專利名稱：用于癌癥診斷和/或預(yù)后的新型抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及患者中增殖性疾病的預(yù)后和/或診斷的領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及能夠特異地結(jié)合人CMet受體的新型抗體，以及編碼這些抗體的氨基酸和核酸序列。同樣地，本發(fā)明包括所述抗體的用途，以及用于檢測和診斷與cMet表達相關(guān)的病理性過度增殖的致癌疾患的方法。在特定實施方式中，疾患是與相對于正常而言增加的cMet多肽表達相關(guān)的致癌疾患，或任何其它與cMet過表達相關(guān)的病理。最后，本發(fā)明包括包含至少用于特定癌癥預(yù)后或診斷的此種抗體的產(chǎn)品和/或組合物或試劑盒。
背景技術(shù)：
祀向酪氨酸激酶受體(RTK)的藥劑如曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗`(cetuximab)、貝伐單抗(bevacizumab)、伊馬替尼(imatinib)和吉非替尼(gef itinib)抑制劑已經(jīng)表明了靶向這類蛋白用于選定癌癥的治療的興趣。cMet是也包括RON和SEA的RTK亞家族的原型成員。cMet RTK家族結(jié)構(gòu)上不同于其它RTK家族，且其為唯一已知的肝細胞生長因子(HGF)(也稱為scater因子(SF))的高親和性受體(D. P. Bottaro 等人，Science 1991，251:802-804; L. Naldini 等人，Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991，10:2867-2878)。cMet 和 HGF 廣泛表達于多種組織，且它們的表達通常分別局限于上皮和間質(zhì)來源的細胞(M. F. Di Renzo等人，Oncogene1991，6:1997-2003;E. Sonnenberg 等人，J. Cell. Biol. 1993，123:223-235)。不僅正常的哺乳動物發(fā)育需要它們，且已經(jīng)表明其在細胞遷移、形態(tài)分化和三維管結(jié)構(gòu)的組織以及生長和血管生成中特別重要(F. Baldt等人，Nature 1995，376:768-771; C.Schmidt 等人，Nature. 1995:373:699-702;Tsarfaty 等人，Sciencel994, 263:98-101)。已經(jīng)表明cMet和HGF的受控調(diào)節(jié)在哺乳動物的發(fā)育、組織維持和修復(fù)中是重要的(Nagayama T 等人，Brain Res. 2004, 5; 999 (2) : 155-66; Tahara Y 等人，J Pharmacol ExpTher. 2003, 307 (I) : 146-51 )，其調(diào)節(jié)異常參與癌癥的進展。由cMet不恰當(dāng)激活所引發(fā)的異常信號傳導(dǎo)是在人癌癥中觀察到的最常見的改變之一，其在腫瘤生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用(Birchmeier等人，Nat.Rev. Mol. CellBiol. 2003,4:915-925;L.Trusolino 和 Comoglio P. M. , Nat Rev.Cancer. 2002, 2(4):289-300)。通過配體依賴和非依賴的機制(其包括cMet的過度表達、和/或旁分泌或自分泌的激活)或者通過獲得功能的突變能夠引起不恰當(dāng)?shù)腸Met的激活(J. G. Christensen, Burrows J.和 SalgiaR.，Cancer Latters. 2005，226:1-26)。但是，存在或不存在配體時，為調(diào)節(jié)激酶對ATP和含有酪氨酸的多肽底物的結(jié)合親和力和結(jié)合動力學(xué)，需要 cMet 受體的寡聚化(Hays JL 等人，Biochemistry, 2004Aug 17,43:10570—8)。激活的cMet將信號傳導(dǎo)效應(yīng)子募集到位于細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的多?？?multidocking)位點，導(dǎo)致一些重要信號傳導(dǎo)通路的激活，包括Ras-MAPK、PI3K、Scr和Stat3 (Gao CF等人，Oncogene. 2000，19(49) :5582-9)。這些通路對于腫瘤細胞增殖、侵入和血管生成以及對于避免凋亡是必要的(Furge KA 等人，Trends CellBiol. 