本申請是國際申請?zhí)杙ct/jp2014/063527，國際申請日2014年5月15日，進(jìn)入中國國家階段日期2015年11月11日，中國申請?zhí)?01480026895.4，發(fā)明名稱為“用于確定癌癥預(yù)后的方法”的分案申請。本發(fā)明涉及用于確定受試者中癌癥預(yù)后的方法、診斷組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
：：在大部分工業(yè)化國家中，癌癥是死亡的主要原因，并且癌癥死亡的直接原因通常是其向生命器官的轉(zhuǎn)移。在japan，結(jié)直腸癌是第三大常見癌癥原因，每年每100,000名人口中診斷出～100名新結(jié)直腸癌患者，并且死亡率是30-40名/100,000名患者；并且這仍然在增長。癌癥治療，諸如化療和射線，具有相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，并且，最佳選擇更可能得益的患者是重要的。盡管有一些關(guān)于結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)記物的研究(非專利文獻(xiàn)1-7)，但是，其不足以鑒定具有良好的預(yù)后的患者，對于這樣的患者，將不需要危險(xiǎn)性的治療。引用列表非專利文件非專利文件1：science(科學(xué))314：268-274(2006)非專利文件2：science(科學(xué))318：1108-1113(2007)非專利文件3：nejm344：1196-1206(2001)非專利文件4：clin.cancerres.(臨床癌癥研究)17：1535-1545(2011)非專利文件5：j.clin.oncol.(臨床腫瘤學(xué))29：17-24(2011)非專利文件6：j.clin.oncol.(臨床腫瘤學(xué))29：1261-1270(2011)非專利文件7：j.clin.oncol.(臨床腫瘤學(xué))29：4620-4626(2011)這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在本文中。發(fā)明概述在研究癌癥轉(zhuǎn)移的機(jī)制時(shí)，我們證明notch受體裂解起始dab1-abl激活并且引起trio的tyr-磷酸化。此外，我們發(fā)現(xiàn)trio在y2681處的磷酸化與crc患者差的預(yù)后相關(guān)(圖6a)，并且trio(py2681)不僅在原發(fā)性crc中發(fā)出信號(hào)，而且還在其轉(zhuǎn)移和包括乳腺癌和肺癌在內(nèi)的多種其他類型的癌癥中發(fā)出信號(hào)(圖12和表2)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們完成了本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定受試者中的癌癥預(yù)后的方法，所述方法包括以下步驟：在從所述受試者獲得的樣品中檢測trio的2681位處的酪氨酸殘基的磷酸化，其中不存在磷酸化表示良好的癌癥預(yù)后。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供特異性結(jié)合trio(py2681)的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定癌癥預(yù)后的診斷組合物，所述診斷組合物包含本發(fā)明的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定癌癥預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包括本發(fā)明的抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療結(jié)直腸癌的藥物組合物，所述藥物組合物包含abl抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于防止癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，所述藥物組合物包含abl抑制劑。附圖簡述圖1.notch信號(hào)傳導(dǎo)(signaling)激活crc細(xì)胞中的rho從而刺激侵入(a和b)rbpj基因敲除阻斷apc/aes復(fù)合突變體小鼠中腸腫瘤的侵入。在apc/aes雙重和apc/aes/rbpj三重突變體小鼠的腸中通過h&e染色(a)以組織病理學(xué)方式分析腫瘤侵入的深度并評分(b)。對于每組，n＝5。(a)中的虛線表示粘膜肌層(muscularismucosae)的位置。(a)中的星號(hào)顯示侵入到粘膜下層的crc腺體。(b)中的侵入深度由粘膜內(nèi)層(mu)和到達(dá)粘膜下層(sm)、固有肌層(mp)和漿膜(se)的縮寫顯示。參見基因型縮寫的實(shí)驗(yàn)規(guī)程。(c)apc/aes小鼠的侵入的腸腫瘤中的rho的激活。在gtp-rho拉下測定(pull-downassay)中，分析來自apc+/δ716對照(apc)和apc/aes突變體小鼠的正常的腸粘膜(n)和腫瘤(t)的組織。還顯示了總rho蛋白的量。(d)通過aes的rho激活的抑制。將colon26teton-aes-flag細(xì)胞鋪板到包被有重組的dll4(rdll4)的胞外結(jié)構(gòu)域的培養(yǎng)皿上，并且通過多西環(huán)素(doxycycline)誘導(dǎo)有flag-標(biāo)記的aes(aes-f)。刮下后16小時(shí)收集細(xì)胞層，并且分析gtp-rho。(e和f)抑制rho或rock抑制培養(yǎng)物中的crc細(xì)胞的基質(zhì)膠侵入和透內(nèi)皮遷移(tem)。分別在存在兩個(gè)劑量的rho抑制劑c3t或rock抑制劑y-27632的情況下，測定rko人crc細(xì)胞的基質(zhì)膠侵入(e)或tem(f)。(g和h)在用edta處理的人crc細(xì)胞中通過notch受體激活的rho激活的時(shí)程。將rko細(xì)胞用10mmedta處理2分鐘，并且在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)指定時(shí)間，并測定gtp-rho。(i)通過notch受體經(jīng)由其配體的激活來激活rho。將rko細(xì)胞鋪板在包被有rdll4的培養(yǎng)皿上，并且在指定時(shí)間點(diǎn)收集用于gtp-rho拉下測定。(j)在crc細(xì)胞中通過敲低三個(gè)notch受體種內(nèi)同源基因減少rho激活。將rko細(xì)胞用針對notch1、2和3的sirna(sinotch1/2/3)的混合物(對于每種種內(nèi)同源基因，#1和#2)轉(zhuǎn)染。非沉默sirna(ns)和無轉(zhuǎn)染(-)用作對照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將細(xì)胞用或不用10mmedta處理并且分析gtp-rho。(k)通過γ-分泌酶抑制notch受體激活而抑制rho激活。將rko細(xì)胞用10μmdapt處理12小時(shí)，用10mmedta處理，并進(jìn)行rho拉下測定?？潭葪l，100μm。數(shù)據(jù)表示為平均值與sd。*p＜0.01，并且#p＜0.05。對于gtp-rho拉下測定，還測定總rho蛋白的量。還參見圖s1。圖2.rbpj-依賴性和-不依賴性notch信號(hào)傳導(dǎo)對于crc進(jìn)展都是關(guān)鍵的。通過notch受體激活的早期(a-d)和晚期(e-j)反應(yīng)。(a)notch和rho對于crc細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞(ec)的附著是關(guān)鍵的。將表達(dá)egfp的hct116細(xì)胞用或不用c3t或dapt處理2小時(shí)，并且鋪板到肺內(nèi)皮細(xì)胞(lgec)層上。15分鐘后，將未結(jié)合的hct116細(xì)胞清洗掉，并且通過熒光計(jì)計(jì)數(shù)保持附著的細(xì)胞數(shù)目。(b和c)rho的早期激活不依賴于rbpj。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)兩個(gè)用于非沉默對照(ns)的表達(dá)載體或者rbpj-敲低(shrbpj)短發(fā)夾rna構(gòu)建體建立hct116細(xì)胞的穩(wěn)定的克隆系(b)。在2分鐘的edta處理后，使它們進(jìn)行rho拉下測定(c)。(d)甚至在不存在rbpj時(shí)，crc細(xì)胞與ec的附著也取決于γ-分泌酶活性。將(b)中所述的rbpj-敲低或?qū)φ占?xì)胞用或不用dapt處理2小時(shí)，并且進(jìn)行(a)中的附著測定。(e)rbpj對于rho的晚期激活是關(guān)鍵的。將rbpj-敲低或?qū)φ占?xì)胞用edta處理，并且在6或12小時(shí)測定gtp-rho。(f)小鼠和果蠅共有的rbpj靶向基因。如通過rna-seq和使用抗-rbpjab的染色質(zhì)免疫沉淀(chip)-seq確定的，在小鼠腦中，98個(gè)基因由rbpj直接調(diào)節(jié)。另一方面，在果蠅中，55個(gè)基因通過notch信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)，其鄰近的區(qū)域被su(h)結(jié)合，su(h)是小鼠rbpj的果蠅直向同系物。顯示的是在兩個(gè)物種之間通過rbpj共同表達(dá)的共有的3個(gè)基因家族；小鼠和(果蠅)基因符號(hào)。(g)果蠅、小鼠和人dab/dab1/dab1啟動(dòng)子區(qū)中發(fā)現(xiàn)的notch轉(zhuǎn)錄因子su(h)/rbpj/cbf1的高親和性結(jié)合基序。高親和性和低親和性序列基序分別由實(shí)心三角和空心三角顯示。用于chip分析的引物對(圖2i，右側(cè))由一對水平的三角形表示。tss是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。(h)重組dll4(rdll4)配體在培養(yǎng)的crc細(xì)胞中誘導(dǎo)dab1。將ls174t細(xì)胞用或不用10μmdapt溫育24小時(shí)，并且鋪板在用或不用rdll4預(yù)先包被的培養(yǎng)皿上。四小時(shí)后，通過定量(q)rt-pcr定量dab1mrna水平。(i)rbpj結(jié)合dab1啟動(dòng)子。用抗-rbpj或抗-nicd對ls174t裂解物進(jìn)行的chip富集dab1基因的基因組啟動(dòng)子片段，如由qpcr確定的。(j)在apc/aes小鼠crc中誘導(dǎo)dab1。在apc和apc/aes突變體小鼠的腫瘤中，dab1用淺灰色染色，而細(xì)胞核用深灰色染色?？虺龅膮^(qū)域在右圖中放大。符號(hào)同圖1a。t，腫瘤。s，間質(zhì)?？潭葪l，50μm。數(shù)據(jù)表示為平均值與sd。*p＜0.01。還參見圖9。圖3.dab1通過rho激活刺激crc侵入和轉(zhuǎn)移(a和b)dab1對于內(nèi)源性crc的進(jìn)展是關(guān)鍵的。將腸上皮-特異性的dab1空突變引入到apc/aes雙重突變體小鼠中以得到apc/aes/dab1三重突變體小鼠。使用與圖1a和1b相同的方法和符號(hào)。(c，d和e)敲低dab1抑制crc移植物的轉(zhuǎn)移。用編碼egfp的表達(dá)載體和針對dab1的shrna(shdab1)轉(zhuǎn)導(dǎo)高dab1的ls174t細(xì)胞(c)。建立兩個(gè)克隆系，并且注射到裸鼠直腸中。在熒光解剖顯微鏡下評估它們的肺轉(zhuǎn)移(d)，并對其數(shù)目進(jìn)行評分(e)。(f，g和h)dab1的表達(dá)在體內(nèi)刺激crc轉(zhuǎn)移。用egfp和dab1的表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)低dab1的rko細(xì)胞(f)，并且植入裸鼠直腸粘膜中。分別進(jìn)行如在(d)和(e)中那樣的評估(g)和定量(h)。(i)dab1對于通過notch信號(hào)傳導(dǎo)的rho的早期和晚期激活都是關(guān)鍵的。將dab1-敲低或?qū)φ湛寺∮?0mmedta處理，并且在所示的時(shí)間進(jìn)行rho拉下測定。(j)通過notch受體分解和dab1的rho的協(xié)同性激活。將表達(dá)dab1的rko細(xì)胞用或不用edta處理2分鐘，并在5分鐘后進(jìn)行rho拉下測定。(k)edta處理后，dab1的rbpj-依賴性誘導(dǎo)。將rbpj-敲低(shrbpj；紅色)或?qū)φ?ns；黑色)hct116細(xì)胞用edta處理，并且在指定的時(shí)間針對dab1mrna進(jìn)行qrt-pcr測定?？潭葪l對于(a)為100μm，對于(d)和(g)為500μm。數(shù)據(jù)表示為平均值與sd。*p＜0.01，并且#p＜0.05。圖4.dab1和abl的酪氨酸磷酸化本身對于rho激活和crc細(xì)胞侵入是必要的(a和b)伊馬替尼(imatinib)抑制內(nèi)源性crc的侵入。將apc/aes復(fù)合突變體小鼠用(紅色)或不用(灰色)50mg/kg/天的伊馬替尼處理9周(各n＝5)。使用與圖1a和1b相同的方法和符號(hào)。(c)在人crc細(xì)胞中敲低abl抑制基質(zhì)膠侵入。將rko細(xì)胞分別用針對abl1(，siabl1)、abl2(siabl2)的兩個(gè)獨(dú)立的sirna組(#1和#2)或它們的組合轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過qrt-pcr定量abl1和abl2的表達(dá)(下部)。同時(shí)，檢測細(xì)胞的基質(zhì)膠侵入(上部)。