乙醇至無(wú)醇味，得梔子醇提物浸膏。

2．大孔吸附樹(shù)脂柱分離：取梔子醇提物浸膏以適量水分散溶解后，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱分離，順序以水、不同濃度的水-乙醇梯度洗脫，收集各洗脫部位，適當(dāng)濃縮，經(jīng)HPLC檢測(cè)對(duì)比分析，將環(huán)烯醚萜苷類成分集中部位減壓濃縮，冷凍干燥得到黃褐色粉末。

3．中壓制備液相分離富集：取黃褐色粉末以適量稀甲醇溶解，以優(yōu)化的色譜分離條件，通過(guò)ODS反相中壓制備柱分離，在線檢測(cè)，收集主要的色譜峰，減壓回收溶劑，冷凍干燥。經(jīng)HPLC分析，得到相應(yīng)的流份富集部位和2個(gè)單體化合物。

4．高壓制備液相分離制備：將中壓制備液相富集得到的部位，以優(yōu)化的色譜分離條件，通過(guò)反相高壓液相制備色譜柱分離，在線檢測(cè)，按峰順次收集4個(gè)色譜峰，分別減壓回收溶劑，冷凍干燥。以HPLC面積歸一化法檢測(cè)純度，得到4個(gè)單體化合物。

5．化合物結(jié)構(gòu)鑒定：以NMR檢測(cè)以及對(duì)照品對(duì)照法，鑒定6個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明與現(xiàn)有從梔子中制備環(huán)烯醚萜苷類成分的方法相比，具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

（1）本發(fā)明工藝流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，針對(duì)性強(qiáng)，分離效率高。

梔子醇提物通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱分離，結(jié)合反相中、高壓制備液相分離等3步操作，即可從梔子中分離制備6個(gè)環(huán)烯醚萜苷類成分，工藝流程較簡(jiǎn)單。以大孔吸附樹(shù)脂柱分離結(jié)合HPLC檢測(cè)分析，一步鎖定環(huán)烯醚萜苷類成分目標(biāo)洗脫部位，且經(jīng)水洗脫部位的除雜，減少了下一步對(duì)中壓制備液相色譜柱的污染；反相中、高壓制備液相色譜具有快速、高效、在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，目標(biāo)成分針對(duì)性強(qiáng)，制備的單體化合物純度高；與常用的硅膠柱層析多次反復(fù)分離相比，減少了由于死吸附而引起的目標(biāo)成分的大量損失，避免了大量有毒有機(jī)溶劑的使用，因而大大提高了分離效率。

（2）本發(fā)明采用的技術(shù)手段穩(wěn)定可靠經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好，適宜于放大中試生產(chǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。

大孔吸附樹(shù)脂價(jià)廉、可再生使用，反相柱填料可反復(fù)使用，中、高壓反相色譜易于擴(kuò)大制備分離規(guī)模，適于規(guī)?；a(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1 為梔子醇提物大孔吸附樹(shù)脂不同溶劑洗脫部位的HPLC色譜圖；

圖2 為30%乙醇洗脫部位的反相中壓制備液相色譜圖；

圖3 為A部位的反相高壓制備液相色譜圖；

圖4 為6個(gè)化合物的HPLC純度分析；

圖5 為6個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式；

圖6 為從梔子中同時(shí)制備6個(gè)環(huán)烯醚萜苷類成分的分離工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

　 現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，實(shí)施例僅限于說(shuō)明本發(fā)明，但保護(hù)范圍不被此限制。

1．梔子醇提物的制備：取梔子果實(shí)碾碎成粗顆粒，以10倍量50%的乙醇回流提取3次，每次1.0h，過(guò)濾，合并濾液。減壓回收乙醇至無(wú)醇味，得1g/mL的梔子醇提物浸膏。

2．大孔吸附樹(shù)脂柱分離和檢測(cè)環(huán)烯醚萜苷集中部位

（1）取梔子醇提物浸膏以適量水分散溶解后，通過(guò)HPD-100大孔吸附樹(shù)脂柱分離，以10倍量柱體積的水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，收集各洗脫部位，減壓濃縮，冷凍干燥得到不同洗脫部位的粉末。

（2）HPLC檢測(cè)對(duì)比分析

供試品的制備：取梔子藥材及大孔吸附樹(shù)脂柱不同洗脫部位粉末各適量，以甲醇溶解，過(guò)0.22μm微孔濾膜，備用。

HPLC分析：島津LC20-AT 高效液相色譜儀（四元梯度泵、DAD檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器），色譜柱為Agilent TC（2）C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相為0.2%甲酸水（A）—乙腈（B）梯度洗脫：0~30min (94%→94% A), 30~40min(94%→83% A), 40~48min (83%→80% A), 48~55min (80%→78% A), 55~60min (78%→73% A), 60~75min (73%→68% A), 75~82min (68%→66% A), 82~85min (66%→64% A), 85~95min (64%→61% A), 95~100min (61%→50% A), 100~105min (50%→0% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；柱溫40℃；流速：1ml/min；各供試品進(jìn)樣10μL。

