本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地講，涉及二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肺癌為臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，在所有惡性腫瘤中女性的肺癌發(fā)病率和死亡率均占第二位，男性發(fā)病率和死亡率占第一位。我國(guó)是世界第一肺癌大國(guó)，采取積極措施防治肺癌成為我國(guó)目前研究重點(diǎn)。雖然肺癌的治療方法在在持續(xù)改進(jìn)，但患者預(yù)后仍然很差，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，自診斷之日起肺癌的5年生存率只有16％。目前，肺癌治療的主要手段有早期手術(shù)治療、放療和化療。但由于肺癌在早期缺乏典型臨床癥狀，約70％-80％的患者在確診肺癌時(shí)已是晚期，會(huì)錯(cuò)失手術(shù)機(jī)會(huì)，而可以進(jìn)行手術(shù)的有僅20％-30％，且高達(dá)50％以上的患者會(huì)有術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。故大部分患者，特別是晚期肺癌患者，仍需采用以化療為主的綜合治療，但多數(shù)晚期病人卻面臨復(fù)發(fā)和耐藥的問(wèn)題。因此開(kāi)發(fā)新的化療藥物對(duì)于肺癌的治療有重要意義。而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是化療藥物抗腫瘤治療的一個(gè)關(guān)鍵因素，已成為國(guó)際腫瘤研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物屬于聯(lián)烯類(lèi)化合物的范疇,聯(lián)烯類(lèi)化合物含有1,2-丙二烯結(jié)構(gòu)，官能團(tuán)化的聯(lián)烯通常顯示廣泛的抗菌、細(xì)胞毒和酶抑制活性，而本研究的二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物就是官能團(tuán)化的聯(lián)烯化合物。早期的聯(lián)烯化合物多從天然產(chǎn)物里提取，到目前為止，人們已經(jīng)成功分離得到150多種含有聯(lián)烯結(jié)構(gòu)的天然產(chǎn)物分子，其中大多數(shù)顯示出良好的生物活性。海洋生物是提取聯(lián)烯化合物的重要來(lái)源，1996年，國(guó)內(nèi)的林永成教授率先對(duì)南海的海洋植物“紅樹(shù)林”內(nèi)生真菌xylariasp的代謝產(chǎn)物開(kāi)展了研究，從中分離出包括聯(lián)烯在內(nèi)的新化合物五十多種，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其中有些聯(lián)烯化合物有著極好的生理活性。但由于通過(guò)分離方法所得的聯(lián)烯化合物的量比較少,難以進(jìn)行大規(guī)模活性測(cè)試和藥理研究，故參考天然聯(lián)烯化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行人工合成是研究該類(lèi)化合物的重要方向。本研究使用的(1-苯基-1,2-丙二烯-1-基)二苯基氧膦是通過(guò)合成得到的新型化合物,其制備方法參考:haoguo,rongqian,yinlongguo,andshengmingma.neighboringgroupparticipationofphosphineoxidefunctionalityinthehighlyregio-andstereoselectiveiodohydroxylationof1,2-allenylicdiphenylphosphineoxides.j.org.chem.2008,73(20),7934-7938。2016年在《oncotarget》雜志已有文獻(xiàn)報(bào)道此化合物可以抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并可增強(qiáng)順鉑的化療效果，通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡。但通過(guò)中英文數(shù)據(jù)庫(kù)檢索均未發(fā)現(xiàn)該化合物在肺癌方面的研究和應(yīng)用，尚處于空白狀態(tài)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的lc3a/b蛋白表達(dá)增高藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第一個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備治療肺癌藥物中的應(yīng)用。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述肺癌為肺腺癌和肺鱗癌。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物在制備誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬因子lc3a/b蛋白表達(dá)增高藥物中的應(yīng)用，所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述腫瘤是指肺腺癌和肺鱗癌。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第三個(gè)目的，本發(fā)明公開(kāi)以下技術(shù)方案：二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述腫瘤是指肺腺癌和肺鱗癌。

作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述抗腫瘤藥物是指鉑類(lèi)、靶向藥物和紫杉醇類(lèi)。