(d)abl敲低減少由notch信號(hào)傳導(dǎo)引發(fā)的rho激活。在edta處理5分鐘后，在rko細(xì)胞中檢測兩組組合的敲低對rho的抑制作用。(e)abl抑制劑伊馬替尼以劑量依賴性方式阻斷crc細(xì)胞的基質(zhì)膠侵入。用伊馬替尼處理rko細(xì)胞，并檢測基質(zhì)膠侵入。(f)伊馬替尼抑制由notch受體激活誘導(dǎo)的rho激活。在不存在或存在伊馬替尼的條件下，將rko細(xì)胞用edta處理，并在5分鐘后進(jìn)行rho拉下測定。(g)dab1增加crc細(xì)胞中abl的tyr-激酶活性。第1-3道；hct116細(xì)胞表達(dá)等量的flag-標(biāo)記的野生型dab1(第2道)或其5yf突變體(第3道)，并且，在免疫沉淀(ip)后通過蛋白質(zhì)印跡(wb)確定其磷酸-tyr(py)含量。第4-7道；hct116細(xì)胞共表達(dá)dab1-flag和ha--標(biāo)記的野生型(wt)abl1b(abl1b-ha)。注意，在第6和7道中dab1-flagcdna的輸入量分別與在第2和3道中的輸入量相等。第8-11道；hct116共表達(dá)與第4-7道中相同組的dab1cdna和abl1b的激酶-死亡(kd)突變體。數(shù)據(jù)表示為平均值與sd。*p＜0.01。還參見圖10。圖5.trio在abl和dab1的存在下tyr-磷酸化，并且刺激crc侵入(a)trio結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)(由(bateman，j.和vactor，d.v.，2001，j.cellsci.114：1973-1980)修改)和可磷酸化的tyr殘基的示意圖。上部顯示包含3097個(gè)aa的野生型人trio(triowt)的結(jié)構(gòu)域。矩形顯示所示的具體結(jié)構(gòu)域?？s寫：gef，鳥嘌呤核苷酸交換因子結(jié)構(gòu)域；ig，免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域；stk，絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。在triowt結(jié)構(gòu)下方，tyr(y)至phe(f)突變的位置以紅色“f”顯示。ig結(jié)構(gòu)域中的星形表示g2699，在人肺癌中發(fā)現(xiàn)其錯(cuò)義突變?yōu)関al(見圖7f和7g)。(b和c)trio敲低抑制crc細(xì)胞中由notch信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)的rho激活和基質(zhì)膠侵入。將hct116細(xì)胞用兩個(gè)獨(dú)立的針對triomrna的sirna構(gòu)建體(sitrio#1或2)轉(zhuǎn)染。48小時(shí)溫育后，將細(xì)胞用或不用edta處理，并且測定gtp-rho(b)和基質(zhì)膠侵入(c)。(d)在crc細(xì)胞中，trio在abl和dab1的存在下tyr-磷酸化。將hct116細(xì)胞用或不用針對t7-標(biāo)記的trio(t7-trio)的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)，用或不用ha-標(biāo)記的abl1b(，abl1b-ha)和/或flag-標(biāo)記的dab1(dab1-flag)共轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用與圖4g相同的符號(hào)。(e)trio的c端半被abl磷酸化。t7-trio的wt或yf突變體與或不與abl1b-ha和dab1-flag同時(shí)表達(dá)，然后蛋白質(zhì)印跡分析pys。(f)在abl和dab1存在下，trio中的y1990和y2681被磷酸化。注意，在y1990f和y2681f突變體(第2和4道)以及在4yfs(第6道)中，py水平顯著減少。數(shù)據(jù)表示為平均值與sd。*p＜0.01。圖6.人crc中trio(y2681)的磷酸化與差的預(yù)后相關(guān)。(a)trio(py2681)與crc患者中差的預(yù)后相關(guān)。通過免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)來自102名患者的原發(fā)性crc樣品的trio(py2681)，然后進(jìn)行kaplan-meier分析。(左)當(dāng)合并所有階段的患者時(shí)，32個(gè)病例是trio(py2681)免疫染色陰性的(-)，而70個(gè)病例是陽性的(+)。(-)相對(+)，在卡方檢驗(yàn)中，p＝0.01。(中)對于合并的i期和ii期患者，trio(py2681)-陰性組表現(xiàn)出100％的5年存活，trio(py2681)-陽性組表現(xiàn)出～20％的死亡率。(-)(n＝23)相對(+)(n＝40)，在卡方檢驗(yàn)中，p＝0.04。(右)甚至僅對于ii期患者，與陽性患者(n＝33)相比，陰性患者(n＝13)具有100％的存活，表現(xiàn)出與合并的i期和ii期相似的存活率(在卡方檢驗(yàn)中，p＝0.1)。(b)crc細(xì)胞(箭頭)中針對trio(py2681)的染色強(qiáng)于在相鄰的正常粘膜(n)或淋巴樣濾泡(l)中的染色?？虺龅膮^(qū)域在插入的圖表中放大表示。(c，d和e)在侵入的間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的crc細(xì)胞中的trio(py2681)的染色。注意，在出芽的(d)和分散的(e)crc細(xì)胞(箭頭)中，trio(y2681)被高度磷酸化。刻度條，100μm。還參見圖11。圖7.trio(y2681)的磷酸化刺激rhogef活性并且促進(jìn)crc細(xì)胞的侵入。(a)人crc中核aes與trio(py2681)的逆相關(guān)。顯示的是用抗-aes和抗-trio(py2681)抗體免疫染色的兩個(gè)代表性的系列切片組。注意，表達(dá)核aes的crc腺體具有很少的trio(py2681)染色(箭頭；頂部行)，而trio(py2681)-陽性crc腺體沒有aes表達(dá)(箭頭；底端行)。插圖顯示更高放大率的框出區(qū)域。(b)在小鼠腸腫瘤中通過失去aes的trio在y2681處的磷酸化。通過ip-wb分析正常粘膜(n)和腸腫瘤(t)的裂解物的trio(py2681)。還顯示了總trio印跡(trio)。(c)trio(wt)而不是trio(y2681f)刺激在基質(zhì)膠中的crc侵入。構(gòu)建克隆的rkoteton細(xì)胞系以多西環(huán)素(dox)-可誘導(dǎo)的方式同時(shí)表達(dá)abl1b-ha/dab1-flag與t7-trio(wt)或t7-trio(y2681f)，并且測定蛋白表達(dá)和基質(zhì)膠侵入。(d)不含細(xì)胞的rhogefgtp交換測定。表達(dá)trio(wt)蛋白，免疫沉淀，并且與重組rhoa和mant-gtp混合，mant-gtp在其與rho結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。三次測定的代表性結(jié)果。(e)trio(py2681)對rhogef活性是關(guān)鍵的。純化t7-標(biāo)記的trio(wt或y2681f)，并且確定其rhogef活性10分鐘。trio[ima]；從伊馬替尼處理的hek293t細(xì)胞純化的trio蛋白。(f)trio(g2699v)刺激rhogef活性。純化wt和g2699v突變體trio，并且如在(e)中那樣測定其rhogef活性。(g)trio(g2699v)對y2681處的tyr-磷酸化更敏感。wt或g2699vt7-trio與或不與abl1b-ha和dab1-flag同時(shí)表達(dá)。通過ip-wb分析trio中的py含量?？潭葪l，10μm。數(shù)據(jù)表示為平均值與sd。*p＜0.01，并且#p＜0.05。還參見圖12。圖8.notch信號(hào)傳導(dǎo)激活crc細(xì)胞中的rho從而刺激侵入(圖1的補(bǔ)充)。(a)rac抑制對crc通過基質(zhì)膠侵入幾乎沒有影響。在測定之前和過程中，將rko細(xì)胞用不同濃度的rac抑制劑nsc27366處理。(b)通過edta處理的notch受體激活。用10mmedta處理5分鐘后，用抗-notch1(c-term)抗體沉淀并檢測notch1和nicd。注意，用γ-分泌酶抑制劑dapt的處理抑制分解(cleavage)。(c)響應(yīng)于colon26小鼠crc細(xì)胞的edta處理的rho激活。在edta處理的指定時(shí)間點(diǎn)拉下活性rho。還分析了總rho。圖9.rbpj-依賴性和-不依賴性的notch信號(hào)傳導(dǎo)對于crc進(jìn)展是關(guān)鍵的(圖2的補(bǔ)充)人結(jié)腸細(xì)胞中的dab1表達(dá)。通過實(shí)時(shí)pcr定量dab1mrna的量。圖10.dab1和abl的酪氨酸磷酸化本身對rho激活和crc細(xì)胞侵入是必需的(圖4的補(bǔ)充)(a)src抑制劑pp2(10μm)對基質(zhì)膠侵入僅有較小的影響，而src-abl雙重抑制劑達(dá)沙替尼(dasatinib)(0.01μm)表現(xiàn)出對基質(zhì)膠中hct116細(xì)胞侵入的緊密抑制。*p＜0.01，#p＜0.04。(b)在apc/aes小鼠中在腸腫瘤中dab1與的abl相互作用。使用抗-abl和抗-dabl抗體通過蛋白質(zhì)印跡解析并檢測腫瘤裂解物的免疫沉淀物。圖11.人crc中trio(y2681)的磷酸化與差的預(yù)后相關(guān)(圖6的補(bǔ)充)tyr-磷酸化的trio的特異性抗體的驗(yàn)證。通過用合成的包含py1990或py2681的肽免疫兔產(chǎn)生抗體，將其親和純化，并且用于免疫細(xì)胞化學(xué)。將hek293t細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染t7-標(biāo)記的野生型(wt)、y1990f或y2681ftrio的表達(dá)質(zhì)粒與abl1b和dab1的表達(dá)質(zhì)粒。注意，抗-trio(py1990)和抗-trio(py2681)分別不能識(shí)別不可磷酸化的trio(y1990f)和trio(y2681f)突變體，如通過免疫熒光(數(shù)據(jù)未顯示)或蛋白質(zhì)印跡分析確定的。對于蛋白質(zhì)印跡分析，trio(4yfs)突變體用作tyr-磷酸化的陰性對照(第5道)。圖12.trio(y2681)的磷酸化刺激rhogef活性并且促進(jìn)crc細(xì)胞的侵入(圖7的補(bǔ)充)(a和b)用抗-trio(py2681)抗體免疫染色的直腸腺癌(a)及其向肺部的轉(zhuǎn)移(b)。注意，轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞包含比其原發(fā)性腫瘤更豐富的trio(py2681)信號(hào)。(c和d)用抗-trio(py2681)抗體免疫染色的結(jié)腸腺癌(c)與其向卵巢的轉(zhuǎn)移(d)。注意，轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞保持如在原發(fā)性腫瘤中的trio(py2681)。(e和f)食管鱗狀細(xì)胞癌(e)和胃腺癌(f)的trio(py2681)免疫組織化學(xué)。注意，癌細(xì)胞具有強(qiáng)的trio(py2681)染色(箭頭)。方形框出的區(qū)域在插入圖中被放大。mx，轉(zhuǎn)移?？潭葪l，100μm。圖13.人crc中的trio(y2681)的磷酸化與較差的預(yù)后相關(guān)。關(guān)于原發(fā)性crc樣品的trio(py2681)的疾病特異性存活的kaplan-meier分析。(a)當(dāng)合并所有階段的患者時(shí)(n＝339)，150個(gè)病例是trio(py2681)-低的，而189個(gè)病例是trio(py2681)-高的(在時(shí)序檢驗(yàn)中，p＜0.001)。(b)ii期亞群(n＝115)具有trio(py2681)-低(n＝45)和-高(n＝70)的患者(p＝0.015)。(c)iv期亞群(n＝57)具有trio(py2681)-低(n＝11)和-高的患者(n＝46)(p＝0.006)。圖14.人肺腺癌中trio(y2681)的磷酸化與較差的預(yù)后相關(guān)。關(guān)于原發(fā)性肺腺癌樣品的trio(py2681)的疾病-特異性存活的kaplan-meier分析。合并所有階段的患者(n＝214)，143個(gè)病例是trio(py2681)-低的，而71個(gè)病例是trio(py2681)-高的(在時(shí)序檢驗(yàn)中，p＝0.002)。圖15.人胃癌中trio(y2681)的磷酸化與較差的預(yù)后相關(guān)。關(guān)于原發(fā)性胃癌樣品的trio(py2681)的疾病-特異性存活的kaplan-meier分析。合并i-iii期患者(n＝172)，82個(gè)病例是trio(py2681)-低的，而90個(gè)病例是trio(py2681)-高的(在時(shí)序檢驗(yàn)中，p＜0.001)。圖16.人胰腺癌中trio(y2681)的磷酸化與較差的預(yù)后相關(guān)。關(guān)于原發(fā)性胰腺癌樣品的trio(py2681)和smad4的疾病-特異性存活的初級kaplan-meier分析。合并所有階段的患者(n＝20)，(在時(shí)序檢驗(yàn)中，分別地，p＝0.063和0.064)。盡管trio(py2681)和smad4在此處都表現(xiàn)出幾乎相同的p值，但是它們是統(tǒng)計(jì)學(xué)不相關(guān)的(p＝0.51)，這表明彼此是獨(dú)立的。