本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及視網(wǎng)膜細(xì)胞方面，具體涉及一種視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性表面蛋白的篩選方法。
背景技術(shù)：
：：視網(wǎng)膜是組成視覺(jué)系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。臨床上，針對(duì)屈光性視覺(jué)功能障礙，已有有效的治療方法，但對(duì)視網(wǎng)膜病變，尤其是外傷、變性等原因引起的視覺(jué)障礙或失明，目前仍束手無(wú)策。由于視網(wǎng)膜來(lái)源于神經(jīng)外胚層，具有典型的中樞神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，對(duì)損傷敏感，且難以再生，使其成為難治性眼病的癥結(jié)所在，也是眼科研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)和亟待攻克的領(lǐng)域。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多的研究人員為此開(kāi)展了廣泛的探索，國(guó)家科技部也分別于2005年、2007年和2012年分別設(shè)立了三個(gè)“973”項(xiàng)目予以攻關(guān)。此外，因結(jié)構(gòu)明晰、功能清楚，且便于操作和觀察，視網(wǎng)膜也是研究中樞神經(jīng)結(jié)構(gòu)、功能，乃至再生的重要窗口。盡管一些低等動(dòng)物的視網(wǎng)膜具有一定的再生能力，但一般認(rèn)為哺乳類(lèi)動(dòng)物，尤其是靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的視網(wǎng)膜是不具有這種能力。因此，如何激發(fā)視網(wǎng)膜內(nèi)在的再生潛能或通過(guò)外源性細(xì)胞的植入，以達(dá)到修復(fù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)甚至功能，成為近10多年來(lái)的研究熱點(diǎn)?？v觀近十年來(lái)的視網(wǎng)膜再生研究，在干細(xì)胞來(lái)源、干細(xì)胞誘導(dǎo)分化、動(dòng)物模型制備及干細(xì)胞移植方式上已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在諸多問(wèn)題有待解決。目前通過(guò)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化所獲得的視網(wǎng)膜細(xì)胞通常是多種細(xì)胞的混合，而視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病早期多數(shù)僅累及一種細(xì)胞，因此，如果能夠獲得某種純化的細(xì)胞，且在視網(wǎng)膜疾病的發(fā)病早期將純化的細(xì)胞移植到體內(nèi)，則可以從兩個(gè)方面對(duì)患者的視覺(jué)功能進(jìn)行改善：首先，移植的純化細(xì)胞可以改善患者局部的微環(huán)境，從而有利于患者自身殘存細(xì)胞的生存；其次，移植的純化細(xì)胞可以部分替代受損細(xì)胞，從而改善患者的視覺(jué)功能。細(xì)胞替代療法治療神經(jīng)元退行性疾病首要解決的問(wèn)題是細(xì)胞純度的問(wèn)題。其原因顯而易見(jiàn)，首先，將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在體外進(jìn)行藥物篩選或功能鑒定時(shí)，混 雜的其它細(xì)胞將會(huì)影響結(jié)果的可靠性；其次，如果將混雜的細(xì)胞移植到模型動(dòng)物體內(nèi)，將會(huì)產(chǎn)生異常增生甚至致瘤的風(fēng)險(xiǎn)。雖然目前已經(jīng)有很多研究致力于提高節(jié)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化率，例如：將math5轉(zhuǎn)染到干細(xì)胞，然后通過(guò)facs篩選來(lái)獲得純化的節(jié)細(xì)胞，然而，這些方法存在致命缺陷，即：將報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到干細(xì)胞內(nèi)會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞基因組的改變，從而限制了其臨床應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性表面蛋白的篩選方法，從而找到感光細(xì)胞特異性表面蛋白，用于人胚胎干細(xì)胞/人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的純化，從而加快臨床利用細(xì)胞移植替代療法治療人類(lèi)視網(wǎng)膜相關(guān)疾病(如青光眼、黃斑性眼病等)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性表面蛋白的篩選方法，包括如下步驟：(1)利用talen技術(shù)，建立crx-gfp的人胚胎干細(xì)胞系，將這種crx-gfp的人胚胎干細(xì)胞系誘導(dǎo)分化至第6周，將誘導(dǎo)分化至第6周的視網(wǎng)膜細(xì)胞球在含有ⅱ型膠原酶的hanks溶液中消化過(guò)夜，得到細(xì)胞懸液；(2)第二天，在細(xì)胞懸液中加入等體積的含有ⅱ型膠原酶、?