施例2
[0029] Transwell小室侵襲試驗(yàn)法檢測(cè)聯(lián)氨基姜黃素對(duì)細(xì)胞侵襲能力影響。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期細(xì)胞分為W下四組：陰性對(duì)照組(0.1%DMS0);聯(lián)氨基姜黃素扣mol/L處理組;聯(lián)氨基姜黃 素10皿ol/L處理組;聯(lián)氨基姜黃素15皿ol/L處理組。
[0030] 結(jié)果如附圖1所示，對(duì)照組及5、10、15皿ol/L聯(lián)氨基姜黃素處理組穿膜細(xì)胞數(shù)分別 是（462.33±36.71)/視野，（310.33±37.66)/視野，（189.10±17.06)/視野和（126.33± 8.62)/視野。與對(duì)照組相比，穿膜細(xì)胞數(shù)隨著聯(lián)氨基姜黃素藥物濃度的增加而逐漸減少，W 15皿ol/L組實(shí)驗(yàn)效果最明顯，實(shí)驗(yàn)各組之間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)均有意義(F = 85.67，P<0.05)。
[0031] 實(shí)施例3
[0032] 粘附試驗(yàn)法檢測(cè)聯(lián)氨基姜黃素對(duì)細(xì)胞粘附能力影響。按W上分類(lèi)的四組進(jìn)行預(yù)處 理細(xì)胞2地。配制終濃度為lOiig/ml的纖維連接蛋白溶液，包被96孔細(xì)胞W每孔50iil于培養(yǎng) 板，密封后4°C 12h; PBS洗涂5次，加入含1 % BSA的無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基，50山/孔，37°C 封閉化;經(jīng)0.25 %膜酶消化細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整至2 X IO4個(gè)/孔，接種96孔板中，每組設(shè)3個(gè) 復(fù)孔，解育1.化;PBS洗涂5次，加入2mg/ml MTT，5化1/孔，解育化；棄去MTT，加入DMSO每孔 15化1，振蕩15min，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值，并按W下公式計(jì)算粘附細(xì)胞量：
[0033] 粘附細(xì)胞量=實(shí)驗(yàn)組A490-陰性對(duì)照組A490
[0034] 對(duì)照組及5、10、1扣mol/L聯(lián)氨基姜黃素處理組的細(xì)胞粘附量分別是（1.355± 0.094) ,(0.876±0.022)，（0.478±0.031)和(0.303±0.026)。與對(duì)照組相比，細(xì)胞粘附能 力隨著聯(lián)氨基姜黃素藥物濃度的增加而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，15WI101/L處理組作用效果最 明顯，各實(shí)驗(yàn)組之間差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有意義(F = 378.72，P<0.01)。
[0035] 實(shí)施例4
[0036] Western blot法檢測(cè)聯(lián)氨基姜黃素對(duì)細(xì)胞STAT3、P-STAT3蛋白表達(dá)影響。將A431 細(xì)胞按1 X IO4個(gè)/cm2接種到培養(yǎng)瓶中，貼壁后按下列四組加入相應(yīng)的藥物：陰性對(duì)照組 (0.1%DMS0)，聯(lián)氨基姜黃素（5、10、15皿〇1凡)處理組。培養(yǎng)2地后提取各組細(xì)胞總蛋白，經(jīng) 10 % SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5 %脫脂牛奶室溫封閉化，封閉后用TBST洗5次， 每次5min，敷一抗后4°C 12h，后TBST洗5次，每次IOmin，敷二抗，室溫?fù)u床振蕩化，TBST洗5 次，每次IOmiriDE化成像系統(tǒng)成像，拍照。
[0037]結(jié)果如圖2、圖4所示:P-STAT3表達(dá)隨著聯(lián)氨基姜黃素濃度的增加，抑制作用逐漸 增強(qiáng)，且與劑量呈高度相關(guān)性，其中15WH01/L組效果最明顯，各實(shí)驗(yàn)組之間差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 均有意義(F= 116.67，P<0.05)，而總STAT3蛋白水平差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)意義。結(jié)合圖3，聯(lián)氨 基姜黃素對(duì)P-STAT3表達(dá)的抑制作用要強(qiáng)于姜黃素。
[003引實(shí)施例5