實(shí)施方案描述用于本文時(shí)，″trio″是指所有哺乳動(dòng)物物種的天然trio，包括人trio。術(shù)語“天然的trio”包括天然存在的變體，例如，trio的交替剪接的變體和等位基因變體。用于本文時(shí)，“trio的2681位處的酪氨酸殘基”是指與seqidno：1的2681位處的酪氨酸殘基相對應(yīng)的天然trio中的酪氨酸殘基，在天然trio中，其可能不在2681位處。用于本文時(shí)，″trio(py2681)″是指這樣的trio，其中與seqidno：1的2681位處的酪氨酸殘基相對應(yīng)的酪氨酸殘基被磷酸化。用于本文時(shí)，癌癥的預(yù)后包括預(yù)測存活的持續(xù)時(shí)間、無復(fù)發(fā)存活的持續(xù)時(shí)間、無進(jìn)展存活的持續(xù)時(shí)間和易患或診斷患有癌癥的受試者轉(zhuǎn)移的可能性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥的預(yù)后是受試者在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后存活的持續(xù)時(shí)間。用于本文時(shí)，術(shù)語“受試者”和“患者”包括，但不限于，人，猴，兔，雞和小鼠。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者或患者是人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受試者或患者是已經(jīng)接受原發(fā)性腫瘤手術(shù)切除的人癌癥患者?！皹悠贰卑◤氖茉囌攉@得的多種樣品類型，并且包括實(shí)體組織樣品或來源于其的組織培養(yǎng)物或細(xì)胞。樣品可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法獲得，包括，但不限于，手術(shù)切除，吸出或活組織檢查，并且可以是新鮮的或冷凍的。術(shù)語“樣品”還包括在其獲取之后以任何方式操作的樣品，諸如通過用試劑處理，增溶化或針對某些成分(如蛋白或多核苷酸)富集，或包埋在半固體或固體基質(zhì)中用于切片目的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在手術(shù)去除腫瘤后，由受試者的癌性組織獲得樣品。所述癌性組織可以來源于內(nèi)窺鏡切除的息肉，或手術(shù)切除的原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤。優(yōu)選地，所述癌性組織通過手術(shù)切除由原發(fā)性腫瘤獲得。如在下述實(shí)例中所示，trio的2681位處的酪氨酸殘基的磷酸化與癌癥的轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且不僅在結(jié)直腸癌中而且在其他癌癥中檢測到trio(py2681)(圖7和12以及表2)。因此，本發(fā)明的方法可以用于多種癌癥。癌癥的實(shí)例包括結(jié)直腸癌(包括直腸癌和結(jié)腸癌)；下述器官的癌癥：腎上腺，血液(淋巴瘤)，骨，腦，乳腺，結(jié)直腸，子宮內(nèi)膜，食道，膽囊，腎，喉，肝，肺，口腔，卵巢，胰腺，前列腺，唾液腺，皮膚，小腸(gist)，軟組織，胃，睪丸，甲狀腺，膀胱，子宮頸；鱗狀細(xì)胞癌，子宮癌，黑素瘤，多發(fā)性骨髓瘤和b細(xì)胞淋巴瘤，頭頸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，和相關(guān)的轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自由下述組成的組：結(jié)直腸癌，乳腺癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自由下述組成的組：結(jié)直腸癌，乳腺癌，肺癌和胃癌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自由結(jié)直腸癌和胃癌組成的組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)直腸癌。結(jié)直腸癌(也稱作crc)基于癌癥生長入腸壁的程度、其是否到達(dá)附近的結(jié)構(gòu)以及其是否已經(jīng)擴(kuò)散到淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處的器官而分期(表1)。表1結(jié)直腸癌分期(htt：//www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/colon/patient/page2)如在下述實(shí)例中所示，使用trio(py2681)染色可以進(jìn)一步區(qū)分i和ii期crc患者中的兩個(gè)亞群。即，具有陰性py2681的那些表現(xiàn)出100％治愈(完全沒有復(fù)發(fā))，而具有py2681-陽性原發(fā)性腫瘤的那些在5年內(nèi)具有～20％的復(fù)發(fā)(圖6a，圖13b)。因此，對于按照目前的原則沒有進(jìn)行輔助化療的i和ii期患者，本發(fā)明的方法可以鑒定在手術(shù)后應(yīng)該考慮用輔助治療進(jìn)一步治療的患者。對于iii和iv期患者，本發(fā)明的方法可以有助于給更高風(fēng)險(xiǎn)的亞群分層。因此，本發(fā)明的方法可以用于被診斷患有i-iv期中任一期的結(jié)直腸癌的受試者，并且特別可用于被診斷患有i或ii期、特別是ii期結(jié)直腸癌的受試者。trio的2681位處的酪氨酸殘基的磷酸化可以通過抗-trio(py2681)抗體檢測。用于本文時(shí)，“抗-trio(py2681)抗體”是指特異性結(jié)合trio(py2681)的抗體?！疤禺愋越Y(jié)合trio(py2681)”的抗體是指與trio(py2681)結(jié)合但是不與2681位的酪氨酸殘基未被磷酸化的trio(本文也稱為“未磷酸化的trio(y2681)”)結(jié)合的抗體。磷酸化可以通過本領(lǐng)域公知的多種方法檢測，包括免疫組織化學(xué)測定，elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)和蛋白質(zhì)印跡分析。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用免疫組織化學(xué)測定。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品是從手術(shù)切除獲得的組織樣品，并被固定和包埋在石蠟等中。組織樣品可以通過常規(guī)方法固定(″manualofhistologicalstainingmethodofthearmedforcesinstituteofpathology(軍方病理學(xué)研究所組織染色法手冊)，″第3版，(1960)leeg.luna，ht(ascp)editor，theblakstondivisionmcgraw-hillbookcompany，newyork；thearmedforcesinstituteofpathologyadvancedlaboratorymethodsinhistologyandpathology(軍方病理學(xué)研究所組織學(xué)和病理學(xué)高級實(shí)驗(yàn)室方法)(1994)ulrekav.mikel，editor，armedforcesinstituteofpathology，americanregistryofpathology，washington，d.c.；這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在本文中)。例如，中性緩沖的福爾馬林，bouin′s或低聚甲醛，可以用于固定樣品。通常，樣品先被固定，然后通過遞增系列的醇脫水，浸潤并且用石蠟或其他切片介質(zhì)包埋，以使組織樣品可以被切片。備選地，可以將冷凍的組織切片并將所得到的切片固定。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織樣品可以通過常規(guī)方法在石蠟中包埋和處理。一旦組織樣品被包埋，樣品可以通過切片機(jī)等切片。切片厚度可以為約3微米至約5微米。在切片后，所述切片可以通過若干標(biāo)準(zhǔn)方法附著到載玻片上。載玻片粘合劑的實(shí)例包括，但是不限于，硅烷，明膠，聚-l-賴氨酸等。例如，石蠟包埋的切片可以附著到帶正電的載玻片和/或由聚-l-賴氨酸包被的載玻片上。如果已經(jīng)使用石蠟作為包埋物質(zhì)，則通常將組織切片脫石蠟并用水再水合。組織切片可以通過幾種常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)方法脫石蠟。例如，可以使用二甲苯和逐漸遞減系列的醇。備選地，可以使用商購的脫石蠟非有機(jī)試劑，如hemo-de7(cms，houston，texas)。在封閉步驟后，將組織切片暴露于與靶抗原(即trio(py2861))特異性結(jié)合的抗體達(dá)充分的時(shí)間并且在適于所述抗體與組織樣品中的靶抗原結(jié)合的條件下。適用于實(shí)現(xiàn)此的條件可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。所述抗體可以用放射性同位素、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記來標(biāo)記，以在沒有進(jìn)一步抗體相互作用的條件下可視化所述靶抗原。備選地，與靶抗原特異性結(jié)合的抗體可以用作一抗，與其一起的是與所述一抗結(jié)合的標(biāo)記的二抗。為了檢測癌癥組織中的trio(py2681)，可以使用細(xì)胞elisa(celisa)，其是elisa的一種改良。celisa可以在96孔板中進(jìn)行，其允許高通量結(jié)果。每個(gè)孔的底部附著有組織切片，所述組織切片然后被用去污劑滲透化處理。然后將樣品在孔中與trio(py2681)抗體一起溫育。將未結(jié)合的抗體洗掉后，然后使結(jié)合的一抗與酶連二抗結(jié)合，并再次洗掉未結(jié)合的抗體。然后通過偶聯(lián)的酶反應(yīng)的活性測量特異性結(jié)合的二抗的量(例如，schlosser，m.等，j.immunol.methods，140：101-109，1991，其通過引用結(jié)合在本文中)。從受試者獲得的樣品中trio的2681位的酪氨酸殘基的磷酸化可以通過將所述樣品與適當(dāng)?shù)膶φ諛悠繁容^進(jìn)行檢測。示例性的對照樣品包括陰性對照樣品(例如，來自健康受試者的非癌性組織或來自具有良好預(yù)后的癌癥患者的癌性組織)或陽性對照樣品(例如，來自具有差的預(yù)后的癌癥患者的癌性組織)。用于本文時(shí)，不存在磷酸化是指與陰性對照樣品觀察到的磷酸化水平相比不顯著的磷酸化水平。相反，存在磷酸化是指與陰性對照樣品觀察到的磷酸化水平相比顯著的磷酸化水平。在本發(fā)明中，不存在磷酸化表示良好的癌癥預(yù)后。在一個(gè)實(shí)施方案中，不存在磷酸化表示在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后長期存活的可能性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不存在磷酸化表示在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后5年內(nèi)不復(fù)發(fā)的可能性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不存在磷酸化表示在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后不需要輔助治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在磷酸化表示在手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤后需要輔助治療。輔助治療包括化療、放療、激素療法、靶向療法和生物療法，并且優(yōu)選是化療。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮到防止轉(zhuǎn)移，輔助治療是使用abl激酶抑制劑(諸如伊馬替尼)的化療。在不同的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供abl激酶抑制劑(諸如伊馬替尼)，其用于手術(shù)切除受試者中的原發(fā)性腫瘤后的輔助治療。優(yōu)選地，所述受試者是患有結(jié)直腸癌的人患者。用于本文時(shí)，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、單克隆抗體和抗體片段。“抗體”可以是在嚙齒動(dòng)物(小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔等)、鳥類(雞、鵪鶉、火雞等)、大哺乳動(dòng)物(山羊、綿羊、驢等)中產(chǎn)生的抗體，人抗體，嵌合抗體和人源化的抗體?？?trio(py2681)抗體可以使用來源于具有包含在2681位的磷酸化的酪氨酸的氨基酸序列的trio的肽作為免疫抗原進(jìn)行制備。所述肽的長度沒有特別限制，并且可以是5-30個(gè)氨基酸，優(yōu)選5-20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選8-15個(gè)氨基酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽具有seqidno：9的氨基酸序列。多克隆抗體可以通過常規(guī)方法制備，例如，在“antibodies：alaboratorymanual(抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊)”，lane，h.d.