本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，是一種hsp90抑制劑在制備防治主動脈疾病藥物中的用途。

背景技術：

主動脈疾病是發(fā)生于主動脈的各類疾病的總稱，包括主動脈瘤、主動脈夾層、先天性主動脈疾病等類。這些疾病通常通隱匿，一旦出現(xiàn)癥狀就極其兇險，手術難度大，死亡率居高不下，因此主動脈疾病正逐漸上升為危害人類健康的主要疾病之一。

胸主動脈夾層(thoracicaorticdissection，tad)是其中最為兇險的疾病，據(jù)報道，未經治療的胸主動脈夾層破裂在24小時以內的死亡率高達50％以上。隨著目前診斷準確性的提高和醫(yī)療水平的提高，更多的主動脈夾層的患者有機會入院接受手術治療，但死亡率依舊很高。同時其發(fā)生機制也尚未明確，目前越來越多的研究表明血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells，vsmcs)的生物學性質的改變與胸主動脈夾層的發(fā)生有關。

熱休克蛋白(heatshockproteins，hsps)作為細胞中最豐富的蛋白質家族廣泛存在于原核及真核生物中并且在生物進化過程中高度保守。作為hsps家族重要的蛋白，有報道在應激狀態(tài)下，熱休克蛋白90(hsp90)的產物急劇增加從而參與多項信號轉導和應激反應。其下游蛋白大多數(shù)是控制細胞分化生長包括腫瘤細胞轉移的信號轉導分子如表皮生長因子受體2、bcr/abl融合基因、cdk4、akt、突變p53等，這些構象易變蛋白的功能有賴于hsp90來維持，從而抑制hsp90會導致下游蛋白構象發(fā)生異常，而形態(tài)和功能異常的蛋白會被細胞通過泛素-蛋白酶體通路快速排除。有研究認為hsp90在腫瘤細胞中主要處于活化態(tài)，在正常細胞中則主要處于靜默態(tài)。在處于活化態(tài)時，hsp90與蛋白及分子伴侶hsp70、hsp40、hop、p23、cdc37等偶聯(lián)形成復合物，保護下游蛋白不被蛋白酶體所降解。

hsp90抑制劑的發(fā)現(xiàn)和研究起始于20世紀60年代，是一類能與hsp90調節(jié)位點相結合，具有抑制hsp90活性，引起hsp90構象改變,誘導其底物蛋白降解，阻斷細胞生長、增殖和信號傳遞從而發(fā)揮抑制作用的化合物。它能夠通過抑制hsp90的正常功能，誘發(fā)腫瘤細胞的凋亡。它的主要優(yōu)點是其可以同時阻斷癌細胞形成的多個通路，避免了單一抑制某一通路時腫瘤細胞易產生耐藥性的弊端。同時因在腫瘤細胞內，hsp90與多種輔分子伴侶形成復合物以活化狀態(tài)存在，使得hsp90抑制劑具有高度特異性和選擇性。

hsp90抑制劑主要分為兩大類，第一類為天然抑制劑，一般是為從植物中提取的抗生素類化合物，主要包括格爾德霉素類和根赤殼菌素類化合物。第二類為人工設計合成的抑制劑。其中微生物來源的格爾德霉素(geldanamycin，ga)抗腫瘤活性的發(fā)現(xiàn)使hsp90成為治療癌癥的重要靶標，這也使得臨床上可行的小分子hsp90抑制劑成為研究的熱點。

格爾德霉素是最早發(fā)現(xiàn)的hsp90抑制劑，它的被發(fā)現(xiàn)使得研究hsp90的生物學功能，研究依賴hsp90的蛋白在癌癥發(fā)展中的作用成為可能，其抗腫瘤作用的發(fā)揮主要依賴于通過蛋白水解的途徑使那些癌基因蛋白、蛋白激酶失活，而不是直接抑制激酶的催化活性。免疫沉淀和親和力實驗揭示ga的主要作用機制是通過和hsp90的結合實現(xiàn)的。它通過競爭性結合hsp90的n-末端atp/adp結構域，從而抑制hsp90的內源性atp酶的活性。當hsp90的atp酶活性被抑制后，hsp90所作用的多肽蛋白便不能與hsp90結合而失去穩(wěn)定性，從而被蛋白體酶水解。雖然ga有很強的抗腫瘤活性，但由于ga的結構中含有苯醌環(huán)，該環(huán)是肝臟毒性產生的部分原因，為增加ga水溶性降低毒性，可將17位c端上的非必需甲氧基基團取代成胺類基團。利用該位點的取代得到一系列衍生物，如17-烯丙基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-aag)，17-二甲氨基-17甲氧基格爾德霉素(17-dmag)，ipi-504，目前這些衍生物已進入臨床試驗階段。