；撬?、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的hanks溶液進(jìn)一步消化，獲得單細(xì)胞；(3)應(yīng)用bd公司的表面蛋白篩選試劑盒對(duì)消化的單細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出感光細(xì)胞特異性表面蛋白。如果細(xì)胞球過(guò)硬，不容易消化，為了充分分散細(xì)胞球，將步驟(2)得到的單細(xì)胞用0.25％胰酶/edta進(jìn)一步消化，然后進(jìn)行步驟(3)的操作。步驟(1)中，hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml。步驟(1)中，所述消化是在25℃的條件下進(jìn)行消化。步驟(2)中，hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml、牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為1mg/ml，?；撬岬奈镔|(zhì)的量濃度為10mm/ml、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的物質(zhì)的量濃度為0.1mm/ml。所述步驟(3)中具體篩選方法如下：a、對(duì)單細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行染色，然后用lsrii流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，單細(xì)胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的pbs溶液中進(jìn)行；b、選用bd公司的facsariatmii細(xì)胞分選儀對(duì) 106/ml的單細(xì)胞進(jìn)行分選，分選過(guò)程中單細(xì)胞重懸液為含有6％胎牛血清的pbs溶液；c、選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行磁珠分選、分選出cd抗體，選用bd公司針對(duì)lsrii的高通量樣品分析對(duì)于cd抗體的高通量細(xì)胞流式分析；d、所得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用流式分析軟件treestar進(jìn)行分析，確定感光細(xì)胞特異性表面蛋白。利用本發(fā)明所述方法可以對(duì)純化的感光細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行篩選，篩選出一種感光細(xì)胞所特異的表面蛋白，其特異性表達(dá)在人胚胎干細(xì)胞以及人多能干細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞膜表面；從而利用該特異性表面蛋白對(duì)誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞或人多能干細(xì)胞來(lái)源的感光細(xì)胞進(jìn)行純化。通過(guò)表面蛋白篩選獲得的純化感光細(xì)胞，可以避免轉(zhuǎn)基因或者應(yīng)用多種小分子化合物為誘導(dǎo)劑所帶來(lái)的潛在危險(xiǎn)。這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題的解決，將加快干細(xì)胞向臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程，符合醫(yī)學(xué)研究的需要，為人類(lèi)視網(wǎng)膜相關(guān)疾病(如青光眼、黃斑性眼病等)的細(xì)胞替代治療奠定了基礎(chǔ)。具體實(shí)施方式本發(fā)明所述的“人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化”采用申請(qǐng)?zhí)枮?01210301765.x，名稱(chēng)為“一種誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞的方法”中提到的方法。本發(fā)明其他未提及部分均為現(xiàn)有技術(shù)。報(bào)告細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)：目前已有的報(bào)告細(xì)胞系構(gòu)建技術(shù)包括傳統(tǒng)的鋅指蛋白技術(shù)、talen技術(shù)和cas9技術(shù)，我們采用talen技術(shù)進(jìn)行報(bào)告細(xì)胞系的構(gòu)建。