等編，coldspringharborlaboratorypress，newyork，1989中所述的方法，該文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在本文中。簡言之，多克隆抗體可以通過用上文所述的來源于trio的肽免疫動(dòng)物(如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、雞、鵪鶉、火雞、山羊、綿羊或驢)制備。單克隆抗體可以通過最先由kohler等，nature256：495(1975)(其通過引用結(jié)合于此)所述的雜交瘤法制備，或者可以通過重組dna法(美國專利號(hào)4,816,567，其通過引用結(jié)合于此)制備。單克隆抗體還可以使用例如clarkson等，nature352：624-628(1991)(其通過引用結(jié)合于此)或marks等，j.moi.biol.222：581-597(1991)(其通過引用結(jié)合于此)所述的技術(shù)從噬菌體抗體文庫分離。嵌合抗體是包含來源于非人的哺乳動(dòng)物(如小鼠)的抗體的重鏈和輕鏈上的可變區(qū)和來源于人抗體的重鏈和輕鏈上的恒定區(qū)的抗體。嵌合抗體可以通過以下方法獲得：將編碼小鼠抗體的可變區(qū)的dna與編碼人抗體的恒定區(qū)的dna連接，并且結(jié)合到表達(dá)載體中并引入用于抗體產(chǎn)生的宿主。人源化抗體由來源于非人哺乳動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和來源于人抗體的構(gòu)架區(qū)(fr)和恒定區(qū)組成。人源化抗體可以通過將來源于非人動(dòng)物(如小鼠)的抗體的cdr移接到人抗體的cdr中而獲得。具體地，通過pcr合成被設(shè)計(jì)成將小鼠抗體cdr與人抗體fr連接的dna序列，使用被構(gòu)建成具有cdr和fr二者末端的重疊位置的若干寡核苷酸作為引物。將得到的dna與編碼人抗體的恒定區(qū)的dna連接，然后將其結(jié)合到表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體被引入到宿主中并通過宿主表達(dá)，從而獲得所述抗體(歐洲專利ep239400；國際公布wo96/02576；這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在本文中)。用于獲得人抗體的方法也是已知的。例如，在體外將人淋巴細(xì)胞用需要的抗原或表達(dá)所述需要的抗原的細(xì)胞致敏，并將致敏的淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞(例如u266)融合，以獲得能夠與所述抗原結(jié)合的所需的人抗體(japan專利公布號(hào)h1-59878，其通過引用結(jié)合在本文中)。備選地，可以用需要的抗原免疫具有人抗體基因的全體成員的全部的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來獲得所需要的人抗體(國際公布wo93/12227，wo92/03918，wo94/02602，wo94/25585，wo96/34096和wo96/33735；這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在本文中)。此外，通過自人抗體文庫進(jìn)行淘選來選擇人抗體的技術(shù)也是已知的。例如，通過噬菌體展示法將人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scfv)在噬菌體表面上表達(dá)，并且選擇與所述抗原結(jié)合的噬菌體。分析所選擇的噬菌體的基因，以確定編碼與所述抗原結(jié)合的人抗體的可變區(qū)的dna的序列。一旦確定了與所述抗原結(jié)合的scfv的dna序列，可以制備包含所述序列的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，以產(chǎn)生人抗體。這些方法是公知的，并且記述在國際公布wo92/01047，wo92/20791，wo93/06213，wo93/11236，wo93/19172，wo95/01438和wo95/15388(這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合于此)中。抗體片段的實(shí)例包括fab，f(ab′)2，fv，具有一個(gè)fab和完整的fc的fab/c，和單鏈fv(scfv)，其中h鏈和l鏈的fv通過適當(dāng)?shù)慕宇^連接?？贵w片段可以通過用酶(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)處理抗體而獲得。備選地，構(gòu)建編碼這樣的抗體片段的基因并將其引入到表達(dá)載體中，并且在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)所述抗體片段(例如，參見co，m.s.等，j.immunol.(1994)152，2968-2976，better，m.&horwitz，a.h.methodsinenzymology(酶學(xué)方法)(1989)178，476-496，academicpress，inc.，plueckthun，a.&skerra，a.methodsinenzymology(酶學(xué)方法)(1989)178，476-496，academicpress，inc.，lamoyi，e.，methodsinenzymology(酶學(xué)方法)(1989)121，652-663，rousseaux，j.等，methodsinenzymology(酶學(xué)方法)(1989)121，663-669，bird，r.e.等，tibtech(1991)9，132-137；這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合于此)。用于本文時(shí)，“抗體”包括用多種分子如放射性同位素、熒光標(biāo)記和酶標(biāo)記中的任一種修飾的抗體。放射性同位素的實(shí)例包括35s，14c，125i，3h和131i。酶標(biāo)記的實(shí)例包括熒光素酶、熒光素、過氧化物酶(如辣根過氧化物酶)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等。熒光標(biāo)記的實(shí)例包括texasred，羅丹明(rhodamine)，熒光素，丹酰(dansyl)，麗絲胺(lissamine)，傘形酮，phycocrytherin，藻藍(lán)蛋白，或商購的熒光團(tuán)如spectrumorange7和spectrumgreen7和/或前述任一種或多種的衍生物，或熒光染料如alexafluor，cy3，cy5。所述抗體可以使用常規(guī)方法(currentprotocolsinimmunology(現(xiàn)代免疫學(xué)方法)，卷1和2，coligen等編.wiley-interscience，newyork，newyork，pubs.(1991)；methodsinenzym.(酶學(xué)方法)，73：147-166(1981)；這些參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合于此)用放射性同位素、熒光標(biāo)記或酶標(biāo)記標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定癌癥預(yù)后的診斷組合物，所述組合物包含本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的診斷組合物按照本發(fā)明所述的方法使用，所述診斷組合物可以與按照本文所述的本發(fā)明的方法的使用說明一起提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定癌癥預(yù)后的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的試劑盒按照本發(fā)明的方法使用。所述試劑盒可以是用于免疫組織化學(xué)測定、蛋白質(zhì)印跡分析或elisa的試劑盒。所述試劑盒可以包含其他可選的成分如一種或多種緩沖液(例如，封閉緩沖液，洗滌緩沖液，底物緩沖液等)，其他試劑如通過酶標(biāo)記化學(xué)改變的底物(例如，色原體)，和對照樣品(陽性和/或陰性對照)以及按照本文所述的本發(fā)明的方法使用的使用說明。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療結(jié)直腸癌的藥物組合物，所述藥物組合物包含abl抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于防止癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合物，所述藥物組合物包含abl抑制劑。所述轉(zhuǎn)移包括微轉(zhuǎn)移(micrometastasis)。癌癥的實(shí)例包括結(jié)直腸癌(包括直腸癌和結(jié)腸癌)；下述器官的癌癥：腎上腺，血液(淋巴瘤)，骨，腦，乳腺，結(jié)直腸，子宮內(nèi)膜，食道，膽囊，腎，喉，肝，肺，口腔，卵巢，胰腺，前列腺，唾液腺，皮膚，小腸(gist)，軟組織，胃，睪丸，甲狀腺，膀胱，子宮頸；鱗狀細(xì)胞癌，子宮癌，黑素瘤，多發(fā)性骨髓瘤和b細(xì)胞淋巴瘤，頭頸癌，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，和相關(guān)的轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥選自由下述組成的組：結(jié)直腸癌，乳腺癌，肺癌，胰腺癌和胃癌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自由下述組成的組：結(jié)直腸癌，乳腺癌，肺癌和胃癌。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自由結(jié)直腸癌和胃癌組成的組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥是結(jié)直腸癌。abl抑制劑的實(shí)例包括伊馬替尼(4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-n-[4-甲基-3-(4-(吡啶-3-基)-嘧啶-2-基氨基-)苯基]-苯甲酰胺)，尼羅替尼(nilotinib)(4-甲基n-[3-(4-甲基-1h-咪唑-1-基)-5-(三氟甲基)苯基]-3-[(4-吡啶-3-基嘧啶-2-基)氨基]苯甲酰胺)，帕納替尼(ponatinib)(3-(2-咪唑[1，2-b]噠嗪-3-基乙炔基)-4-甲基-n-[4-[(4-甲基哌嗪-1-基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)，達(dá)沙替尼(dasatinib)(n-(2-氯-6-甲基苯基)-2-[[6-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-2-甲基-4-嘧啶基]氨基]-5-噻唑甲酰胺一水合物)，伯舒替尼(bosutinib)(4-[(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈)和befatinib(inno-406)(n-[3-([5，5′-二嘧啶]-2-基氨基)-4-甲基苯基]-4-[[(3s)-3-(二甲基氨基)-1-吡咯烷基]甲基]-3-(三氟甲基)苯甲酰胺)或它們的藥用鹽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述abl抑制劑是伊馬替尼或其藥用鹽。伊馬替尼的藥用鹽包括藥用酸加成鹽，如例如與無機(jī)酸，如鹽酸、硫酸或磷酸的酸加成鹽，或與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)羧酸或磺酸的酸加成鹽，所述有機(jī)羧酸或磺酸例如脂族單-或二-羧酸，如三氟乙酸，乙酸，丙酸，羥基乙酸，琥珀酸，馬來酸，富馬酸，羥基馬來酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸或草酸，或氨基酸，如精氨酸或賴氨酸，芳香族羧酸，如苯甲酸，2-苯氧基-苯甲酸，2-乙酰氧基-苯甲酸，水楊酸，或4-氨基水楊酸，芳香族-脂族羧酸，如苦杏仁酸或肉桂酸，雜芳香族羧酸，如煙酸或異煙酸，脂族磺酸，如甲磺酸，乙磺酸或2-羥基乙磺酸，或芳香族磺酸，例如苯磺酸，對甲苯磺酸或萘-2-磺酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用伊馬替尼的單甲磺酸加成鹽，即，wo99/03854(其通過引用結(jié)合于此)中公開的甲磺酸伊馬替尼。以取決于物種、年齡、個(gè)體情況、給藥模式和談?wù)摰呐R床現(xiàn)象的日劑量將abl抑制劑施用于受試者。例如，abl抑制劑可以以約100-1000mg、優(yōu)選約200-600mg、更優(yōu)選約400-600、尤其是約400mg的日劑量施用給成年人。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物用于輔助治療。優(yōu)選地，所述輔助治療是在手術(shù)切除患者中的原發(fā)性腫瘤后的治療。本發(fā)明提供用于治療結(jié)直腸癌的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用abl抑制劑，并且提供防止癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用abl抑制劑。