本發(fā)明涉及微生物技術領域，具體地說，涉及一種提高宿主腸道微生物群落重塑效率的方法。

背景技術：

健康穩(wěn)定的腸道微生物群落與宿主健康狀況及腸道的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有十分密切的作用。宿主的腸道共生菌群的結(jié)構組成與宿主的健康狀態(tài)及宿主生活的環(huán)境處于相互依賴、相互制約的狀態(tài)。因此，在腸道菌群結(jié)構正常的情況下，宿主本身具有抵抗外來病原菌的能力，且腸道內(nèi)的正常菌群并不會對宿主健康形成危害。據(jù)目前研究，腸道微生物群落失調(diào)與腸炎、腹瀉、便秘、肥胖、抑郁癥、糖尿病、自身免疫疾病都具有相關性，腸道微生物群落狀態(tài)也與宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收具有直接關系。因此，通過調(diào)節(jié)紊亂的腸道微生物群落，使之恢復為健康菌群的穩(wěn)態(tài)，具有治療多種疾病的應用前景；通過調(diào)控腸道微生物群落結(jié)構也可直接調(diào)節(jié)動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，調(diào)控動物機體的代謝狀態(tài)，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應用前景。

糞菌移植是一種將外源健康微生物群落移植到受體腸道中，從而改變患病受體的腸道微生態(tài)紊亂，使之恢復健康穩(wěn)態(tài)的一種技術手段。近年來，使用糞菌移植的方法治療動物胃腸道疾病及改善胃腸道環(huán)境已經(jīng)漸漸成為生產(chǎn)者和科研工作者深入研究的熱門課題。據(jù)文字記載，早在中國東晉時期，《肘后備急方》中就描述了使用人的糞便上清液治療食物中毒、腹瀉、發(fā)熱等疾病；奧地利維也納醫(yī)科大學的angelberger使用糞菌移植的方法對5位潰瘍性結(jié)腸炎患者進行治療，并取得了顯著療效。此后大量臨床報道，利用糞菌移植治療多種疾病，如慢性便秘、偽膜性腸炎、艱難梭狀芽孢桿菌性腸炎等。另外，在畜牧業(yè)中，糞菌移植可以有效提高仔豬、雛雞的生長性能，顯著提高日增重和采食量，并可顯著防治腹瀉。因此，糞菌移植在臨床治療和生產(chǎn)實踐的應用中，已經(jīng)具有良好的效果。

譚本杰等人公開了一種利用糞菌移植提高雛雞生長性能和防治雞白痢的方法(cn105029030a)。糞菌移植的方法具有提高雛雞平均日增重、平均日采食量，并可顯著防治雞白痢的優(yōu)點。該發(fā)明采用健康動物的糞菌液來代替抗生素，可為糞菌移植在其它動物生產(chǎn)中的應用提供參考。

王士長等人公開了一種利用糞菌移植提高斷奶仔豬生長性能和降低腹瀉率的方法(cn105029031a)。通過糞菌移植的技術手段可以提高斷奶仔豬平均日增重、平均日采食量，也可顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率。該發(fā)明使用健康動物的糞菌液來代替抗生素，為糞菌移植在動物生產(chǎn)中的應用提供參考。

然而，上述技術方案中均直接采用糞菌移植的方法達到改善宿主腸道微生物的目的，但是由于宿主腸道微生物群落具有穩(wěn)健性，糞菌移植的微生物定植效率很低，這也大大降低了糞菌移植的應用效果。

因此，亟需研發(fā)一種提高宿主腸道微生物群落重塑效率的方法。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種提高宿主腸道微生物群落重塑效率的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：

本發(fā)明提供一種提高宿主腸道微生物群落重塑效率的方法，包括以下步驟：

(1)利用聯(lián)合抗生素對宿主腸道進行預處理；

(2)對宿主進行腸道糞菌移植。

其中，所述聯(lián)合抗生素包括氨芐青霉素、硫酸新霉素和萬古霉素。

優(yōu)選地，所述聯(lián)合抗生素為氨芐青霉素、硫酸新霉素和萬古霉素的混合物。

更為優(yōu)選地，所述聯(lián)合抗生素中，氨芐青霉素的濃度為8g/l，硫酸新霉素的濃度為8g/l，萬古霉素的濃度為4g/l。

進一步地，所述聯(lián)合抗生素通過口服方式進入宿主腸道，口服劑量相對宿主體重為20ml/kg·次。

優(yōu)選地，利用聯(lián)合抗生素對宿主腸道進行預處理的時間為3天，每天口服聯(lián)合抗生素2次，每次間隔8h以上。

進一步地，宿主通過口服健康供體糞便上清的方式實現(xiàn)腸道糞菌移植。

進一步地，所述健康供體糞便上清的制備方法為：取健康供體的新鮮糞便，使用無菌0.9％生理鹽水充分搗勻，使用2層紗布過濾，獲得健康供體糞便上清；其中，新鮮糞便與生理鹽水的體積比為1:5。