一種視網(wǎng)膜感光細(xì)胞特異性表面蛋白的篩選方法，包括如下步驟：(1)利用talen技術(shù)，建立crx-gfp的人胚胎干細(xì)胞系，將這種crx-gfp的人胚胎干細(xì)胞系誘導(dǎo)分化至第6周，將誘導(dǎo)分化至第6周的視網(wǎng)膜細(xì)胞球在含有ⅱ型膠原酶的hanks溶液中于25℃的條件下消化過(guò)夜，消化時(shí)在搖床輕搖，得到細(xì)胞懸液；hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml；(2)第二天，在細(xì)胞懸液中加入等體積的含有ⅱ型膠原酶、牛磺酸、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸、牛血清白蛋白的hanks溶液進(jìn)一步消化，輕輕吹打以分散細(xì)胞，細(xì)胞分散后，1000r/m離心5min，篩網(wǎng)過(guò)濾后備用；如果細(xì)胞球過(guò)硬，不容易消化，則需要用0.25％胰酶/edta進(jìn)一步消化，以充分分散細(xì)胞球，獲得單細(xì)胞；hanks溶液中ⅱ型膠原酶的質(zhì)量濃度為1mg/ml、牛血清白蛋白的質(zhì)量 濃度為1mg/ml，牛磺酸的物質(zhì)的量濃度為10mm/ml、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸的物質(zhì)的量濃度為0.1mm/ml；(3)應(yīng)用bd公司的表面蛋白篩選試劑盒對(duì)消化的單細(xì)胞進(jìn)行篩選，篩選出感光細(xì)胞特異性表面蛋白。步驟(3)中具體篩選方法如下：a、對(duì)單細(xì)胞表面蛋白進(jìn)行染色，然后用lsrii流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，單細(xì)胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％皂苷的pbs溶液中進(jìn)行；b、選用bd公司的facsariatmii細(xì)胞分選儀對(duì)106/ml的單細(xì)胞進(jìn)行分選，分選過(guò)程中單細(xì)胞重懸液為含有6％胎牛血清的pbs溶液；c、選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行磁珠分選、分選出cd抗體，選用bd公司針對(duì)lsrii的高通量樣品分析對(duì)于cd抗體的高通量細(xì)胞流式分析；d、所得到的數(shù)據(jù)應(yīng)用流式分析軟件treestar進(jìn)行分析，確定感光細(xì)胞特異性表面蛋白。人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化ⅰ.人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)：將人胚胎干細(xì)胞接種在鋪有0.65×105/mlmefs的六孔板內(nèi)；干細(xì)胞培液內(nèi)含：dmem/f12(1：1)、20％血清替代物、1mml-谷氨酰胺、1％非必須氨基酸(memnon－essentialaminoacids)、0.1mmβ-巰基乙醇、4ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)；每5至7天傳代一次，傳代時(shí)將形態(tài)上已明顯分化的細(xì)胞刮除。ⅱ.人胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)：dispase酶(1mg/ml)消化人多能干細(xì)胞約2min后，吸除dispase酶，用干細(xì)胞培液(1ml/孔)漂洗一次，再次加入干細(xì)胞培液，用吸管將干細(xì)胞克隆吹下成小片狀移入離心管中，800r/min離心1min后，用干細(xì)胞培液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞重懸液移入非粘附的培養(yǎng)皿中，用干細(xì)胞培液培養(yǎng)4天，隔天換液，得到細(xì)胞球。將細(xì)胞球移入神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(hnm)，hnm包含：dmem/f12，1％n2復(fù)合物，1％非必須氨基酸(memnon－essentialaminoacids)，2ug/ml肝素(heparin)，1％l-谷氨酰胺，2天后，將細(xì)胞球移入粘附性培養(yǎng)皿中，為了促使細(xì)胞球貼壁，可以在hnm中加入10％的胎牛血清(fbs)，12h后更換新鮮的不含fbs的hnm。幾天后，貼壁的細(xì)胞球會(huì)形成許多神經(jīng)管樣的結(jié)構(gòu)，大約在貼壁的第9天，將貼壁后形成的神經(jīng)管樣結(jié)構(gòu)吹下，移入視網(wǎng)膜誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(rdm),rdm包含：dmem/f12、15％血清替代物、1％l-谷氨酰胺、1％非必須氨基酸(neaa)、10mm煙酰胺(nicotinamide,nic)。將形成的 神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)，每2～3天換液。ⅲ.報(bào)告細(xì)胞系的建立：利用talen的同源重組技術(shù)，將編碼gfp的序列插入到h9人胚胎干細(xì)胞系的crx基因位點(diǎn)，從而建立報(bào)告細(xì)胞系。上述crx-gfp的人胚胎干細(xì)胞系中的crx可以根據(jù)不同的視網(wǎng)膜疾病(如青光眼、黃斑性眼病等)進(jìn)行確定，如：brn3、math5或者tuj-1等。以brn3報(bào)告細(xì)胞系的建立為例，利用talen的同源重組技術(shù)，將編碼gfp的序列插入到h9人胚胎干細(xì)胞系的brn3基因位點(diǎn)，從而建立報(bào)告細(xì)胞系。人胚胎以及成年人視網(wǎng)膜組織的收集研究用經(jīng)藥物流產(chǎn)的4周至12周人胚胎共18例(table2.2)。