此外，本發(fā)明提供abl抑制劑用于制備用于治療結(jié)直腸癌的藥物的應(yīng)用，和abl抑制劑用于制備用于防止癌癥轉(zhuǎn)移的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的方法和應(yīng)用可以如關(guān)于本發(fā)明的藥物組合物所說明的那樣實(shí)施。在下述實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，下述實(shí)施例無一意欲限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)方法突變體小鼠、crc細(xì)胞和直腸內(nèi)移植產(chǎn)生并維持apc+/δ716突變體小鼠，如之前所述{oshima，1995}。如報(bào)道地那樣構(gòu)建apc+/δ716aesfloxed/floxedvcreert2(縮寫為apc/aes)小鼠以利用creert2敲除apc+/δ716小鼠中的aes，creert2的表達(dá)由腸上皮特異性的絨毛蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng){sonoshita，2011}。如報(bào)道那樣構(gòu)建rbpjfloxed等位基因{han，2002}，由rikenbrc獲得，并且與apc/aes小鼠雜交，以得到ap+/δ716aesfloxed/floxedrbpjfloxed/floxedvcreert2(apc/aes/rbpj)小鼠。構(gòu)建dab1floxed等位基因(imai等，在制備中)，并且與apc/aes小鼠雜交以獲得apc+/δ716aesfloxed/floxeddab1floxed/floxedvcreert2(apc/aes/dab1)小鼠。在12周齡時(shí)，分析復(fù)合突變體小鼠中的腫瘤組織病理學(xué)。對于abl抑制，將apc/aes小鼠自其3周齡時(shí)起用伊馬替尼(lclaboratories)以50mg/kg/天(i.p.)的劑量處理9周，所述劑量抑制bcr-abl-轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系在移植的小鼠中的腫瘤發(fā)生活性{buchdunger，2001}。對于每種突變體基因型，將來自5只小鼠的總共～100個(gè)直徑大于2mm的腫瘤評分。crc細(xì)胞系從atcc獲得。在移植到直腸平滑肌中后，crc細(xì)胞在一周內(nèi)形成可見的原發(fā)性腫瘤。六周后，對小鼠進(jìn)行安樂死，并且在熒光顯微鏡(leica)下檢查轉(zhuǎn)移灶。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都按照由京都大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和應(yīng)用委員會(huì)核準(zhǔn)的程序進(jìn)行?；钚詒ho拉下測定通過按照供應(yīng)商的程序使用rho激活測定試劑盒(thermo)將gtp-rho拉下并檢測。簡言之，用裂解緩沖液裂解組織或crc細(xì)胞，并且用rhotekin將裂解物中的gtp-rho拉下，并在western分析中通過抗-rho抗體進(jìn)行檢測。rdll4實(shí)驗(yàn)用pbs重懸重組dll4(rdll4)(r&d)。對于刮擦和gtp-rho拉下測定，將1μg放到6孔培養(yǎng)板中以用rdll4以0.1μg/cm2包被其表面。對于q-rt-pcr測定，平板表面用rdll4以0.1-1μg/cm2包被。在4度過夜孵育后，將所述平板用pbs洗滌一次，并用crc細(xì)胞涂板。對于hes1和dab1的表達(dá)分析，將細(xì)胞裂解，并且在四小時(shí)后提取mrna。刮擦(scratch)測定如所述構(gòu)建colon26teton-aes-flag細(xì)胞，從而通過多西環(huán)素誘導(dǎo)flag-標(biāo)記的aes的表達(dá)(sonoshita等，2011)。將細(xì)胞鋪板到用rdll4包被的培養(yǎng)皿上，進(jìn)行培養(yǎng)直到它們接近匯合(subconfluent)，并且在刮擦之前用多西環(huán)素處理16小時(shí)。進(jìn)行刮擦后四小時(shí)，收集細(xì)胞用于活性rho的拉下測定?；|(zhì)膠侵入和tem測定在基質(zhì)膠侵入和tem測定之前，將培養(yǎng)的癌癥細(xì)胞用c3t(cytoskeleton)，y-27632(wako)，nsc27366，pp2(calbiochem)，伊馬替尼或達(dá)沙替尼(lclaboratories)處理16小時(shí)。如之前所述使用基質(zhì)膠(bd)進(jìn)行基質(zhì)膠侵入測定{sonoshita，2011}。對于tem測定，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)接種在transwell(coming)的上室中。一天(24h)后，將egfp-標(biāo)記的crc細(xì)胞鋪板到huvec層上。24小時(shí)后，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移到膜的低側(cè)的crc細(xì)胞。通過edta的notch受體激活將培養(yǎng)的crc用pbs洗滌，用在pbs中的10mmedta處理2分鐘，并且在培養(yǎng)基中再次溫育。已經(jīng)顯示該處理通過促使notch胞外結(jié)構(gòu)域的脫落而激活notch受體(rand等，2000；tiyanont等，2011)。在溫育指定的時(shí)間后，將細(xì)胞裂解，并且檢測裂解的notch和gtp-rho。將dapt(calbiochem)施用到培養(yǎng)的crc細(xì)胞以抑制其γ-分泌酶活性。敲低實(shí)驗(yàn)通過使用hiperfect轉(zhuǎn)染試劑(qiagen)將sirna寡聚物(qiagen)轉(zhuǎn)染到crc細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染四十八小時(shí)后，對細(xì)胞進(jìn)行基質(zhì)膠侵入、gtp-rho拉下或基因表達(dá)測定。對于移植實(shí)驗(yàn)，將dab1的敲低序列(shdab1#1：aaggattaagtaggatgtcaa(seqidno：2)，shdab1#2：ccggtacaaagccaaattgat(seqidno：3))分別插入到plb載體(addgene)中。然后，制備慢病毒顆粒，并感染到ls174t細(xì)胞中，以得到組成型dab1敲低的egfp+細(xì)胞。如之前所述得到穩(wěn)定的rbpj的敲低克隆(sonoshita等，2011)。附著(attachment)測定按照確定的程序{reymond，2012}進(jìn)行附著測定。簡言之，將人肺內(nèi)皮細(xì)胞鋪板到膠原蛋白包被的培養(yǎng)皿上。在其達(dá)到匯合從而形成層后，將egfp標(biāo)記的crc細(xì)胞鋪板到其上。十五分鐘后，用pbs洗掉漂浮的細(xì)胞，并且在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)粘附到內(nèi)皮層上的crc細(xì)胞的數(shù)目。dab/dab1/dab1啟動(dòng)子分析從ucsc基因組瀏覽數(shù)據(jù)庫(http：//genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway)提取蠅(fly)dab，小鼠dab1，和人dab1啟動(dòng)子。通過如之前所述的基于文本的搜索(text-basedsearch)進(jìn)行對高-和低-親和性su(h)/rbpj結(jié)合位點(diǎn)的圖表分析(nellesen等，1999)。定量pcr(q-pcr)用于定量hes1、dab1、abl1和abl2mrna的taqman引物/探針購自abi。按照公開的程序(kakizaki等，2010)使用crc細(xì)胞和抗-rbpj(instituteofimmunology)和抗-nicd(cellsignalingtechnology)抗體進(jìn)行chip分析。使用hhes1chip.f(cgtgtctcctcctcccatt)(seqidno：4)和hhes1chip.r(gaacggctcgtgtgaaactt)(seqidno：5)引物通過sybrgreen(abi)檢測沉淀的基因組dna的片段對hes1基因啟動(dòng)子區(qū)的富集，所述引物將rbpj的高親和性結(jié)合序列夾在中間。類似地，通過hdab1chip.f2(caagctctgtgcttgtctca)(seqidno：6)和hdab1chip.r2(gtagctgtgtggtcttatca)(seqidno：7)引物定量dab1啟動(dòng)子片段的富集。免疫組織化學(xué)按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備冷凍和石蠟包埋的小鼠組織。人crc組織(n＝102，0-4期)用京都大學(xué)倫理委員會(huì)核準(zhǔn)的程序切割自在2005至2007年間在京都大學(xué)醫(yī)院在知情同意的情況下進(jìn)行手術(shù)的患者。在該研究中還使用人組織陣列切片(humantissuearrayslides)(superbiochips)用于分析轉(zhuǎn)移的crc和其他類型的癌癥。將切片用h&e染色或者與對dab1(sigma)、aes(sonoshita等，2011)、trio(py1990)或trio(py2681)特異的一抗(按照下文所述制備)一起孵育，然后與alexafluor(molecularprobes)綴合的或生物素化的二抗(vectorlaboratories)一起孵育。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)將野生型dab1cdna(由kamonsanada，theuniversityoftokyo，japan提供)插入到pmx-ires-egfp(由toshiokitamura，theuniversityoftokyo，japan提供)中。制備反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒并將其感染到rko細(xì)胞中，并驗(yàn)證egfp+細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)dab1。免疫沉淀-western分析由人結(jié)腸cdna庫制備abl1bcdna，并且用血凝素(ha)序列標(biāo)記，以構(gòu)建abl1b-ha。將野生型cdna通過quikchangelightning多位點(diǎn)定向誘變試劑盒(agilent)誘變，以得到激酶-死亡(kinase-dead)abl1b(k290r)-ha突變體。將這些abl1b構(gòu)建體置于pefbosneo表達(dá)載體(由shigekazunagata，kyotouniversity，japan提供)中。將dab1-flagcdna插入到pcdna3(invitrogen)中。將triocdna(由annedebant，crbm-cnrs，france提供)用t7序列標(biāo)記，并且插入到攜帶cag啟動(dòng)子和兔β-球蛋白聚(a)的pcx表達(dá)載體(由masaruokabe，osakauniversity，japan提供)中。nicd-myc表達(dá)載體由tasukuhonjo，kyotouniversity，japan提供。將這些表達(dá)載體用lipofectamineltx(invitrogen)轉(zhuǎn)染到crc或hek293t細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后十六小時(shí)，將細(xì)胞在裂解緩沖液(10mmtris-cl，1mmedta，150mmnacl和1％np-40)中裂解。將上清與綴合有抗-ha、flag、t7或myc抗體(mbl)的瓊脂糖混合。將珠子用裂解緩沖液洗滌，然后在sds樣品緩沖液中煮沸。洗脫的蛋白通過sds-page分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，并且用針對ha、flag、myc、磷酸酪氨酸(py；cellsignalingtechnology)、trio(py2681)或t7(novagen)的抗體探測。用抗-notch1(santacruz)免疫沉淀內(nèi)源性的notch1，并在western分析中用相同的抗體探測。分別用抗-dab1或抗-trio抗體(santacruz)從小鼠腸裂解物免疫沉淀內(nèi)源性的dab1或trio。trio誘變通過netphos2.0在線軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/netphos/)(blom等，1999)預(yù)測trio中可能的tyr磷酸化位點(diǎn)。在候選中，我們通過quikchangelightning多位點(diǎn)定向誘變試劑盒(agilent)將具有高概率的18個(gè)tyr誘變成phe，以產(chǎn)生yf不可磷酸化的突變體。使用相同的試劑盒將人癌癥中trio的各個(gè)點(diǎn)突變引入到野生型trio中。通過dna測序和western分析證實(shí)構(gòu)建體的完整性。制備抗-trio(py1990)和抗-trio(py2681)抗體在scrum(japan)合成肽1985-1994vrdlg(py)vveg(seqidno：8)和2676-2686npnyi(py)dvppe(seqidno：9)，并且將其注射到兔中。通過elisa驗(yàn)證其效價(jià)后，使用固定的抗原和未磷酸化的對應(yīng)肽親和純化每種抗體。免疫細(xì)胞化學(xué)將hct116細(xì)胞用針對t7-trio、abl1bha和dab1-flag的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并且接種到腔式載玻片(thermo)上。