研究最廣泛的hsp90抑制劑17-aag是第一代格爾德霉素衍生物，早期的研究發(fā)現(xiàn)它對黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌和多發(fā)性骨髓瘤有治療活性。17-aag的ⅱ期、ⅲ期臨床試驗正在進行，主要是對幾種具有特定的hsp90底物蛋白的腫瘤，包括表達bcr-abl的白血病和her-2陽性的乳腺癌。此外，ga的同功異質體17-dmag由于具有更好的溶解度和口服生物利用率，現(xiàn)已進入i期臨床試驗階段。近幾年的亞臨床和臨床研究表明hsp90抑制劑和其它抗腫瘤試劑聯(lián)合應用于癌癥治療產生了一定的療效。如今，17-aag與曲妥單抗的聯(lián)用已完成臨床ⅱ期試驗，試驗結果顯示兩種藥物聯(lián)合應用于曲妥單抗難治型her-2陽性乳腺癌患者有很好的耐受性并表現(xiàn)出較高的抗腫瘤活性。

在心血管系統(tǒng)中，有研究證實hsp90通過調控平滑肌細胞的炎癥反應、增殖和遷移參與動脈粥樣硬化的病理過程，也有研究表明hsp90參與調控il6參與的炎癥反應從而參與動脈瘤的發(fā)病過程。因此hsp90在心血管領域的作用和巨大潛力不容小覷。

hsp90在大血管中的功能研究有助于我們更好的理解其發(fā)病機理，進一步找到大血管疾病相關的藥物靶點，填補這一藥物治療的空白區(qū)，從而為這類疾病的預防或治療提供行之有效的途徑。

中國專利文獻cn105727297a公開了一種包含hsp90抑制劑和mtor抑制劑的藥物組合產品，以及使用所述組合產品來治療或預防增殖性疾病的方法。中國專利文獻cn106349180a公開了4,5-二苯基異噁唑衍生物，其具有熱休克蛋白hsp90抑制活性，可用于治療癌癥、神經退行性疾病、炎癥性疾病、自身免疫性疾病、缺血性腦損傷等用途。將hsp90抑制劑17-aag應用于抑制平滑肌細胞的增殖及遷移從而緩解動脈粥樣硬化等疾病也已有研究表明。但是關于hsp90抑制劑在防治主動脈夾層疾病中的用途目前還未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種hsp90抑制劑的用途，同時提供一種篩選預防或治療主動脈夾層的潛在物質的方法，和一種預防或治療哺乳動物主動脈疾病的方法。

本發(fā)明的第一方面，提供一種hsp90抑制劑的用途，所述的hsp90抑制劑用于制備預防或治療主動脈夾層的藥物或試劑。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的主動脈夾層為胸主動脈夾層。

在一個優(yōu)選例中，所述的藥物或試劑特異性用于主動脈血管壁平滑肌細胞。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物或試劑用于抑制血管平滑肌細胞的表型轉化。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物或試劑特異性地抑制主動脈夾層的發(fā)生和破裂。

在另一優(yōu)選例中，所述的藥物或試劑降低主動脈夾層的死亡率。

在一個優(yōu)選例中，所述的hsp90抑制劑選自特異結合并抑制hsp90功能的格爾德霉素(geldanamycin，ga)及其衍生物。

在另一優(yōu)選例中，所述的格爾德霉素及其衍生物包括：17-二甲氨基-17甲氧基格爾德霉素(17-dmag)、17-烯丙基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-aag)、ipi-504等。

