倍半萜類化合物在制備抗哮喘疾病藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及中藥旋覆花的提取物中分離得到的 倍半祗內(nèi)醋類化合物OOABL在制備抗哮喘疾病藥物中的新應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 支氣管哮喘（簡稱哮喘)是由嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞及白細(xì)胞等多種細(xì)胞及 細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥，在慢性炎癥基礎(chǔ)上伴隨氣道的高反應(yīng)性（airway hyperresponsiveness，A皿）和氣道重建（airway remodelling)，其本質(zhì)是氣道慢性炎癥。 哮喘是世界公認(rèn)的醫(yī)學(xué)難題，被世界衛(wèi)生組織列為疾病中四大頑癥之一。近十多年來，世界 上許多國家和地區(qū)哮喘的發(fā)病率和病死率均呈增高趨勢，運(yùn)一現(xiàn)象已引起世界衛(wèi)生組織 (WHO)和各國政府的重視。
[0003] 哮喘W可恢復(fù)的支氣管阻塞、炎性細(xì)胞浸潤和氣道高反應(yīng)性為其特征。哮喘設(shè)及 嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和T淋己細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子的相互作用，呈 現(xiàn)一種慢性氣道炎癥過程和氣道高反應(yīng)，從而引起可逆性氣道阻塞，即遲發(fā)性哮喘反應(yīng)。有 報(bào)道指出，哮喘病人氣道中肥大細(xì)胞數(shù)量增加，哮喘發(fā)作病人氣道肥大細(xì)胞的活動(dòng)性增強(qiáng)， 氣道活檢標(biāo)本中顯示肥大細(xì)胞脫顆粒，支氣管肺泡灌洗液中肥大細(xì)胞的產(chǎn)物增加。
[0004] 旋覆花為菊科植物旋覆花屬旋覆花Inula japonica I'hunb.或Inula britannica 的干燥頭狀花序，屬多年生草本植物。旋覆花作為我國傳統(tǒng)中草藥廣泛分布在中國，日本和 韓國等亞洲國家。旋覆花的干燥根和樹葉作為我國民間中醫(yī)藥來治療創(chuàng)傷，巧病和咳嗽。其 花多半用在抗炎、化疲、助消化、消腫和驅(qū)蟲等。2010版藥典記載:旋覆花味辛苦咸溫，歸肺 脾胃大腸經(jīng)，具降氣、消疲、行水、止嘔之功能，主治風(fēng)寒咳嗽、疲飲蓄結(jié)、胸隔瘡悶、喘咳疲 多、嘔吐噫氣、屯、下瘡硬?，F(xiàn)代藥理學(xué)及臨床研究表明旋覆花有抗炎、抗哮喘、抗糖尿病、低 脂血癥、抗腫瘤、抗菌、防霉、保肝和抗肝炎等作用。
[0005] 文獻(xiàn)報(bào)道倍半祗類化合物作為旋覆花植物中最主要的一類化學(xué)成分起到關(guān)鍵性 的作用。很多研究組針對(duì)從旋覆花中分離提取的倍半祗內(nèi)醋（sesquiterpene lactones)及 其生物活性開展了大量研究，如殺菌、保肝和抗腫瘤作用等。最近幾個(gè)研究組分離提取出了 二祗（diterpenoid)和二聚倍半祗締內(nèi)醋（dimeric sesquite;rpene lactones)且對(duì)它們的 抗炎，抗腫瘤等生物學(xué)活性做了初步研究。倍半祗內(nèi)醋化合物化patol ide，Bigelovin，1，6-0,0-di曰cetylbrit曰nnil曰Ctones(OOABL) ,Ergolide, 1-0-曰cetylbrit曰nnil曰tone等均具有 抗炎和抗癌作用。
[0006] 本發(fā)明設(shè)及倍半祗類化合物OOABL在肥大細(xì)胞中阻斷白=締的合成和脫顆粒的抗 炎作用的機(jī)制和在哮喘動(dòng)物模型中有效緩解氣道阻塞等抗哮喘方面的作用和功效，尚未見 相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明創(chuàng)造公開一種倍半祗類化合物在制備抗哮喘疾病藥物中的應(yīng)用，所述倍半 祗類化合物的化學(xué)式為：
[0009] 進(jìn)一步，所述倍半祗類化合物提取自旋覆花。
[0010] 進(jìn)一步，倍半祗類化合物的提取方法如下：
[0011] 取中藥旋覆花干燥頭狀花序分別按下述步驟進(jìn)行處理：用藥材重量6-10倍體積的 乙醇回流提取，減壓濃縮得乙醇浸膏;將乙醇浸膏W水混懸，依次用石油酸、乙酸乙醋、正下 醇萃取，分別得到石油酸提取物、乙酸乙醋提取物、正下醇提取物;上述乙酸乙醋提取物，W 硅膠柱色譜分離，分別用石油酸-乙酸乙醋，乙酸乙醋，乙酸乙醋-甲醇梯度洗脫，TLC合并類 似組分，得到的組分經(jīng)制備凝膠滲透色譜GPC、凝膠(Toyopearl HW-40)柱、半制備HPLC純化 得到倍半祗內(nèi)醋類化合物。