溫育16小時(shí)后，將細(xì)胞用在pbs中的3.7％甲醛固定5分鐘，用包含0.1％tritonx-100的pbs滲透化處理5分鐘，然后在5％正常的驢血清中封閉30分鐘。然后，將樣品與對t7和tyr-磷酸化的trio特異的一抗在室溫溫育1小時(shí)。用pbs洗滌三次后，將其與alexafluor-綴合的二抗溫育。將樣品用pbs洗滌，然后用具有dapi的vectashieldmountingmedium(vectorlabs)封固在玻璃載玻片上。構(gòu)建rkoteton細(xì)胞將rko細(xì)胞用pcmv-tet3g(clontech)轉(zhuǎn)染，并且建立g418(nacalai)抗性克隆。通過其響應(yīng)于多西環(huán)素(clontech)而誘導(dǎo)熒光素酶的能力選擇“母本”teton克隆。然后，將此種母本株系用編碼abl1b-ha和dab1-flag的cdna的ptre3g載體(clontech)轉(zhuǎn)染，以建立雙重可誘導(dǎo)的“rkotetonabl1b-ha/dab1-flag”細(xì)胞。隨后，將它們用攜帶t7-triocdna的ptre3g轉(zhuǎn)染，以構(gòu)建三重可誘導(dǎo)的“rkotetont7-trio/abl1b-ha/dab1-flag”細(xì)胞。體外rhogef交換測定首先，我們用t7-trio(wt，y2681f或g2699v)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞，并且使用綴合抗-t7抗體(mbl)的瓊脂糖從細(xì)胞裂解物中拉下各種trio蛋白。然后，我們將trio級分與重組rhoa在mant-gtp(cytoskeleton)存在下混合，mant-gtp在與rho小gtp酶結(jié)合時(shí)發(fā)射較強(qiáng)的熒光(rossman等，2002)。數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)使用spss(ibm)通過student’st或卡方檢驗(yàn)分析，并且表示為平均數(shù)土sd。p值＜0.05認(rèn)為是顯著性的。結(jié)果rbpj對于腸腫瘤侵入是關(guān)鍵的如我們最近已經(jīng)顯示的，侵入性和內(nèi)滲入血管(intravasating)的腫瘤在apc和aes基因的復(fù)合突變體小鼠(縮寫為apc/aes小鼠)的腸中發(fā)展(圖1a，左){sonoshita，2011}。盡管aes抑制crc中notch-依賴性的轉(zhuǎn)錄，但是由失去aes阻遏的notch信號(hào)傳導(dǎo)是怎樣刺激腸腫瘤進(jìn)展的還是不清楚。作為notch信號(hào)傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，rbpj(在人中為akacbf1)在靶基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用{artavanis-tsakonas，1999}。為了確定rbpj在內(nèi)源性crc進(jìn)展中的作用，我們將rbpj無效突變{han，2002}以腸上皮特異性方式引入到apc/aes雙重突變體小鼠中，并且構(gòu)建apc/aes/rbpj三重突變體小鼠。有趣的是，敲除rbpj顯著減少腫瘤侵入和內(nèi)滲，而不影響其尺寸或數(shù)量(圖1a和b，數(shù)據(jù)未顯示)，這表明rbpj在通過notch靶基因轉(zhuǎn)錄的crc進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。notch信號(hào)傳導(dǎo)通過rho激活刺激crc細(xì)胞的侵入和透內(nèi)皮遷移(tem)我們接著研究了notch信號(hào)傳導(dǎo)下游的促進(jìn)crc侵入和內(nèi)滲的效應(yīng)子。rho家族小gtp酶是被充分表征的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)劑，其表現(xiàn)為是癌癥轉(zhuǎn)移所必需的{hall，1998；hall，2009；weinberg，2007}。因此，我們首先利用拉下測定研究了良性(apc)和侵入性(apc/aes)結(jié)腸腫瘤中rho、rac和cdc42的激活狀態(tài)。我們發(fā)現(xiàn)，在來自apc/aes復(fù)合突變體小鼠的腸腫瘤的裂解物中，盡管rac或cdc42的水平不受影響或低于檢測界限(數(shù)據(jù)未顯示)，但是，gtp-結(jié)合的(即，活性形式)rho的水平顯著增加(圖1c)。已知notch配體蛋白的重組細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域如果固定在固體表面上能夠激活notch信號(hào)傳導(dǎo){varnum-finney，2000}(還參見下圖2h和2i)。我們還已經(jīng)報(bào)道了在刮擦測定中，固定的dll4重組胞外部分(rdll4)刺激crc細(xì)胞的遷移。在colon26teton-aes-flag細(xì)胞中，多西環(huán)素誘導(dǎo)的aes抑制notch信號(hào)傳導(dǎo)，減少在刮擦測定中的遷移{sonoshita，2011}。在刮擦后該細(xì)胞系的遷移期間，我們發(fā)現(xiàn)通過引入aes而被顯著抑制的rho的～1.7倍的激活(圖1d)。這些結(jié)果表明notch信號(hào)傳導(dǎo)激活rho從而加速crc進(jìn)展。我們已經(jīng)報(bào)道crc細(xì)胞以notch信號(hào)傳導(dǎo)依賴性方式侵入到基質(zhì)膠(小鼠中產(chǎn)生的胞外基質(zhì)的混合物)中{sonoshita，2011}。有趣的是，rho抑制劑c3t或rock抑制劑y-27632以劑量依賴性方式抑制rko人crc細(xì)胞(圖1e和f)以及另一種人crc細(xì)胞系hct116(數(shù)據(jù)未顯示)的基質(zhì)膠侵入和tem。另一方面，用特異性的抑制劑nsc23766抑制rac不影響培養(yǎng)物中的crc細(xì)胞侵入(圖8a)。這些結(jié)果表明通過notch信號(hào)傳導(dǎo)激活rho對于crc侵入是關(guān)鍵的。為了確定rho激活的時(shí)間表(chronology)，我們用10mmedta處理rko細(xì)胞2分鐘以誘導(dǎo)notch受體的構(gòu)象變化，并且允許隨后由γ-分泌酶在s3位點(diǎn)切割{rand，2000；tiyanont，2011}。如預(yù)測的，我們在edta處理后檢測到分解的受體nicd，其由γ-分泌酶抑制劑(gsi)dapt阻斷(圖8b)。與rbpj-誘導(dǎo)的靶基因表達(dá)的時(shí)間表一致，我們在edta處理后6-12小時(shí)觀察到強(qiáng)rho激活(圖1g)。有趣的是，我們還注意到早在edta處理后5分鐘的暫時(shí)和中等的rho激活(圖1g)。該早期激活在5-10分鐘內(nèi)達(dá)到峰值，并且在4小時(shí)內(nèi)逐漸降低(圖1g和h)。使用colon26和cmt93小鼠crc細(xì)胞，以及使用dld1，sw480和ls174t人crc細(xì)胞獲得相似的結(jié)果(圖8c，數(shù)據(jù)未顯示)。與這些結(jié)果一致，固定在培養(yǎng)皿表面上的rdll4配體也激活培養(yǎng)的crc細(xì)胞中的rho(圖1i)。此外，當(dāng)notch受體表達(dá)被敲低時(shí)(圖1j)或當(dāng)notch受體激活被dapt抑制時(shí)(圖1k)，rho激活被抑制。共同地，這些數(shù)據(jù)表明通過配體依賴性的notch受體激活的rho激活的兩個(gè)不同階段；早期(在數(shù)分鐘之內(nèi))和晚期(＞6小時(shí))反應(yīng)，其分別獨(dú)立于和依賴于rbpj介導(dǎo)的靶基因的轉(zhuǎn)錄(見下文)。早期反應(yīng)：crc細(xì)胞中rho的激活對于其與ec的粘附是關(guān)鍵的為了起始內(nèi)滲和外滲，癌細(xì)胞需要粘附到血管內(nèi)襯并且通過其遷移{miles，2008；weinberg，2007}。我們之前報(bào)道ec刺激毗鄰的crc細(xì)胞的notch信號(hào)傳導(dǎo){sonoshita，2011}。因此，我們假設(shè)在與ec接觸后通過notch信號(hào)傳導(dǎo)在crc細(xì)胞中rho立即被激活，從而加強(qiáng)附著。如預(yù)期的，在鋪板后15分鐘在洗滌后，c3t(rho抑制劑)或dapt(gsi)減少保持附著于ec層的crc的數(shù)目(圖2a)。重要的是，在crc細(xì)胞中的rbpj敲低(圖2b)不影響早期rho激活或與ec的粘附(圖2c和2d)。一致地，甚至當(dāng)敲低rbpj時(shí)，dapt阻止crc細(xì)胞的ec細(xì)胞粘附(圖2d)。這些結(jié)果表明，在早期notch受體裂解激活rho，從而促使crc細(xì)胞與ec以不依賴rbpj的方式粘附。晚期反應(yīng)：rbpj轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)disabled1(dab1/dab1)表達(dá)并激活rho與早期反應(yīng)不同，我們發(fā)現(xiàn)，晚期反應(yīng)通過rbpj-敲低被顯著抑制(圖2e)。因此，我們推測rbpj靶基因的表達(dá)對于rho的晚期激活是必要的，并且該激活幫助crc細(xì)胞在其初始附著到ec上之后的內(nèi)滲和外滲。最近，98種基因被報(bào)道為nicd轉(zhuǎn)基因小鼠中的rbpj靶標(biāo){li，2012}。有趣的是，其中的3種基因在果蠅(drosophila)中也通過notch信號(hào)傳導(dǎo)被誘導(dǎo){krejcí，2009}。它們是disabled1(dab1)(在果蠅中失效的)，notch1(notch)和hes1/5(e(spl))基因(圖2f)。我們在本研究中聚焦于dab1，因?yàn)樵谀X發(fā)育過程中，dab1增強(qiáng)神經(jīng)元運(yùn)動(dòng)性{sanada，2004，hashimoto-torii，2008}。我們發(fā)現(xiàn)人dab1和小鼠dab1基因都在其鄰近的啟動(dòng)子區(qū)域中包含高親和性rbpj結(jié)合序列基序，如在果蠅中一樣(圖2g)，這表明rbpj的進(jìn)化保守的轉(zhuǎn)錄{dowell，2010}。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)hes1引起crc細(xì)胞的大量死亡(數(shù)據(jù)未顯示)。為了研究notch受體激活對dab1表達(dá)的影響，我們將固定的rdll4應(yīng)用到ls174t人crc細(xì)胞，該細(xì)胞在人crc細(xì)胞系中具有大量的dab1mrna水平(圖9)。我們發(fā)現(xiàn)rdll4以劑量依賴性方式增加dab1mrna的表達(dá)，而dapt對其抑制(圖2h)。另外，rbpj優(yōu)先結(jié)合dab1基因啟動(dòng)子(圖2g和2i)。nicd還富集于啟動(dòng)子dna片段中，這表明notch激活(transactivation)復(fù)合物誘導(dǎo)dab1表達(dá)。使用另一種crc細(xì)胞系colo205獲得相似的結(jié)果，該細(xì)胞系也表達(dá)相對豐富的dab1(圖s2，數(shù)據(jù)未顯示)。我們還發(fā)現(xiàn)在notch信號(hào)傳導(dǎo)被激活時(shí)的apc/aes小鼠中的crc中的顯著的dab1誘導(dǎo){sonoshita，2011}，但是在apc小鼠的腺瘤中沒有發(fā)現(xiàn)(圖2j)?？傊?，這些結(jié)果表明dab1是crc細(xì)胞中notch轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)之一。dab1可以通過rho激活刺激crc侵入和轉(zhuǎn)移為了確定dab1在crc進(jìn)展中的作用，我們將dab1的純合無效突變另外引入到apc/aes小鼠中，并且構(gòu)建apc/aes/dab1三重突變體小鼠。顯著地，我們發(fā)現(xiàn)dab1突變抑制腸腫瘤的侵入和內(nèi)滲(圖3a和3b)。為了驗(yàn)證dab1在crc中的促轉(zhuǎn)移作用，我們還構(gòu)建了克隆ls174t衍生物，其中dab1表達(dá)被組成型地敲低(圖3c)。將其移植到裸鼠直腸中后，我們發(fā)現(xiàn)，與對照細(xì)胞相比，在dab1敲低細(xì)胞的情況下，肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目顯著減少(圖3d和3e)。另一方面，dab1在rko(低表達(dá)crc細(xì)胞系之一)(圖9)中的表達(dá)增加從直腸到肺的轉(zhuǎn)移(圖3f，3g和3h)。重要的是，在dab1敲低的crc細(xì)胞中，早期和晚期rho激活反應(yīng)都被抑制(圖3i)。另一方面，單獨(dú)表達(dá)dab1足以組成型地激活rho。rho的早期激活也被dab1表達(dá)加強(qiáng)(圖3j)。我們還注意到，在通過edta的notch激活后約4小時(shí)，在對照非沉默crc細(xì)胞中dab1mrna被誘導(dǎo)，但是在rbpj敲低的crc細(xì)胞中卻沒有(圖3k)?？傊?，強(qiáng)烈表明，在notch切割后的早期，內(nèi)源性dab1激活rho，并且然后，rbpj誘導(dǎo)的dab1有助于晚期和持久的rho激活。這種解釋與rbpj的敲低僅減弱晚期而不是早期rho激活的結(jié)果相符(圖2c和2e)。dab1激活在notch介導(dǎo)的rho激活和crc侵入中起重要作用的酪氨酸激酶abl在分化的小鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞中，dab1被鑒定為是結(jié)合src家族酪氨酸激酶(包括src和fyn，以及abelson(abl))的蛋白之一{howell，1997}。