優(yōu)選地，糞菌移植的時間持續(xù)三天。

更為優(yōu)選地，宿主每天口服健康供體糞便上清一次，劑量為20ml/kg·次。

在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可以相互組合，得到具體實施方式。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明所述的方法可廣泛應用到微生物技術領域、動物醫(yī)學領域、營養(yǎng)學領域等。本發(fā)明通過使用聯(lián)合抗生素對宿主腸道進行前處理，能夠顯著提高糞菌移植的移植效率，可高效的改變個體腸道微生物群落，必要時，可達到疾病防治的目的。

附圖說明

圖1為本發(fā)明采用腸道預處理的方法進行糞菌移植技術流程圖。

圖2為本發(fā)明采用不同腸道預處理方法能夠顯著提高糞菌定植效率；其中：con，對照組；bc，清腸液預處理組；at，聯(lián)合抗生素預處理組；fmt，糞菌移植；a，空腸內(nèi)微生物群落組成變化；b，結(jié)腸內(nèi)微生物群落組成變化；c，空腸內(nèi)糞菌定植效率；d，結(jié)腸內(nèi)糞菌定植效率。

圖3為本發(fā)明聯(lián)合抗生素預處理和糞菌移植后耐藥微生物豐度分布圖；其中：con，對照組；at，聯(lián)合抗生素預處理組；fmt，糞菌移植；a，空腸中，使用聯(lián)合抗生素預處理后和糞菌移植后耐藥微生物豐度分布；b，結(jié)腸中，使用聯(lián)合抗生素預處理后和糞菌移植后耐藥微生物豐度分布。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

1、試驗動物和飼養(yǎng)條件

從北京華阜康生物科技股份有限公司購買無特殊病原菌(specific-pathogenfree，spf)的8周齡雌性小鼠(icr)，在中國農(nóng)業(yè)大學飼料工業(yè)中心鼠房進行飼養(yǎng)，保持20℃恒溫條件，12小時光照/黑暗交替循環(huán)，采用小鼠基礎飼料(18％蛋白質(zhì)，4％脂肪，5％纖維)進行飼喂，自由采食無菌飲水。飼料和飲水每天更換一次，以保證新鮮的飼料和飲水供給。每個處理組的小鼠在獨立的鼠籠中進行飼養(yǎng)。

2、試驗處理

實驗小鼠被隨機分成3大組，每組10只，分別為對照組、清腸液預處理組和聯(lián)合抗生素預處理組。對照組自由采食無菌清潔的飲水，清腸液預處理組和抗生素處理組分別使用清腸液和聯(lián)合抗生素溶液進行灌服(灌胃針操作)，每次灌服計量為500μl/只，2次/天，連續(xù)灌服3天。抗生素處理組采用聯(lián)合抗生素(氨芐青霉素(ampicillin，8g/l)、硫酸新霉素(neomycinsμlphate，8g/l)和萬古霉素(vancomycin，4g/l))混合水溶液進行口腔灌服，清腸液預處理組使用清腸液(peg3350，100g/l；nacl，46mmol/l；naso4，53mmol/l和l-抗壞血酸，30mmol/l)灌服。預處理三天后，每大組隨機分出5只進行空腸和結(jié)腸的采樣，各組剩余的5只小鼠接受糞菌移植，糞菌移植液采用異源微生物群落，此處為人的新鮮糞便，使用無菌0.9％生理鹽水充分搗勻(糞：生理鹽水＝1:5)，使用2層紗布過濾，使用灌胃針分別灌服給小鼠，500μl/只，1次/天，連續(xù)灌服3天。

實驗技術流程圖如圖1所示。

3、采樣及樣品測定

使用斷頭法殺鼠，在干凈的解剖盤中解剖小鼠，截取空腸和結(jié)腸腸段，截取的腸段使用無菌0.9％生理鹽水沖洗內(nèi)容物，再使用無菌刀片將沖洗干凈的腸段剖開，并刮取腸粘膜，保存至新的1.5ml無菌離心管中，獲得腸粘膜樣品。送往北京奧維森基因科技有限公司進行全dna的提取及16srdnav3-v4區(qū)域高通量測序。樣品暫存在-80℃冰箱中。在北京奧維森基因科技有限公司，使用qiagendnaextractionkit進行總dna的提取，使用帶barcode的引物對16srdnav3-v4區(qū)域進行擴增，采用nebnextμltradnasamplepreparationkit進行序列文庫的構建，使用illuminamiseq測序平臺進行序列測定，獲得420bp雙端測序序列。