本發(fā)明所述二苯基聯(lián)烯基氧膦化合物可采用本領(lǐng)域此類(lèi)化合物常規(guī)制備方法制得?；衔?imgfile="bda0001303334750000032.gif"wi="347"he="159"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>的命名為：(1-苯基-1,2-丙二烯-1-基)二苯基氧膦，簡(jiǎn)稱(chēng)phpo，上述化合物制備方法具體可參見(jiàn)haoguo,rongqian,yinlongguo,andshengmingma.neighboringgroupparticipationofphosphineoxidefunctionalityinthehighlyregio-andstereoselectiveiodohydroxylationof1,2-allenylicdiphenylphosphineoxides.j.org.chem.2008,73(20),7934-7938。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本化合物能夠很好地抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，機(jī)制涉及通過(guò)促進(jìn)自噬和激活mapk通路促進(jìn)其凋亡，無(wú)毒副作用。

附圖說(shuō)明

圖1為不同濃度的化合物phpo在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺癌a549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的抑制率圖。

圖2為不同濃度的化合物phpo在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺癌ncl-h520細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的抑制率圖

圖3為不同濃度的為化合物phpo影響肺癌a549細(xì)胞凋亡的流式分析圖。

圖4為不同濃度的為化合物phpo影響肺癌ncl-h520細(xì)胞凋亡的流式分析圖。

圖5為phpo對(duì)肺癌a549細(xì)胞自噬因子lc3a/b影響的免疫熒光圖。

圖6為phpo對(duì)肺癌ncl-h520細(xì)胞自噬因子lc3a/b影響的免疫熒光圖。

圖7phpo對(duì)肺癌a549細(xì)胞和ncl-h520細(xì)胞自噬因子lc3a/b影響的蛋白印跡圖。

圖8為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組影響肺癌a549細(xì)胞凋亡的流式分析圖。

圖9為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組影響肺癌ncl-h520細(xì)胞凋亡的流式分析圖。

圖10為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組抑制肺癌a549細(xì)胞增殖的柱狀比較圖。

圖11為phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組影響抑制肺癌ncl-h520細(xì)胞增殖的柱狀比較圖。

圖12為phpo誘導(dǎo)肺癌a549細(xì)胞和肺癌ncl-h520細(xì)胞g1期阻滯的流式分析圖。

圖13為為phpo影響肺癌a549細(xì)胞和肺癌ncl-h520細(xì)胞遷移的顯微鏡圖。

圖14為phpo和對(duì)照組影響肺癌a549細(xì)胞遷移的柱狀比較圖。

圖15為phpo和對(duì)照組影響肺癌ncl-h520細(xì)胞細(xì)胞遷移的柱狀比較圖。

圖16為抑制腫瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)中，對(duì)照組和phpo組治療后，人肺癌a549裸鼠移植瘤模型的腫瘤體積隨治療時(shí)間的變化圖。

圖17為抑制腫瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)中，對(duì)照組和phpo組治療后，人肺癌ncl-h520裸鼠移植瘤模型的腫瘤體積隨治療時(shí)間的變化圖。

圖18為抑制皮下腫瘤a549和ncl-h520生長(zhǎng)試驗(yàn)中，對(duì)照組、phpo組治療后各組小鼠體內(nèi)腫瘤體積大小比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

1.材料和方法

1.1、藥物：[(1-苯基-1,2-丙二烯-1-基)二苯基氧膦，簡(jiǎn)稱(chēng)phpo]，制備方法具體可參見(jiàn)haoguo,rongqian,yinlongguo,andshengmingma.neighboringgroupparticipationofphosphineoxidefunctionalityinthehighlyregio-andstereoselectiveiodohydroxylationof1,2-allenylicdiphenylphosphineoxides.j.org.chem.2008,73(20),7934-7938。