在果蠅中，notch受體基因(n)在軸突引導(dǎo)下與abl遺傳相互作用{giniger，1998}。酪氨酸激酶的abl亞家族在進(jìn)化上保守，在哺乳動(dòng)物中包括abl1和abl2(也稱為arg)，并且在多種生理和病理過程(如細(xì)胞增殖和遷移)中起多效性作用{colicelli，2010}。因此，我們假設(shè)dab1通過激活abl而促進(jìn)crc轉(zhuǎn)移。為了確定abl在內(nèi)源性crc進(jìn)展中可能的作用，我們用abl抑制劑伊馬替尼(也稱為glivec{buchdunger，2001；sawyers，2003})處理apc/aes小鼠，并且發(fā)現(xiàn)在腫瘤尺寸或數(shù)目不改變的情況下crc侵入的顯著抑制(圖4a和4b)。一致地，敲低abl1和/或abl2基因(圖4c，下圖)顯著減少rko細(xì)胞的基質(zhì)膠侵入(圖4c，上圖)。并且，rho激活被雙重abl1/abl2敲低抑制(圖4d)。類似地，伊馬替尼以劑量依賴性方式阻斷由edta誘導(dǎo)的侵入和rho激活(圖4e和4f)。我們還發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼(abl和src二者的雙重抑制劑)也顯著地抑制侵入(圖10a)。盡管src在晚期crc病例的亞組中被高度激活{weinberg，2007b}，但是我們發(fā)現(xiàn)src家族抑制劑pp2對培養(yǎng)物中的rko細(xì)胞侵入僅有較小的作用(～20％)(圖10a)。重要地，用hct116細(xì)胞獲得相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明abl在rho激活和crc進(jìn)展中具有notch下游的作用。在神經(jīng)元和hek293細(xì)胞中，dab1增強(qiáng)fyn的激酶活性{arnaud，2003；bock，2003}。然而，在我們對crc侵入的測定中，src家族抑制劑pp2僅表現(xiàn)出小的抑制(圖10a)。因此，我們想知道dab1是否與abl1b(abl1主要的且充分表征的剪接變體{hantschel，2004，colicelli，2010})相互作用從而刺激crc侵入。已知abl磷酸化自身以得到最大的激酶活性{hantschel，2004}。我們發(fā)現(xiàn)同時(shí)表達(dá)dab1以劑量依賴性方式增加tyr-磷酸化的abl1b(py-abl1b)的水平(圖4g；比較第4-6道)。在神經(jīng)元中，tyr-磷酸化的dab1(py-dab1)是其遷移所必需的，原因在于，遷移被5yf-dab1突變體(其中五個(gè)tyr殘基被結(jié)構(gòu)相似但是不可磷酸化的phe替換)的表達(dá)所削弱{sanada，2004}。在表達(dá)5yf-dab1的crc細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)py-abl1b水平保持低(圖4g；第7道)，這表明abl激活依賴于py-dab1。我們還發(fā)現(xiàn)野生型dab1在abl1b存在下被tyr-磷酸化，而5yf-突變體則不(圖4g；第5-7道)。可以想到的是，abl1b直接tyr-磷酸化dab1，因?yàn)樵谛∈竽c腫瘤和培養(yǎng)的細(xì)胞中abl和dab1彼此物理相互作用(圖10b和howell，1997)。與這一解釋相一致的，在存在abl1b的激酶-死亡(kd)突變體的情況下，dab1不被磷酸化(k290r；barila，2000)(圖4g；第9-10道)。這些結(jié)果共同說明dab1在體內(nèi)在存在abl的情況下被磷酸化，并且py-dab1作為notch受體的下游效應(yīng)子之一相互地激活abl從而刺激crc侵入。我們提出abl活性是針對crc的惡性進(jìn)展的新的治療靶標(biāo)。triorhogef在dab1和abl存在下被tyr-磷酸化，并且促進(jìn)crc侵入在蠅神經(jīng)元遷移中，果蠅三功能結(jié)構(gòu)域(dtrio)作為dabl的下游效應(yīng)子起關(guān)鍵作用{forsthoefel，2005}。trio屬于可以激活rho家族小gtp酶的gef蛋白的dbl家族，并且是其唯一攜帶兩個(gè)gef結(jié)構(gòu)域的成員；一個(gè)用于rac(gef1)而另一個(gè)用于rho(gef2)(圖5a){debant，1996；bateman；2001，vigil；2010}。已經(jīng)表明triogef1在果蠅中激活rac并且引起神經(jīng)元遷移{song，2012}。由于在apc/aes小鼠crc中rac保持未激活，并且其抑制對crc侵入幾乎沒有影響(圖8a，數(shù)據(jù)未顯示)，我們聚焦于crc侵入中通過trio的rho激活。即，我們首先敲低hct116細(xì)胞中的triomrna表達(dá)，并且在用edta激活notch受體后確定gtp-rho的水平。顯著地，trio敲低引起gtp-rho水平和基質(zhì)膠侵入能力的顯著減少(圖5b和5c)。我們使用rko細(xì)胞也獲得基本上相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，在notch受體激活的細(xì)胞中，trio通過rho激活在crc侵入中起重要作用。由于在果蠅s2細(xì)胞中dtrio在dabl存在下被tyr-磷酸化{forsthoefel，2005}，我們假設(shè)abl在crc細(xì)胞中也引起trio的tyr-磷酸化，并且增加其rho活性。如假設(shè)的，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的abl1b略微增加crc細(xì)胞中的py-trio水平(圖5d，第3道)。有趣的是，當(dāng)abl1b與野生型dab1共同表達(dá)而不與5yf突變體dab1共同表達(dá)時(shí)，py-trio的水平顯著增加(圖5d，第4-5道)。另一方面，激酶-死亡的(kd)abl1b突變體不能增加py-trio水平(圖5d，第6-7道)。這些結(jié)果共同表明trio的tyr-磷酸化依賴于abl的激酶活性。為了確定abl在trio中特定的靶標(biāo)tyr殘基，我們首先用在線netphos2.0軟件{blom，1999}篩選trio的一級氨基酸序列。其預(yù)測所有61個(gè)tyr殘基的磷酸化的可能性，并且鑒定出30個(gè)作為可能的候選，其具有高于0.5的閾值的得分。我們成功構(gòu)建trio突變體，其中它們中的18個(gè)被單獨(dú)地或組合地轉(zhuǎn)化為phc(圖5a中的yf突變體)。然后，我們研究yf突變是否影響trio蛋白整體上的體內(nèi)py水平，并且發(fā)現(xiàn)，與trio(wt)相比，trio(18yfs)表現(xiàn)出顯著減少的py水平(圖5e，第1-2道)。盡管trio(7yfs-a)和trio(7yfs-b)與對照trio(wt)類似地被tyr-磷酸化，但是在位置1990，2562，2681和2757包含另外的四個(gè)yf突變的trio(11yfs)具有顯著減少的py水平(圖5e，第3-5道)。對于僅這另外四個(gè)酪氨酸被突變的trio(4yfs)突變體，我們觀察到py水平的相似減少(圖5e，第6道)。在這四個(gè)酪氨酸中，我們鑒定y1990和y2681作為在abl-dab1存在下的磷酸化的關(guān)鍵靶標(biāo)，因?yàn)閥1990f和y2681f突變體僅表現(xiàn)出適度的py水平(圖5f，分別為第2和4道)。trio(py2681)甚至有助于在i期和ii期給具有差的預(yù)后的crc患者分級為了確定trio磷酸化的臨床相關(guān)性，我們研究了在人原發(fā)性crc樣品中y1990和/或y2681是否被磷酸化。為此，我們分別產(chǎn)生了針對trio(py1990)和trio(py2681)的特異性抗體(圖11)。然而，在trio(py1990)-陽性和-陰性crc患者之間，存活率沒有太多區(qū)別(p＝0.9，數(shù)據(jù)未顯示)。有趣的是，與攜帶trio(py2681)-陰性crc的患者相比，攜帶trio(py2681)-陽性crc的患者表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的存活減少(包括所有期，n＝102，卡方檢驗(yàn)中p＝0.01；圖6a，左圖)。當(dāng)我們聚焦于i和ii期時(shí)，合并的trio(py2681)-陰性crc患者具有完全的(100％)治愈，而陽性患者在5年內(nèi)表現(xiàn)出～20％的死亡(n＝63，p＝0.04；圖6a，中圖)。甚至對于單獨(dú)的ii期患者(n＝46)，在trio(py2681)-陽性患者與-陰性亞群之間觀察到相似的分布(p＝0.1；圖6a，右圖)。即，trio(py2681)-陰性crc患者如果在i或ii期被切除后沒有復(fù)發(fā)。因此，trio(y2681)的磷酸化狀態(tài)幫助預(yù)測患者預(yù)后，其具有的準(zhǔn)確性大于其他生物標(biāo)記物{salazar，2010}。與附近的正常粘膜或淋巴樣濾泡相比，crc細(xì)胞在胞質(zhì)中含有高得多的水平的trio(py2681)(圖6b)。奇怪地，在基質(zhì)中分離的、出芽的或侵入的crc細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)trio(py2681)信號(hào)(圖6c-e中的箭頭)，這表明trio(py2681)對于crc侵入是關(guān)鍵的。事實(shí)上，trio(py2681)的存在與侵入的深度(m，sm和mpvs.ss，se和si，在卡方檢驗(yàn)中p＜0.0001)和分期(o-i期vs.ii-iv期，p＝0.02；o-iii期vs.iv期，在卡方檢驗(yàn)中p＝0.02)相關(guān)。aes抑制trio(py2681)的磷酸化aes通過抑制notch信號(hào)傳導(dǎo)而抑制crc進(jìn)展{sonoshita，2011}。有趣的是，aes的核表達(dá)與人crc樣品中的trio(py2681)水平反相關(guān)(在卡方檢驗(yàn)中p＜0.01，圖7a中的代表性照片)。此外，我們在來自apc/aes腸腫瘤的免疫沉淀的trio中發(fā)現(xiàn)比來自apc小鼠的那些更強(qiáng)的py2681信號(hào)(圖7b)。因此，我們假設(shè)trio(y2681)的磷酸化對于由喪失aes引起的crc轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵的。由于aes將notch信號(hào)傳導(dǎo)的效應(yīng)子(包括nicd，maml和rbpj)隔離到核病灶{sonoshita，2011}，可預(yù)期aes通過阻斷nicd介導(dǎo)的早期和晚期反應(yīng)而抑制trio(y2681)的磷酸化?？傊?，這些結(jié)果表明aes在激活triorhogef(gef2)中具有關(guān)鍵作用。trio(y2681)的磷酸化刺激rhogef活性和crc侵入為了研究trio(py2681)在crc侵入中的作用，我們構(gòu)建了克隆rko細(xì)胞，其中trio(wt)或不可磷酸化的trio(y2681f)突變體與abl1b和dab1一起以多西環(huán)素(dox)依賴性方式同時(shí)被誘導(dǎo)(圖7c)。有趣的是，trio(wt)而非trio(y2681f)與abl1b和dab1的同時(shí)表達(dá)刺激rko細(xì)胞的基質(zhì)膠侵入能力(圖7c)。為了評估triotyr-磷酸化對rho激活的作用，我們使用純化的蛋白在體外進(jìn)行了rhogefgtp-交換測定。我們選擇hek293t而不是crc細(xì)胞作為產(chǎn)生trio的宿主細(xì)胞，以避免由crc細(xì)胞中多種基因突變所致的可能混淆的結(jié)果。我們證實(shí)了從轉(zhuǎn)染的細(xì)胞純化的trio(wt)蛋白刺激在重組rhoa上的從gdp到gtp的交換反應(yīng)，如報(bào)道一樣{debant，1996}(圖7d)。重要地，從用伊馬替尼處理的轉(zhuǎn)染子細(xì)胞純化的trio(wt)表現(xiàn)出顯著減少的rho激活能力(圖7e)，這表明內(nèi)源性abl激酶對通過trio的rho激活的關(guān)鍵作用。顯著地，trio(y2681f)表現(xiàn)出相似地減少的gef活性(圖7e)，這表明在y2681處的磷酸化對于其最大的gef活性是必需的。這些結(jié)果共同表明abl引起trio在y2681的磷酸化并且增加gtp-rho，導(dǎo)致增強(qiáng)的crc細(xì)胞侵入。人癌癥中的trio點(diǎn)突變刺激其rhogef活性我們進(jìn)一步研究了人癌癥中可能的trio突變。在cosmic(癌癥體細(xì)胞突變目錄(catalogueofsomaticmutationsincancer))數(shù)據(jù)庫中，我們發(fā)現(xiàn)2％(4414中的102個(gè))的不同類型的癌癥含有141種trio突變。顯著地，在crc中在gef2結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變(l2044i)。我們還發(fā)現(xiàn)在ig樣結(jié)構(gòu)域與其之前的包含y2681的區(qū)域中的七個(gè)突變。它們是子宮內(nèi)膜癌中的e2652g，g2658s，t2695m和s2767l，乳腺癌中的n2668s，腎癌中的s2671y，和肺癌中的g2699v(在圖5a中以星形表示)。我們構(gòu)建這些trio的點(diǎn)突變體，并且檢測它們的rhogef活性。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，與trio(wt)相比，trio(g2699v)突變體更能夠激活rho，盡管其不影響rac活性(圖7f，數(shù)據(jù)未顯示)。