在一個更優(yōu)選實施方式中，所述的hsp90抑制劑為目前格爾德霉素最前沿的抑制劑17-dmag。

本發(fā)明的第二方面，提供一種預防或治療主動脈夾層的藥物或試劑，其包含：治療有效量的hsp90抑制劑，以及藥學上或免疫學上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明的第三方面，提供一種篩選預防或治療主動脈疾病的潛在物質的方法，所述方法包括：

(1)檢測候選物質在主動脈疾病中的表達水平；

(2)用候選物質抑制劑處理主動脈血管平滑肌細胞；

(3)檢測所述體系中平滑肌細胞相關生物活性指標的表達或活性；

其中，若所述候選物質可降低平滑肌細胞分泌型標志物的表達并進一步降低候選疾病的發(fā)生，則表明該候選物質是預防或治療主動脈疾病的潛在物質。

在一個優(yōu)選例中，

步驟(1)包括：在測試組中，測試候選物質在體系中的表達水平；

步驟(2)包括：在測試組中，首先誘導平滑肌細胞向分泌型轉化，再將候選物質加入到血管壁平滑肌的培養(yǎng)體系中；

步驟(3)包括：檢測測試組的體系中平滑肌細胞分泌型標志物的表達或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的培養(yǎng)體系；

如果測試組中平滑肌細胞分泌型標志物的表達或活性在統(tǒng)計學上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)對照組，就表明該候選物是預防或治療心臟疾病的潛在物質。

在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括：對獲得的潛在物質進行進一步的動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對于預防或治療主動脈疾病有用的物質。

在一個更優(yōu)選實施方式中，所述方法包括：

(1)檢測所述疾病中hsp90的表達；和(2)用hsp90抑制劑處理表達hsp90的主動脈疾病中主動脈夾層體系；其中，若所述候選物質可降低hsp90的表達或活性并降低主動脈夾層的破裂，則表明該候選物質是預防或治療主動脈夾層疾病的潛在物質。

本發(fā)明的第四方面，提供一種預防或治療哺乳動物主動脈疾病的方法，所述方法包括：通過特異性抑制劑對所述哺乳動物體內hsp90的表達水平進行下調以抑制主動脈夾層的發(fā)生。

本發(fā)明優(yōu)點在于：

本發(fā)明首次揭示了hsp90的抑制物可特異性地抑制主動脈夾層的破裂，并且首次揭示了hsp90的表達與主動脈疾病密切相關，從而為大血管疾病的防治提供了新的靶點。

附圖說明

圖1.定量pcr及免疫組化對人主動脈組織hsp90的表達進行分析，以期獲得hsp90在正常主動脈及夾層組織中的差異表達。a，定量pcr結果顯示，與正常組織相比，主動脈夾層患者的主動脈組織hsp90表達較對照組明顯上升。b，免疫組織化學染色顯示hsp90陽性主要表達在血管壁中膜層血管壁平滑肌細胞。

圖2.主動脈夾層疾病與主動脈血管壁平滑肌細胞表型轉化相關。a，westernblot結果顯示主動脈夾層組織中hsp90蛋白表達量也高于對照組，同時在主動脈夾層組織中平滑肌細胞收縮型標志物下降及分泌型標志物上升。b，對westernblot結果進行spearman相關性分析顯示hsp90的表達量與分泌型標志物opn呈正相關，而與收縮型標志物sm22呈負相關。

圖3.β-bapn聯(lián)合angii方法建立fvb小鼠主動脈夾層模型。對照組及主動脈夾層小鼠心臟及主動脈的大體照片，血管壁破裂出血表示假腔形成，進一步標志著建模成功，根據(jù)假腔出現(xiàn)的解剖位置將主動脈夾層分為胸主動脈夾層及腹主動脈夾層。

圖4.應用hsp90抑制劑17-dmag干預主動脈夾層模型小鼠，發(fā)現(xiàn)顯著降低模型死亡率。a，對比模型組，藥物干預組的小鼠死亡率明顯降低。b，對比模型組顯著限制了了小鼠體重的增加，藥物干預對小鼠體重的減少無明顯改善。c，對比模型組對血壓的影響，藥物干預組的小鼠舒張壓有明顯改善，而收縮壓變化無統(tǒng)計學差異。d，藥物干預能顯著降低胸主動脈夾層的發(fā)生率及破裂事件的發(fā)生率。