1.2、細(xì)胞系：人肺腺癌細(xì)胞系a549(貨號(hào)為htb-77)和人肺鱗癌細(xì)胞系ncl-h520(貨號(hào)為htb-182)購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(atcc)；細(xì)胞系培養(yǎng)基為rpmi1640，含青霉素100u/ml和鏈霉素100μg/ml，10％的胎牛血清(gibco產(chǎn)品，10099141)，培養(yǎng)條件為37℃,5％co2,thermo細(xì)胞培養(yǎng)箱。參考文獻(xiàn)：1.songl,lid,guy,wenzm,jiej,zhaod,penglp.microrna-126targetingpik3r2inhibitsnsclsa549cellproliferation,migration,andinvasionbyregulationofpten/pi3k/aktpathway.clinicallungcancer.2016sep；15(5):e65-e75.2.liuc,huangx,hous,etal.silencingoftripartitemotif(trim)29inhibitsproliferationandinvasionandincreaseschemosensitivitytocisplatininhumanlungsquamouscancernci-h520cells.[j].thoraciccancer,2014,6(1):31-7。

1.3、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞以不同藥物濃度，不同作用時(shí)間下測(cè)定細(xì)胞的半數(shù)致死量。

1.4、細(xì)胞凋亡分析：細(xì)胞用藥物處理后，用凋亡染色試劑盒染色，然后用流式細(xì)胞技術(shù)分析。

1.5、細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞分別用phpo、phpo聯(lián)合自噬抑制劑氯喹處理后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的變化情況。

1.6、免疫印跡實(shí)驗(yàn)：蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞主要信號(hào)通路中相關(guān)主要蛋白的變化。

1.7、免疫熒光實(shí)驗(yàn):檢測(cè)細(xì)胞主要信號(hào)通路中相關(guān)主要蛋白的變化。

1.8、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用藥物處理后，染色后用流式細(xì)胞技術(shù)分析。

1.9、劃痕實(shí)驗(yàn)：在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的貼壁細(xì)胞層劃痕后加入含phpo的培養(yǎng)基的方式測(cè)定phpo對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響。

1.10、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：用小鼠移植瘤模型檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的效果。

1.11、統(tǒng)計(jì)分析：用卡方、t檢驗(yàn)等方法。

2.結(jié)果

2.1、phpo抑制細(xì)胞增殖

用肺癌細(xì)胞系a549和ncl-h520做cck-8實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)phpo的抗增殖作用。用不同濃度(見(jiàn)表1)的phpo處理24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，采用cck-8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果表明phpo以濃度依賴(lài)的方式成功抑制細(xì)胞的增殖。且隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，phpo對(duì)a549細(xì)胞的ic50的值也隨之下降。具體見(jiàn)圖1和圖2。圖1-2分別為不同濃度的化合物phpo在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)肺癌a549細(xì)胞和ncl-h520細(xì)胞和的生長(zhǎng)抑制作用的抑制率圖。phpo對(duì)兩種細(xì)胞系的ic50數(shù)值見(jiàn)表1

表1.phpo處理細(xì)胞不同時(shí)間測(cè)得半數(shù)致死量(ic50)

2.2、phpo誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

為了證實(shí)phpo對(duì)肺癌細(xì)胞的促凋亡作用，對(duì)a549和ncl-h520細(xì)胞用av/pi雙染后做流式分析。分別用dmso和phpo處理24小時(shí)后雙染檢測(cè)(處理48小時(shí)后，對(duì)照組和加藥組檢測(cè)顯示機(jī)械損傷的比例較高，所以改成處理24小時(shí)檢測(cè))。phpo組凋亡和壞死的總比例明顯高于對(duì)照組，其中對(duì)ncl-h520細(xì)胞的促凋亡作用更為明顯。結(jié)果表明phpo有促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用(p<0.05)，且作用強(qiáng)弱與劑量相關(guān)。具體見(jiàn)圖3和圖4。圖3-4為不同濃度的為化合物phpo影響肺癌a549和ncl-h520細(xì)胞凋亡的流式分析圖。

2.3、phpo可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬

分別用dmso和phpo處理24小時(shí)后，利用westernblot及免疫熒光檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白lc3a/b。結(jié)果顯示，phpo可以誘導(dǎo)a549細(xì)胞和ncl-h520的lc3a/b蛋白表達(dá)增高(p<0.05)，且呈劑量依賴(lài)，說(shuō)明phpo可以誘導(dǎo)a549和ncl-h520細(xì)胞的lc3a/b蛋白表達(dá)增高從而促進(jìn)發(fā)生自噬。具體見(jiàn)圖5-7。圖5-6為采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌a549細(xì)胞和ncl-h520的lc3a/b變化圖。圖7為采用免疫印跡法檢測(cè)肺癌a549細(xì)胞和ncl-h520的lc3a/b變化圖。