[0039] RT-PCR法檢測(cè)聯(lián)氨基姜黃素對(duì)細(xì)胞中STAT3基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。將A431細(xì) 胞按2X IO5個(gè)/cm2接種至6孔板中，貼壁后，按下列四組加入相應(yīng)的藥物：陰性對(duì)照組(0.1% DMSO);聯(lián)氨基姜黃素化mol/L處理組；聯(lián)氨基姜黃素lOwiiol/L處理組；聯(lián)氨基姜黃素15ii mol/L處理組。培養(yǎng)24h后，提取各細(xì)胞總RNA并進(jìn)行測(cè)定，再取IOiig總RNA，用ReverTra Ace-a-RT-PCR kit將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總體系20iU，99°C5min，4°C5min，cDNA引物于-20°C保存 備用。引物序列見(jiàn)表2,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。We-action基因?yàn)閮?nèi) 參物。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，退火30s(STAT355°C)，72°C延伸2min，進(jìn) 行26個(gè)循環(huán);72°C再延伸IOmin，2 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物，成像系統(tǒng)采集圖像并進(jìn) 行分析。
[0040] 表2 RT-PCR引物序列
[0042] 結(jié)果如圖5所示:聯(lián)氨基姜黃素對(duì)STAT3基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用隨著藥物濃 度的增加而增強(qiáng)，與聯(lián)氨基姜黃素劑量呈高度相關(guān)性，5、10、15wiiol/L聯(lián)氨基姜黃素處理組 細(xì)胞中 STAT3 基因 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分別為（0.514 ±0.175) ,(0.278 ±0.058)，（0.045 ± 0.003)。與對(duì)照組(0.780 ±0.135)比較，轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，W15WH01/L實(shí)驗(yàn)組效果最明顯 (* = 9.466，？<0.01)，各實(shí)驗(yàn)組間的差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有意義巧=24.132，？<0.05)。
[0043] 綜上，聯(lián)氨基姜黃素濃度> 15WHO1/L，作用時(shí)間> 2地時(shí)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈時(shí) 間和劑量依懶性(p<0.001)，當(dāng)聯(lián)氨基姜黃素濃度^ 15WI101/，作用時(shí)間為24h時(shí)，對(duì)細(xì)胞無(wú) 明顯毒性作用，細(xì)胞存活率>85%。細(xì)胞侵襲能力和粘附能力隨著聯(lián)氨基姜黃素濃度的增 加而逐漸降低，W15皿ol/L聯(lián)氨基姜黃素濃度處理效果最明顯(P<0.05)。聯(lián)氨基姜黃素可 明顯抑制STAT3基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，其抑制作用與劑量呈高度依懶性(P<0.05)。聯(lián)氨基姜 黃素通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路的活化及此信號(hào)通路祀基因STAT3的表達(dá)來(lái)降低人皮膚鱗狀 細(xì)胞癌A431細(xì)胞的侵襲性。
[0044] 本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容上所作的 任何修改、等同替換和簡(jiǎn)單改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，質(zhì)量濃度大于15ymol/L的聯(lián)氨基姜黃素能 明顯抑制人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的生長(zhǎng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，聯(lián)氨基姜黃素通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路及 STAT3基因表達(dá)來(lái)降低人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的侵襲性。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種聯(lián)氨基姜黃素的新用途，聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次提出了聯(lián)氨基姜黃素在制備抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌藥物中的應(yīng)用。聯(lián)氨基姜黃素通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路的活化及該信號(hào)通路靶基因STAT3的表達(dá)來(lái)降低皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的侵襲性。聯(lián)氨基姜黃素易溶于水，生物利用度高，能替代姜黃素在臨床上廣泛地應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】A61P35/00, A61P17/00, A61K31/415
【公開(kāi)號(hào)】CN105497025
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510897781
【發(fā)明人】吳健, 姜雪秋, 張金蓉
【申請(qǐng)人】吳健
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月8日