圖5.hsp90抑制劑17-dmag微觀上能顯著改善主動脈血管壁的破壞程度，其可能是通過抑制平滑肌細胞的表型轉化實現(xiàn)的。a，常規(guī)he和vb染色顯示對比模型組，藥物干預組顯著改善了主動脈血管壁的破壞程度。b，westernblot結果顯示與模型組相比，藥物干預組的hsp90表達明顯減少，同時檢測出平滑肌細胞收縮型標志物上升及分泌型標志物下降。

圖6.hsp90抑制劑17-dmag可抑制由pdgf-bb誘導的平滑肌細胞表型轉化。a，免疫熒光顯示hsp90在pdgf-bb誘導下顯著升高，而17-dmag抑制了hsp90的表達。b，定量pcr顯示17-dmag能減輕由pdgf-bb誘導的平滑肌細胞收縮型標志物下降及分泌型標志物上升。c，westernblot確認hsp90抑制劑能減輕由pdgf-bb誘導的平滑肌細胞收縮型標志物下降及分泌型標志物上升。d，定量pcr顯示hsp90抑制劑能減輕由pdgf-bb誘導產生的分泌蛋白。

圖7.hsp90抑制劑17-dmag可抑制由pdgf-bb誘導的平滑肌細胞增殖、遷移及分泌等功能。a，cck8結果顯示17-dmag可抑制pdgf-bb誘導的平滑肌細胞增殖功能。b，平板劃線結果顯示17-dmag可抑制由pdgf-bb誘導的平滑肌細胞遷移。c，流氏細胞周期結果顯示17-dmag使細胞周期停滯在g1期。d，17-dmag對pdgf-bb誘導的平滑肌細胞凋亡無顯著影響。

具體實施方式

本發(fā)明經過深入的研究，首次揭示了hsp90抑制劑可特異性地抑制主動脈血管平滑肌細胞的表型轉化，并且首次揭示了hsp90的表達通過主動脈血管平滑肌細胞的表型轉化與主動脈夾層疾病密切相關，其高表達促進主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展。本發(fā)明為主動脈疾病的防治提供了新的靶點。

hsp90

熱休克蛋白(heatshockprotein,hsp)是遺傳學家ritossa在1962年首次發(fā)現(xiàn)。作為細胞中最豐富的蛋白質之一，熱休克蛋白90(hsp90)又稱為應激蛋白90(stress-90)，在生物進化過程中高度保守，廣泛存在于原核和真核生物中，是細胞中存在最豐富的蛋白質之一。當細胞受到外界刺激時，其表達成倍增加，能夠迅速保護細胞對抗內源性進攻，增強細胞修復功能及提高細胞對刺激的耐受力。hsp90除了可將新生肽鏈或非天然肽的蛋白質折疊成具有天然態(tài)的功能蛋白外，還參與信號傳遞分子構象的變化過程，通過對底物蛋白的作用，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。

hsp90的用途

hsp在多種細胞生理、生化變化及突變過程中作為一個重要的緩沖因子，調控著重要蛋白的空間結構和突變，當生物受到內外環(huán)境中的理化、生物、精神等刺激時發(fā)生應激反應時，hsp大量表達，以此維持信號轉導蛋白的功能。

其中hsp90作為一種分子伴侶參與了體內多種生物學過程，如信號轉導、蛋白質折疊與成熟等。細胞在正常狀態(tài)下并不表達hsp90，但在應激狀態(tài)下，hsp90產物急劇增加，與效應蛋白作用幫助細胞恢復正常并提高其生存能力。它的結合底物主要是信號傳導系統(tǒng)的蛋白激酶和一些突變蛋白質，如跨膜酪氨酸激酶(egfr、her2)、嵌合信號蛋白(ab1、bc1)、亞穩(wěn)態(tài)信號蛋白(rafl、akt和ikk)、細胞周期調節(jié)蛋白(cdk4、cdk6)、突變信號蛋白(p53、src)以及類固醇激素受體等，這些信號傳導分子的過表達或過度激活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要分子事件。