[0012] 進(jìn)一步，所述抗哮喘疾病藥物的有效成分為倍半祗內(nèi)醋類化合物，還含有藥學(xué)上 可接受的載體。
[0013] 本發(fā)明通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證旋覆花倍半祗內(nèi)醋類化合物(OOABL)對(duì)哮喘類疾 病具有抑制作用。
[0014] 體外驗(yàn)證過程如下：
[0015] 本發(fā)明W骨髓來源的肥大細(xì)胞為體外模型之一，研究探針OOA化對(duì)肥大細(xì)胞(bone marrow-derived mast cells,BMMCs)脫顆粒和白S締C4(le址Otriene C4,LTC4)的影響。結(jié) 果證實(shí)了 OOA化對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒具有明顯抑制作用，該抑制作用是通過抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)化h 濃度和脫顆粒信息憐脂酶C 丫（phospholipase C 丫，PLC 丫）的憐酸化而實(shí)現(xiàn);并且OOA化能 顯著降低白S締的產(chǎn)生，該過程是通過抑制胞質(zhì)憐脂酶A2(c^oso1 ic phospholipase A2， cPLA2)的憐酸化而實(shí)現(xiàn)，但該過程并不抑制分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPKs)[包括extracellular regulated kinases(ERKl/2)、c-jun N-terminal kinases(JNK)和p38MAP kinases]的憐酸化。
[0016] 另外，本發(fā)明W人肺癌上皮細(xì)胞A549為另一體外模型之一，研究探針OOA化對(duì) Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子（Janus protein tyrosin kinases/signal transducers and activators of 1:ransc;ription,JAK/STAT)通路的影響。結(jié)果證實(shí)探針 OOA化濃度依存性地抑制了 STAT6的憐酸化，而且OOA化能顯著抑制Eo化xin-1和ALOX-15的 mRNA表達(dá)。
[0017] 體內(nèi)驗(yàn)證過程如下；
[001引本發(fā)明WOVA誘導(dǎo)小鼠哮喘模型，研究OOA化對(duì)小鼠呼吸道反應(yīng)性和血清中I姐的 含量。結(jié)果表明OOAMJ良有效緩解乙酷甲膽堿(Mch)激發(fā)的氣道阻塞，并且明顯減少了血清 中I巧的含量。
[0019]需要說明的是，肥大細(xì)胞是重要的效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，它在哮喘疾病的發(fā)病 機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用。當(dāng)抗原與I巧的交聯(lián)反應(yīng)激活肥大細(xì)胞后，肥大細(xì)胞通過脫顆 粒作用釋放出自身含有的多種炎癥因子，包括組胺、蛋白酶、蛋白多糖等，同時(shí)釋放合成的 炎癥因子，如白^締〔4化^4)、前列腺素化。6〇2)等。白^締和組胺是哮喘發(fā)作中的重要炎 癥介質(zhì)，可引起支氣管狹窄、粘液分泌增多、增加血管通透性，而且參與氣道重塑。化1/化2 細(xì)胞平衡失調(diào)是哮喘發(fā)病的重要基礎(chǔ)。STAT6對(duì)化2細(xì)胞分化起著關(guān)鍵性的作用。有報(bào)道指 出STAT6基因敲除小鼠的化細(xì)胞不能分化為化2細(xì)胞，而且B細(xì)胞不能產(chǎn)生IgEeEotaxin屬于 嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子，其主要可吸引嗜酸粒細(xì)胞在肺內(nèi)的募集，促進(jìn)其粘附在血管內(nèi)皮 細(xì)胞上，進(jìn)而導(dǎo)致組織損傷。有研究報(bào)道AL0X15有助于哮喘的發(fā)病機(jī)制，并且上皮細(xì)胞過表 達(dá)AL0X15與疾病的嚴(yán)重度相關(guān)聯(lián)。STAT6作為轉(zhuǎn)錄因子對(duì)Eotaxin和AL0X15的mRNA表達(dá)具有 增強(qiáng)作用。
【附圖說明】
[0020] 圖1是OOABL對(duì)肥大細(xì)胞毒性的影響圖；
[0021] 圖2是OOA化對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的影響圖；其中，0-肥X: ^-Hexosaminidase化-己糖 胺酶），e-HEX的釋放間接地表示BMMCs脫顆粒，它是BMMCs脫顆粒的一個(gè)指標(biāo)；