2.4、phpo通過(guò)自噬抑制肺癌細(xì)胞增殖

為了驗(yàn)證自噬在phpo抑制肺癌細(xì)胞增殖中的作用，分別用phpo(40μm)及自噬抑制劑氯喹(chloroquine，cq，5μm)處理a549細(xì)胞24小時(shí)，用phpo(25μm)及cq(5μm)處理ncl-h520細(xì)胞24小時(shí)。利用annexinv/pi及cck-8法檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)cq可以顯著抑制phpo誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減弱其抑制增殖的能力。具體見(jiàn)圖8-11。圖8-9為流式細(xì)胞儀檢測(cè)phpo對(duì)肺癌細(xì)胞自噬影響的分析圖，圖10-11為cck-8法檢測(cè)phpo組和phpo聯(lián)合氯喹組對(duì)肺癌a549和ncl-h520細(xì)胞增殖影響的柱狀比較圖。

2.5、phpo誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞g1期阻滯

為了證實(shí)phpo能誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞g1期阻滯，將a549細(xì)胞和ncl-h520細(xì)胞用rpmi1640完全培養(yǎng)液和phpo(分別為40μmol/l和25μmol/l)處理24h后，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞分別進(jìn)行收集，用冰凍乙醇固定細(xì)胞過(guò)夜后，離心5min棄上層乙醇，分別用pbs進(jìn)行重懸，用含0.1％tritonx-100和rnase的pbs混合液重懸細(xì)胞，加入pi避光孵育30分鐘，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12。結(jié)果表明phpo有誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞g1期阻滯的作用(p<0.05)。圖12為phpo誘導(dǎo)肺癌a549細(xì)胞和肺癌ncl-h520細(xì)胞g1期阻滯的流式分析圖。

2.6、phpo能抑制肺癌細(xì)胞的遷移

肺癌a549、ncl-h520的對(duì)照組以及藥物phpo組在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，在貼壁細(xì)胞層用10μl加樣槍頭豎向劃寬度均勻、一致的細(xì)胞傷口模型，然后分別將phpo加入含1％胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基(終濃度分別為35um和20um)，對(duì)組加入不含藥物的等體積培養(yǎng)液(含與藥物相同劑量的dmso)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h后，于光學(xué)顯微鏡下測(cè)算各劃痕的寬度。結(jié)果表明，phpo對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移有抑制作用(p<0.05)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖13-15。圖13為phpo影響肺癌a549細(xì)胞和肺癌ncl-h520細(xì)胞遷移顯微鏡圖。圖14-15為phpo影響肺癌a549細(xì)胞和肺癌ncl-h520細(xì)胞遷移的柱狀比較圖。

2.7phpo抑制體外肺癌腫瘤生長(zhǎng)

皮下接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量5百萬(wàn)，1-2周后腫瘤體積達(dá)到50mm³的時(shí)候開(kāi)始給藥，分別給dmso，phpo(30mg/kg)，腹腔注射，隔天給藥。每?jī)商煊糜螛?biāo)卡尺測(cè)量腫瘤直徑，腫瘤體積計(jì)算公式：腫瘤體積(mm³)＝0.5×長(zhǎng)徑(mm)×短徑²(mm³)。每?jī)商旆Q(chēng)量小鼠體重以評(píng)價(jià)phpo毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有裸鼠安樂(lè)死，并盡快剝除腫瘤測(cè)量。結(jié)果顯示，phpo可顯著抑制移植瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，且無(wú)明顯毒性。見(jiàn)圖16-18，圖16-17為注射藥物和dmso后不同時(shí)間腫瘤組織的變化圖。圖18為對(duì)抑制皮下腫瘤a549和ncl-h520生長(zhǎng)試驗(yàn)中，對(duì)照組、phpo組治療后腫瘤體積比較比較圖。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。