hsp90抑制劑及其用途

hsp90抑制劑可以同時阻斷多種信號傳導途徑，另一方面，由于腫瘤細胞中hsp90蛋白構象與正常細胞中的hsp90蛋白構象有明顯差異，hsp90抑制劑對腫瘤細胞的hsp90有很高的親和力，而對正常細胞的殺傷力較小，副作用相對較低，對腫瘤組織具有一定的靶向性。研究表明，hsp90抑制劑單用或者與其他藥物或治療方法聯(lián)合使用都具有一定的抗腫瘤效果，因此，hsp90抑制劑被廣泛運用于抗腫瘤治療中。同時，也已有研究將hsp90抑制劑17-aag應用于抑制平滑肌細胞的增殖及遷移從而緩解動脈粥樣硬化等疾病，有研究通過抑制氧化應激從而抑制心梗后缺血再灌注損傷，但是，針對hsp90抑制劑17-dmag這個靶點進行功能干預能否能運用于主動脈夾層疾病的治療，目前國內外文獻尚未見報導。

在得知了hsp90對于主動脈疾病的作用后，本領域人員可以方便地得知可以通過hsp90抑制劑來防治主動脈疾病的發(fā)生或發(fā)展。因此，任何hsp90的抑制劑都可用于本發(fā)明。根據(jù)hsp90的特性，本領域人員可以獲得多種hsp90的抑制劑。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇抑改?newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

i.材料和方法

rna制備

將離體的主動脈組織除去內膜及外膜，用pbs清洗3遍后迅速放入液氮進行儲存；人主動脈總rna、小鼠組織以及培養(yǎng)細胞的總rna用trizol(invitrogen)抽提。

實時熒光定量pcr

常規(guī)方法抽提rna，然后進行實時熒光定量pcr檢測，以雙標準曲線方法定量，分析各樣本的rna濃度，進行常規(guī)pcr擴增。

sd大鼠血管平滑肌細胞培養(yǎng)和表型轉化模型

取成年sd大鼠，無菌條件下取胸主動脈，除去內膜及外膜，pbs充分清洗后將組織剪碎為0.2*0.2mm小塊，0.2％胰蛋白酶37℃消化8小時后離心、收集下層細胞、計數(shù)并接種。以20％血清dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)2天后，觀察細胞表型并進行鑒定、傳代等。

小鼠主動脈夾層模型

選取重量為16-18克fvb成年雄鼠，隨機分為空白對照組，模型組及藥物治療組。對模型組及藥物治療組進行β-bapn喂養(yǎng)28天；28天后將血管緊張素ii微泵埋藏在小鼠皮下48小時，期間進行小鼠每日體重測量，不限制飲食量；對實驗過程中死亡的小鼠及時進行解剖并留取胸主動脈組織，28天及48小時模型建立結束后即進行解剖及標本留取。

組織學常規(guī)染色分析

取空白組、模型組及藥物干預組小鼠胸主動脈，用4％多聚甲醛固定過夜，脫水，石蠟包埋。石蠟切片(4μm)用蘇木精&伊紅染色(h&e)及維多利亞蘭染色(vb)，封片儲存，觀察分析。

組織免疫組化及分析

采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶法。對石蠟切片進行常規(guī)脫蠟水化，檸檬酸鹽緩沖液熱修復抗原，依次滴加過氧化物酶阻斷液(37℃封閉10min)、10％非免疫性動物血清(37℃孵育30min)、一抗(1:100稀釋，4℃過夜)、生物素標記的二抗(37℃孵育1h)，dab顯色后行蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。結果判定標準：切片均采用雙盲法由2位病理科醫(yī)生獨立閱片，細胞質內出現(xiàn)黃褐色顆粒者為陽性結果。

細胞免疫熒光

4％多聚甲醛細胞固定15分鐘后用0.1％tritonx-100通透15min，5％山羊血清室溫封閉1小時，以1:500稀釋度加入anti-α-actinin抗體(sigma)4℃孵育過夜。用pbs洗三遍后加入alexa-555(molecularprobes)標記的二抗，室溫孵育1小時。細胞核用4’,6-diamidino-2-phenylindole(dapi)標記，最后封片，避光保存，48小時內觀察分析。