奇怪的是，在存在abl和dab1時(shí)，trio(g2699v)比野生型對tyr-磷酸化更敏感(圖7g)。總之，這些結(jié)果表明trio突變可以通過加強(qiáng)其通過dab1-abl的tyr-磷酸化而激活rhogef能力，導(dǎo)致人癌癥亞組中的進(jìn)展。多種類型的癌癥發(fā)現(xiàn)trio(py2681)我們進(jìn)一步研究trio的y2681是否不僅在原發(fā)性crc中而且也在其轉(zhuǎn)移中以及在其他類型的癌癥中被磷酸化。結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)trio(py2681)存在于轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中，并且還存在于多種類型的癌癥中(圖12，表2)。這些結(jié)果表明這種轉(zhuǎn)移機(jī)制在多種類型的癌癥中是關(guān)鍵的。表2保留trio(py2681)的器官表現(xiàn)出與trio(py2681)強(qiáng)預(yù)后相關(guān)性的癌癥類型關(guān)于crc，我們已經(jīng)將我們的研究擴(kuò)展到更多數(shù)量的病例(圖13)。利用合并的所有分期的總計(jì)339個(gè)病例，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)trio(py2681)-和trio(py2681)+患者之間在其預(yù)后方面的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異(p＜0.001)。重要地，對于ii期患者(n＝115)，陰性患者的五年存活率結(jié)果為～100％，而對于iv期患者(n＝57)，陰性患者的存活率為～50％，陽性患者的存活率僅為～10％。此外，肺腺癌患者(n＝214)在trio(py2681)-陰性和-陽性之間在其預(yù)后方面表現(xiàn)出顯著的差異(p＝0.002)(圖14)。同樣地，(i-iii)期胃癌患者在trio(py2681)-陰性和-陽性之間在其預(yù)后方面表現(xiàn)出顯著的差異(p＜0.001)(圖15)。另外，初步的數(shù)據(jù)(n＝20)已經(jīng)表明強(qiáng)的傾向性，即胰腺癌患者如果其trio(py2681)是陰性的(與陽性患者相比)則顯示更好的存活(圖16)。該傾向性的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性幾乎與另一種胰腺癌標(biāo)記物smad4的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性相同，盡管trio(py2681)和smad4是不相關(guān)的獨(dú)立標(biāo)記物。參考文獻(xiàn)(所有的參考文獻(xiàn)通過引用結(jié)合在本文中)androutsellis-theotokis，a.，leker，r.r.，soldner，f.，heppner，d.j.，ravin，r.，poser，s.w.，rueger，m.a.，bae，s.-k.，kittappa，r.，和mckay，r.d.g.(2006).notchsignallingregulatesstemcellnumbersinvitroandinvivo(notch信號(hào)傳導(dǎo)在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)干細(xì)胞數(shù)目).nature442，823-826.arnaud，l.，ballif，b.a.，e.，和cooper，j.a.(2003).fyntyrosinekinaseisacriticalregulatorofdisabled-1duringbraindevelopment(fyn酪氨酸激酶是腦發(fā)育過程中disabled-1的重要調(diào)節(jié)子).currbiol13，9-17.artavanis-tsakonas，s.，rand，m.d.，和lake，r.j.(1999).notchsignaling：cellfatecontrolandsignalintegrationindevelopment(notch信號(hào)傳導(dǎo)：發(fā)育過程中的細(xì)胞命運(yùn)控制和信號(hào)整合).science284，770-776.barilá，d.，r.，n.，gonfloni，s.，kretzchmar，j.，moro，m.，bohmann，d.，和superti-furga，g.(2000).anucleartyrosinephosphorylationcircuit：c-junasanactivatorandsubstrateofc-abl和jnk(核酪氨酸磷酸化回路：c-jun作為c-abl和jnk的激活劑和底物).emboj19，273-281.bateman，j.，和vanvactor，d.(2001).thetriofamilyofguanine-nucleotide-edchangefactors：regulatorsofaxonguidance(鳥嘌呤-核苷酸-edchange因子的trio家族：軸突導(dǎo)向的調(diào)節(jié)劑).jcellsci114，1973-1980.billadeau，d.d.(2010).vavproteinsincancer(癌癥中的vav蛋白).intherhogtpasesincancer(癌癥中的rhogtp酶)(springerscience+businessmedia，llc)，pp.77-92.blom，n.，gammeltoft，s.，和brunak，s.(1999).sequence-andstructure-basedpredictionofeukaryoticproteinphosphorylationsites(基于序列和結(jié)構(gòu)的真核蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測).jmolbiol295，1351-1362.bock，h.h.，和herz，j.(2003).reelinactivatessrcfamilytyrosinekinasesinneurons(reelin激活神經(jīng)元中的src家族酪氨酸激酶).currentbiology13，18-26.buchdunger，e.，matter，a.，和druker，b.j.(2001).bcr-ablinhibitionasamodalityofcmltherapeutics(bcr-abl抑制作為cml治療的方式).bba1551，m11-m18.chen，w.-s.，kung，h.-j.，yang，w.-k.，和lin，w.(1999).comparativetyrosine-kinaseprofilesincolorectalcancers：enhancedargexpressionincarcinomaascomparedwithadenomaandnormalmucosa(比較結(jié)直腸癌中的酪氨酸激酶模式：與腺瘤和正常的粘膜相比，在癌癥中增加的arg表達(dá)).intjcancer83，579-584.colicelli，j.(2010).abltyrosinekinases：evolutionoffunction，regulation，andspecificity(abl酪氨酸激酶：功能、調(diào)節(jié)和特異性的進(jìn)化).sciencesignaling3，re6.debant，a.，serra-pagès，c.，seipel，k.，o′brien，s.，tang，m.，park，s.-h.，和streuli，m.(1996).themultidomainproteintriobindsthelartransmembranetyrosinephophatase，containsaproteinkinasedomain，andhasseparaterac-specificandrho-specificguaninenucleotideexchangefactordomains(多結(jié)構(gòu)蛋白trio結(jié)合lar跨膜酪氨酸磷酸酶，包含蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，并且具有分開的rac-特異性和rho-特異性鳥嘌呤核苷酸交換因子結(jié)構(gòu)域).procnatlacadsciusa93，5466-5471.degeer，j.，boudeau，j.，schmidt，s.，bedford，f.，lamarche-vane，n.，和debant，a.(2013).tyrosinephosphorylationoftherhoguaninenucleotideexchangefactortrioregulatesnetrin-1/dcc-mediatedcorticalaxonoutgrowth(rho鳥嘌呤核苷酸交換因子trio的酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)netrin-1/dcc-介導(dǎo)的皮質(zhì)軸突生長).molcellbiol33，739-751.dowell，r.d.(2010).transcriptionfactorbindingvariationintheevolutionofgeneregulation(基因調(diào)節(jié)的進(jìn)化過程中國的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合變化).trendsgenet26，468-475.fidler，i.j.(2003).thepathogenesisofcancermetastasis：the″seedandsoli″hypothesisrevisited(癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)制：修訂的“種子與土壤”假說).natrevcancer3，453-458.forsthoefel，d.j.，liebl，e.c.，kolodziej，p.a.，和seeger，m.a.(2005).theabelsontyrosinekinase，thetriogefandenabledinteractwiththenetrinreceptorfrazzledindrosophila(在果蠅中，abelson酪氨酸激酶，triogef和enabled與netrin受體frazzled相互作用).development132，1983-1994.gao，y，dickerson，j.b.，guo，f.，zheng，j.，和zheng，y.(2004).rationaldesignandcharacterizationofaracgtpase-specificsmallmoleculeinhibitor(racgtp酶特異性小分子抑制劑的合理設(shè)計(jì)和表征).procnatlacadsciusa101，7618-7623.giniger，e.(1998).aroleforablinnotchsignaling(abl在notch信號(hào)傳導(dǎo)中的作用).neuron20，667-681.giniger，e.(2012).notchsignalingandneuralconnectivity(notch信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)連接性).curropingenetdev22，1-8.hall，a.(1998).rhogtpasesandtheactincytoskeleton(rhogtp酶和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架).science279，509-514.hall，a.(2009).thecytoskeletonandcancer(細(xì)胞骨架與癌癥).canccrmetastasisrev28，5-14.han，h.，tanigaki，k.，yamamoto，n.，kuroda，k.，yoshimoto，m.，nakahata，t.，ikuta，k.，和honjo，t.(2002).induciblegeneknockoutoftranscriptionfactorrecombinationsignalbindingprotein-jrevealsitsessentialroleintversusblineagedecision(轉(zhuǎn)錄因子重組信號(hào)結(jié)合蛋白-j的可誘導(dǎo)的基因敲除揭示其在t相對于b譜系決定中的重要作用).internationalimmunology14，637-645.hantschel，o.，和superti-furga，g.(2004).regulationofthec-ablandbcr-abltyrosinekinases(c-abl和bcr-abl酪氨酸激酶的調(diào)節(jié)).natrevmolcellbio5，33-44.hashimoto-torii，k.，torii，m.，sarkisian，m.r.，bartley，c.m.，shen，j.，radtke，f.，gridley，g.，sestan，n.，和rakic，p.(2008).interactionbetweenreelinandnotchsignalingregurlatesneuronalmigrationinthecerebralcortex(reelin和notch信號(hào)傳導(dǎo)之間的相互作用調(diào)節(jié)大腦皮層中的神經(jīng)元遷移).neuron60，273-284.howell，b.w.，gertler，f.b.，和cooper，j.a.(1997).mousedisabled(mdab1)：asrcbindingproteinimplicatedinneuronaldevelopment(小鼠disabled(mdab1)：參與神經(jīng)元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