[0022] 圖3是OOAMJ削E大細(xì)胞脫內(nèi)巧離子濃度的影像圖；
[0023] 圖4是OOAMJfPLC 丫憐酸化的影響圖；其中，PLC:憐脂酶C;
[0024] 圖5是OOA化對(duì)白S締產(chǎn)生的影響圖；其中，LTC4:leukotriene C4(白S締C4);
[002引圖6是OOABL對(duì)CPLA2憐酸化的的影響圖；其中CPLA2:胞質(zhì)憐脂酶A2;
[0026] 圖7是OOA化對(duì)MAPKs憐酸化的影響圖；其中，PD98059:E服抑制劑;SP600125: JNK抑 制劑;SB203580 :p38抑制劑；
[0027] 圖8是OOABL對(duì)A549細(xì)胞毒性的影響圖；
[002引 圖9是在A549細(xì)胞中OOA化對(duì)Eotaxin-I mRNA的表達(dá)的影響圖；其中Eo化Xin-I:趨 化因子;比-4:白細(xì)胞介素-4;
[0029] 圖 10是OOA化對(duì)AL0X15 mRNA的表達(dá)的影響圖；其中AL0X15:arachidonate 15-Iipoxygenase;
[0030] 圖11是OOA化對(duì)STAT6憐酸化的影響圖；其中，AS1517499:STAT6抑制劑；
[0031 ] 圖12是OOABL對(duì)JAK3憐酸化的影響圖；
[0032] 圖13是OOA化對(duì)STAT6活性的影響圖；
[0033] 圖14是在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘動(dòng)物模型中OOA化對(duì)乙酷甲膽堿激發(fā)的氣道高反應(yīng) 性的的影響圖；其中，NC:正常組;PC:哮喘模型組;Mont:孟魯司特;Dex:地塞米松;Mch:乙酷 甲膽堿；
[0034] 圖15是OOAMJf血清中I巧的水平的影響圖。
[0035] W上圖中#均代表致敏組(體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中DNP-HSA，IL-4刺激組和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中OVA 致敏組）與無刺激無致敏組比較；*均代表用藥組（包括OOA化和PD98059、SP600125、 88203580、451517499、]?〇111、06義等各種陽性對(duì)照藥）與致敏組比較;#?<0.05，#胖<0.01，### P<0.OOl;沖<0.05，*沖<0.Ol，**沖<0.OOl。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造進(jìn)行進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常 按照常規(guī)條件，或本領(lǐng)域技術(shù)人員在知識(shí)范圍內(nèi)能夠推知的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。下述實(shí)施例中設(shè)及的試劑和儀器用具，通常為商用可市購產(chǎn)品，或能夠通過其他公 開途徑獲得的產(chǎn)品。
[0037] 實(shí)施例1分子細(xì)胞水平研究OOA化在BMMCs、人肺癌A549中抗哮喘多重作用機(jī)制
[0038] 1.實(shí)驗(yàn)方法
[0039] 1.1.制備BMMCs
[0040] 從無特異病原體影響的6周雄性Balb/C小鼠的大腿部采取骨髓干細(xì)胞，將細(xì)胞懸 浮于RPMI1640培養(yǎng)基(包括lOOU/ml青霉素，100g/ml鏈霉素和10%胎牛血清)和化-3(20% 商路促分裂原刺激的脾臟細(xì)胞條件培養(yǎng)基，pokeweed mitogen-stimulated spleen condition medium,PWM-SCM)存在的條件下培養(yǎng)3周W上，得到成熟的BMMCs。此方法已確定 >98 %的細(xì)胞是BMMCs。
[0041 ] 1.2 制備PWM-SCM
[0042]從無特異病原體影響的6周雄性Ba化/C小鼠取出脾臟，將脾臟研磨成細(xì)胞懸液，過 200目不誘鋼篩，調(diào)整細(xì)胞濃度為2X106cells/ml的脾細(xì)胞懸液，使用RPMI1640培養(yǎng)基(包 括lOOU/ml青霉素，lOOg/ml鏈霉素，10%胎牛血清和2.扣g/ml的P歷和4祉M的2-琉基乙醇） 培養(yǎng)5天。5天后取上清液，用于比-3(白細(xì)胞介素3)的來源。
[00創(chuàng) 1.2檢測指標(biāo)
[0044] 1.2.1檢測OOA化對(duì)BMMCs和A549細(xì)胞毒性的影響
[0045] 將BMMCs或A549細(xì)胞鋪于96孔板，處理OOA化解育化或2地，解育后加入CcHTitcr%"' Aqueous 單溶液試劑包含一種四挫化合物[3-(4,5-di me thy Ithiazo 1-2-yl )-5