統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。對于相對基因表達分析，對照組的平均值定義為1。配對數(shù)據(jù)進行ttest；用非配對student’sttest進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。sigmaplot程序用于數(shù)據(jù)分析。p<0.05為顯著差異。

ii.實施例

實施例1、主動脈夾層患者標本收集及hsp90表達水平

采用2014年9月起至2015年12月，20例胸主動脈組織取自長海醫(yī)院胸心外科因急性stanforda型胸主動脈夾層手術的患者術中切除的病變血管標本，8例正常對照組取自尸檢病人，無心血管疾病病史，查閱心超結果證實主動脈不擴張。取材后置于液氮中保存，提取組織樣本rna行定量pcr、提取組織蛋白行westernblot。取1cm大小的組織進行4％多聚甲醛固定，包埋蠟塊，行組織化學染色及免疫組織化學染色，結果顯示主動脈夾層組hsp90在rna及蛋白水平顯著高于正常對照組(圖1及圖2a)。說明在胸主動脈夾層病程中，主動脈組織中hsp90明顯高于正常，說明hsp90可能參與夾層的發(fā)生發(fā)展過程中。進一步檢測關于平滑肌細胞表型相關標志物，spearman相關性分析結果顯示hsp90的蛋白表達水平與分泌型標志物的蛋白表達水平呈現(xiàn)正相關，而與收縮型標志物的表達呈現(xiàn)負相關(p＜0.05)，因此進一步分析，hsp90可能通過參與平滑肌細胞的表型轉化過程從而參與主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展。

實施例2、主動脈夾層模型建立及驗證

選取重量為16-18克fvb成年雄鼠60只，隨機分為空白對照組，模型組及藥物干預組，每組20只，隨機分為4籠，每籠5只，通過剪腳趾分別標記每只小鼠。首先通過無限制喂養(yǎng)1周計算出每籠老鼠每天飲水量，接下來以1克每公斤體重每天對模型組及藥物干預組將β-bapn溶解于純凈水中喂養(yǎng)小鼠，時間為28天；28天后行剪尾法行血壓測定，繼而將血管緊張素ii以1微克每分鐘每公斤體重將微泵埋藏在小鼠皮下48小時。實驗全程期間每日對小鼠體重進行測量，不限制飲食量；對實驗過程中死亡的小鼠及時進行解剖并留取胸主動脈組織，行病理切片及常規(guī)染色(圖3及圖5a)。其余存活小鼠在模型建立結束后即進行解剖，標本分別行液氮保存及甲醛固定。

實施例3、hsp90抑制劑17-dmag對主動脈夾層模型干預

在建模過程中，對藥物干預組小鼠以10毫克每千克每2天進行給藥，藥物以無水乙醇溶解，皮下注射，每次藥物總量不超過200微升。實驗結果顯示，藥物干預組小鼠未出現(xiàn)死亡事件(圖4a)，進而在組織學檢測發(fā)現(xiàn)未破裂的主動脈組織的形態(tài)學也有了明顯的改善(圖5a)。將胸腹主動脈分別進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)胸主動脈夾層的形成及進一步破裂有明顯的減少，而藥物干預對腹主動脈夾層的形成無明顯效果。

實施例4、模型組及藥物干預后hsp90及表型轉化標志物表達對比

在組織學水平，我們首先通過westernblot進行了人主動脈組織中平滑肌細胞表型相關標志物的檢測，發(fā)現(xiàn)在主動脈夾層的疾病過程中，主動脈平滑肌細胞會向著分泌型細胞轉化，伴隨著分泌型標志物的升高及收縮型標志物的降低，進而我們通過spearman相關性分析發(fā)現(xiàn)hsp90的表達量與平滑肌的表型轉化程度呈現(xiàn)正相關(圖2)。而后，在模型的干預部分，我們也進行了表型轉化相關標志物的檢測，發(fā)現(xiàn)17-dmag能在組織學水平抑制表型轉化(圖5b)，最后在細胞學上我們再次進行了相關的分析及驗證，得到了同組織學相同的結論(圖6b、c)。