結(jié)果：環(huán)烯醚萜苷類成分的特征吸收為238nm，根據(jù)不同洗脫部位出膏率及HPLC圖譜對(duì)比分析來(lái)看，環(huán)烯醚萜苷類成分主要集中于30%乙醇洗脫部位，經(jīng)冷凍干燥得到黃褐色粉末，故接下來(lái)主要針對(duì)該部位進(jìn)一步分離純化。具體結(jié)果見(jiàn)附圖1。

3．中壓制備液相富集流份A、分離2個(gè)單體化合物

（1）待分離樣品溶液的制備：稱取大孔樹(shù)脂分離得到的30%乙醇部位（黃褐色粉末）10g，以10%甲醇溶解至20mL，得到0.5g/ml的樣品溶液，過(guò)0.22μm微孔濾膜后，備用。

（2）中壓制備液相分離色譜條件：LC-3000 中高壓制備液相一體機(jī)（二元梯度泵、紫外檢測(cè)器、六通閥、定量環(huán)10mL ），制備柱長(zhǎng)31cm，內(nèi)徑2.6cm，反相C18柱填料（Fuji-ODS，25-40μm，130g）；流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B）梯度洗脫：0~30.0 min (10%→10% A)，30.01~32.0 min(10%→20% A)，32~60.0 min (20%→20% A)，60.01~65.0 min(20%→30% A)，65.1~160.0 min (30%→30% A)；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；流速：5.0ml/min；進(jìn)樣量5.0mL。

（3）樣品分離富集：將5.0mL樣品溶液注入已平衡好的反相中壓柱上，以上述色譜分離條件在線檢測(cè)，按照出峰時(shí)間和次序依次收集檢測(cè)到的色譜峰。根據(jù)中壓制備液相色譜圖，主要收集A、B、C等三個(gè)大的色譜峰，具體結(jié)果見(jiàn)附圖2。

（4）化合物純度分析：HPLC法，島津LC20-AT 高效液相色譜儀、色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速、柱溫同2.（2）項(xiàng)下；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2%甲酸水（B）梯度洗脫：0~22min A（6%→6%），22~32min A（6%→17%），32~38min A（17%→20%）。在該HPLC分析條件下，流份A為一混合物，有待于進(jìn)一步分離。收集流份B和C分別減壓濃縮至適量，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測(cè)，純度分別為90.12% 和93.25%；以甲醇重結(jié)晶分別得到白色粉末，2個(gè)化合物的純度提高至97.12% 和 98.70%。具體結(jié)果見(jiàn)附圖4。

4．高壓制備液相同步分離制備4個(gè)單體化合物

（1）A 流份樣品溶液的制備：取濃縮后的A流份樣品適量，以10%甲醇溶解制備成0.5mg/ml的樣品溶液，過(guò)0.22μm微孔濾膜后，備用。

（2）高壓制備液相分離色譜條件：LC-3000 中高壓制備液相一體機(jī)，YMC 高壓制備色譜柱 (250 mm×20 mm, 5μm)；流動(dòng)相為6%乙腈等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)238nm；流速：5.0ml/min；進(jìn)樣量1.0mL。

（3）樣品分離制備：按照上述優(yōu)化的色譜分離條件，依法進(jìn)樣，在線檢測(cè)，按照出峰時(shí)間和次序依次收集，A流份共收集到A1、A2、A3、A4等4個(gè)色譜峰，分別減壓回收溶劑，冷凍干燥得到白色粉末。具體結(jié)果見(jiàn)附圖3。

（4）化合物純度分析：HPLC法，同3.（4）項(xiàng)下色譜分析條件。以HPLC面積歸一化法檢測(cè)，結(jié)果4個(gè)單體化合物純度分別為97.89%, 98.12%, 95,45% 和 96.34%。具體結(jié)果見(jiàn)附圖4。

5．制備分離化合物的結(jié)構(gòu)鑒定：經(jīng)NMR測(cè)定并與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)對(duì)比、以及與已知對(duì)照品比對(duì)，6個(gè)化合物分別鑒定為乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯（A1、化合物1）、羥異梔子苷（A2、化合物2）、龍船花苷（A3、化合物3）、雞屎藤次苷甲酯（A4、化合物4）、京尼平-1-β-D-龍膽雙糖苷（B、化合物5）和京尼平苷（C、化合物6）等6個(gè)化合物?；衔锝Y(jié)構(gòu)式具體結(jié)果見(jiàn)附圖5。

6．應(yīng)當(dāng)指出的是，具體實(shí)施方式只是本發(fā)明比較有代表性的例子，顯然本發(fā)明的技術(shù)方案不限于上述實(shí)施例。本發(fā)明分離流程的具體結(jié)果見(jiàn)附圖6。