胎齡的計(jì)算是根據(jù)當(dāng)事人末次月經(jīng)的日期減去2周的時(shí)間，即受孕時(shí)作為第0天。成年人視網(wǎng)膜取自捐獻(xiàn)角膜后的眼球組織。人組織的獲取及相關(guān)研究經(jīng)相關(guān)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在捐贈(zèng)者簽署知情同意書(shū)的情況下進(jìn)行。細(xì)胞流式及細(xì)胞分選將誘導(dǎo)分化至第6周的視網(wǎng)膜細(xì)胞球在含有ⅱ型膠原酶(1mg/ml；worthington)的hanks溶液(nacl:136mm,nahco3:4.16mm,napo4:0.34mm,kcl:5.36mm,kh2po4:0.44mm,dextrose:5.55mm,hepes:5mm)中25℃消化過(guò)夜，消化時(shí)在搖床輕搖。第二天，在細(xì)胞懸液中加入等量的含有ⅱ型膠原酶(1mg/ml；worthington)、牛磺酸10mm、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸0.1mm、牛血清白蛋白1mg/ml的hanks溶液進(jìn)一步消化，輕輕吹打以分散細(xì)胞。細(xì)胞分散后，1000r/m離心5min，篩網(wǎng)過(guò)濾后備用。如果細(xì)胞球過(guò)硬，不容易消化，則需要用0.25％胰酶/edta進(jìn)一步消化，以充分分散細(xì)胞球，獲得單細(xì)胞。應(yīng)用bd公司的表面蛋白篩選試劑盒，對(duì)消化的單細(xì)胞進(jìn)行分析。單細(xì)胞表面蛋白的染色在含有10％胎牛血清和0.5％saponin(sigma)的pbs溶液中進(jìn)行，細(xì)胞染色后用lsrii流式細(xì)胞儀(bd公司)進(jìn)行分析。對(duì)于細(xì)胞分選，我們選用facsariatmii(bd公司)細(xì)胞分選儀(sickkids-uhnflowcytometryfacility)對(duì)106/ml的細(xì)胞進(jìn)行分選，細(xì)胞重懸液為含有6％胎牛血清的pbs溶液。為了防止細(xì)胞分選過(guò)程中由于壓力和剪切力所導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，我們選用100um的吹管進(jìn)行分選。另外，我們選用mitenyimacs磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行磁珠分選，分選出cd抗體；操作步驟和分選條件按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。對(duì)于cd抗體的高通量細(xì)胞流式 分析，我們選用bd公司針對(duì)lsrii的高通量樣品分析(high-throughputsampler,hts)進(jìn)行操作，操作步驟參照說(shuō)明書(shū)。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用流式分析軟件treestar進(jìn)行分析。免疫染色免疫熒光染色的步驟按照常規(guī)進(jìn)行，對(duì)于細(xì)胞球切片或組織切片，過(guò)程如下：取出-80℃冰箱內(nèi)保存的冰凍切片，室溫復(fù)溫30分鐘。0.01mpbs洗3次，每次10分鐘。含有0.25％tritonx-100和10％驢血清的0.01mpbs孵育1小時(shí)。加一抗，濕盒內(nèi)4℃冰箱孵育過(guò)夜。0.01mpbs洗3次，每次10分鐘。加二抗，避光室溫孵育1小時(shí)。0.01mpbs洗3次，每次10分鐘。用抗熒光淬滅的封片液進(jìn)行封片，避光晾干后，于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。對(duì)于細(xì)胞爬片，所不同的是前面的固定過(guò)程，即：4％多聚甲醛固定30min,0.01mpbs洗3次，每次10分鐘，-20℃甲醇固定10min,0.01mpbs洗3次，每次10分鐘，后續(xù)封閉以及抗體孵育的步驟同前。如果染色的是細(xì)胞膜抗原，則封閉時(shí)不加tritonx-100。rt-qpcr用rna提取試劑盒(ambion)進(jìn)行細(xì)胞rna的抽提。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)對(duì)50ng～1ug的rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qpcr使用quantifastsybrgreenpcr試劑盒(qiagen)。表達(dá)量以管家基因tata盒子(tbp)為標(biāo)準(zhǔn)參照，除此之外，基因組dna作為dna的參考標(biāo)準(zhǔn)?；蚪Mdna的靶基因拷貝數(shù)按照如下計(jì)算方式：人基因組大小2.7×109bp，對(duì)應(yīng)于6.022×1023個(gè)單基因拷貝，1ug的基因組dna對(duì)應(yīng)于3.4×105個(gè)單基因拷貝。rt-qpcr圖的y軸代表被tbp拷貝數(shù)分隔開(kāi)的目的基因的拷貝數(shù)，因此是一個(gè)隨機(jī)的獨(dú)立單位，可用于不同實(shí)驗(yàn)組之間的對(duì)比。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12