實施例5、細胞水平藥物干預后對平滑肌細胞其他生物學功能的影響

在前期預實驗及文獻報道，hsp90抑制劑對平滑肌細胞的生物學功能有顯著影響，包括對增殖、遷移、周期及凋亡的影響。在pdgf-bb的誘導下，平滑肌細胞的增殖、遷移均有明顯增加，而17-dmag抑制了平滑肌的增殖和遷移；其次，17-dmag能顯著抑制平滑肌細胞周期使其停滯在g1期。而pdgf-bb本身對平滑肌細胞的凋亡無明顯影響，17-dmag干預后凋亡的改變也沒有統(tǒng)計學意義(圖7)。

iii.討論

本項發(fā)明的工作中，我們首先通過定量pcr檢測到，hsp90在急性主動脈夾層撕裂組織中表達上調，同時通過westernblot進行了進一步驗證。同時通過免疫組織化學染色，我們將hsp90的表達定為于血管壁中膜層的平滑肌細胞，通過對hsp90表達變化檢測及既往對主動脈夾層可能涉及的病理機制研究中，旨在將hsp90的表達異常與主動脈夾層的病理進程聯(lián)系起來，得出hsp90的過度表達可能與主動脈夾層病理過程有著重要的聯(lián)系。

我們首先猜測作為近幾年研究的熱門問題，平滑肌細胞作為有潛在分化機制的一類細胞，其在受到病理生理過程的刺激下，會出現(xiàn)向著幼稚細胞分化的潛能；此時成熟的平滑肌細胞就會由收縮功能為主的收縮型細胞向著具有增殖及分泌等功能為主的分泌型細胞轉化，目前已證實平滑肌細胞表型轉化與多種心血管疾病密切相關，尤其是動脈粥樣硬化及動脈瘤。而近年來越來越多的證據(jù)指出其與主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展可能有關，于是我們針對這一問題，首先在主動脈夾層組織標本的蛋白表達水平上，確定了主動脈夾層患者的血管壁組織分泌型標志物的表達明顯升高而收縮型標志物的表達明顯降低，因此我們確證了主動脈夾層的發(fā)病機制中伴隨著平滑肌細胞的表型轉化，進而我們通過對20例主動脈夾層患者組織學蛋白表達量進行了spearman相關性分析，結果顯示hsp90的表達量與平滑肌細胞的表型轉化程度呈現(xiàn)正相關，即與分泌型標志物的表達呈正相關，因此我們有理由相信hsp90參與了平滑肌細胞的表型轉化過程從而進一步在主動脈夾層疾病的過程中起到了重要的作用。

接下來為了進行干預hsp90是否能影響主動脈夾層的發(fā)生發(fā)展，我們通過β-bapn聯(lián)合angii的方式成功建立了主動脈夾層的小鼠模型并且對模型進行了hsp90抑制劑17-dmag的藥物干預，在模型水平，成功得出hsp90能有效緩解主動脈夾層血管壁結構的破壞并顯著減少模型死亡率。同時通過蛋白表達定量分析，在組織學得出結論，17-dmag能有效減少分泌型平滑肌細胞，從而可能通過抑制平滑肌細胞表型轉化而減少夾層的發(fā)生發(fā)展。而進一步在分別分析胸主動脈及腹主動脈夾層形成的過程中發(fā)現(xiàn)，17-dmag主要作用于胸主動脈的形成及進一步破裂，這與人主動脈組織的取材部分及疾病類型相一致，也進一步驗證了表型轉化過程與主動脈夾層疾病的相關性。曾有研究表明，在胚胎發(fā)育過程中胸腹主動脈來源于不同胚層，因此胸、腹主動脈夾層的發(fā)生機制可能有所不同，因此本發(fā)明中涉及的組織學標本及細胞均來源于胸主動脈部分，不再涉及腹主動脈夾層。

目前許多hsp90抑制劑已經成熟開發(fā)并進行了臨床試驗。格爾德霉素(geldanamycinga)，作為一種hsp90的天然抑制劑，可以通過綁定atp的n-端從而抑制atp酶循環(huán)，但因其肝毒性較大及溶解度較差而限制了其臨床應用。因此，毒性較低的ga衍生物也孕育而生，包括17-aag，17-dmag，ipi-504等。最近，許多特異性的hsp90小分子抑制劑也已經被證明具有抗腫瘤活性，如sta-9090，pf-4470296和pf-3823863。我們的前期實驗及發(fā)明部分，證實了17-dmag具有對緩解主動脈夾層的相關作用，而更新的抑制劑是否具有類似的治療價值有待進一步的研究證實。

以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。