4、試驗結(jié)果

使用微生物群落的bray-curtis距離參數(shù)來描述微生物群落相似性，對比糞菌移植后的微生物群落(空腸和結(jié)腸)與供體的相似性，并計算糞菌移植的效率。圖2(a，b)所示，聯(lián)合抗生素預處理組在糞菌移植后，空腸(a)和結(jié)腸(b)中的微生物群落結(jié)構與其它兩組都存在顯著差異，而且清腸液預處理組和對照組在糞菌移植后和移植以前的微生物群落結(jié)構高度相似，沒有顯著差異。因此，使用聯(lián)合抗生素對宿主腸道進行預處理，在宿主接受糞菌移植后，空腸和結(jié)腸中的微生物群落都與不進行預處理的組有顯著差異，抗生素的預處理促進了外源糞菌的定植；而使用清腸液預處理卻沒有促進糞菌定制的效果，移植后的微生物群落狀態(tài)與對照組類似。圖2(c，d)所示，糞菌移植前對腸道進行預處理并沒有提高微生物在空腸中的定植效率(c)，聯(lián)合抗生素預處理腸道卻顯著提高了結(jié)腸中糞菌移植的定植效率(d)。因此，糞菌移植前抗生素對腸道的前處理，可以顯著提高糞菌移植在結(jié)腸中的定植效率。

通過對空腸和結(jié)腸中的微生物進行總dna提取及16srdna高通量測序，使用qiime流程進行分析，greengene數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，可分析出腸道中微生物的物種組成及其豐度值。在空腸(a)和結(jié)腸(b)中，使用聯(lián)合抗生素預處理后和糞菌移植后發(fā)生變化的微生物可以歸為3個大組：1組，聯(lián)合抗生素預處理后，豐度升高，糞菌移植后，豐度又降低至對照組水平的微生物；2組，聯(lián)合抗生素預處理后消失，且糞菌移植后也沒有恢復的微生物；3組，不同于宿主腸道內(nèi)的原駐菌，使用聯(lián)合抗生素預處理和糞菌移植后新增加的微生物(見圖3)。經(jīng)檢測可知，耐藥微生物都分布在1組，在聯(lián)合抗生素預處理后，空腸和結(jié)腸中的耐藥微生物豐度都顯著升高了，而進行了后續(xù)的糞菌移植后，耐藥微生物豐度又恢復到了對照組的正常水平。因此，在聯(lián)合抗生素預處理之后再進行糞菌移植，能夠使宿主腸道內(nèi)的耐藥微生物降低到健康供體的水平。

以上試驗結(jié)果表明：(1)使用聯(lián)合抗生素預處理宿主腸道，再進行糞菌移植，與非預處理組相比，顯著改變了空腸和結(jié)腸中的微生物群落結(jié)構；(2)使用聯(lián)合抗生素預處理宿主腸道之后，再進行糞菌移植，與非預處理組相比，顯著提高了外源糞菌的定植效率；(3)使用聯(lián)合抗生素預處理，雖然使得空腸和結(jié)腸的耐藥微生物豐度升高，但是當進行后續(xù)糞菌移植后，空腸和結(jié)腸中的耐藥微生物豐度均顯著降低，恢復到健康對照組的水平。由此可見，使用聯(lián)合抗生素預處理宿主腸道，再進行糞菌移植，可以顯著提高外源糞菌的定植效率，并且不會導致耐藥微生物的升高。因此，糞菌移植前的宿主腸道預處理技術在動物醫(yī)學領域和臨床領域都具有廣泛的應用前景。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但因原理相同，實際應用并不僅限于說明書中所列的方法，對具體示例的描述只是為了例證，并非將本發(fā)明限定為所公開的精確形式。對于對本領域熟悉的研究人員而言，可以根據(jù)腸道預處理的概念，使用不同的抗生素配比預處理劑，廣泛應用于臨床、動物醫(yī)學和營養(yǎng)學等領域，用于疾病的防治和代謝的改善，也可以進行靈活的修改，從而應用于不同的宿主，而不僅限定在對小鼠的應用。因此，在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明不限定于說明書中特定的抗生素配比和被應用的宿主。