2003Mar, 13(3) :122-30; Fan S 等人，Oncogene. 2000Apr 27，19 (18) : 2212-23)。另外，相對于其它 RTK，cMet 信號傳導(dǎo)的獨特方面是已報道的其與黏著斑復(fù)合物和非激酶結(jié)合配偶體(partner)如α 6β 4整聯(lián)蛋白(integrin) (Trusolino L 等人，J BiolChem. 1999, 274(10) :6499-506)、叢蛋白BI (PlexinBl)或semaphorin (無對應(yīng)譯文)的相互作用(Giordano S等人，NatCell Biol. 2002，4(9) :720-4;Conrotto P 等人，Blood. 2005，105(11) :4321-9;ConrottoP, Corso S, Gamberini S，Comoglio PM, Giordano S，Oncogene. 2004，23:5131-7),其可以通過該受體進一步添加至細胞功能調(diào)節(jié)的復(fù)雜性。最后，最近的數(shù)據(jù)證實了 cMet可參與對吉非替尼或厄洛替尼(erlotinib)的腫瘤抗性，表明靶向EGFR和cMet兩者的化合物的組合可能是顯著的感興趣的(Engelman JA 等人，Science, 2007, 316:1039-43)。在過去的一些年中，已經(jīng)開發(fā)了許多不同的策略減弱癌癥細胞系中cMet的信號傳導(dǎo)。這些策略包括i)中和抗cMet或HGF/SF的抗體(Cao B等人,Proc Natl AcadSci U S A. 2001, 98(13) : 7443-8;Martens T 等人，Clin Cancer Res. 2006，12 (20) : 6144-52)或使用HGF/SF 拮抗劑 NK4，防止配體與 cMet 結(jié)合(Kuba K 等人，CancerRes.，2000, 60:6737-43)，
ii)對cMet的小ATP結(jié)合位點抑制劑，封閉激酶活性(Christensen JG等人，CancerRes. 2003, 63:7345-55)，iii)工程化的SH2結(jié)構(gòu)域多肽，其干擾進入多?？课稽c，以及減少受體或配體表達的RNAi或核酶。這些方法中的大多數(shù)表現(xiàn)出導(dǎo)致腫瘤抑制的cMet的選擇性抑制，并表明cMet可能是癌癥治療性干預(yù)所感興趣的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供至少一種試劑，其能夠用作檢測和/或檢測致癌疾患、特別是其特征為cMet表達或那些異常cMet表達介導(dǎo)的疾患的診斷或預(yù)后的生物標(biāo)志物。文中描述的是符合此準(zhǔn)則的新型抗體。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在隨后的詳細說明和實施例中變得明顯。在第一方面，本發(fā)明的主題是一種結(jié)合蛋白，或其功能片段或衍生物，其以高親和性特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet蛋白(cMet),優(yōu)選人cMet,并因而能夠用于診斷由配體非依賴激活形式的cMet表達介導(dǎo)的病理性過度增殖致癌疾患的方法中。配體非依賴的激活涉及cMet的組成性磷酸化,其隨后是(consecutive to) i)在cMet過度表達(通常與cMet基因的擴增相關(guān))的情況下，在不存在HGF時發(fā)生的受體二聚化，或ii)在cMet細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域內(nèi)激活突變，或iii)兩者皆有。在第一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合蛋白，或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii )不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet。通過“結(jié)合蛋白”的表述，應(yīng)當(dāng)理解為與其它蛋白或分子具有特異的或廣泛的親和性的任何肽鏈。當(dāng)結(jié)合可能時，使蛋白接觸并形成復(fù)合體。本發(fā)明的結(jié)合蛋白優(yōu)選，單不局限為抗體、抗體的片段或衍生物、蛋白或肽。表述“功能片段和/或衍生物”將在本發(fā)明的說明書的后面詳細定義。通過表述“在腫瘤上”，應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合蛋白報道的性質(zhì)存在于體內(nèi)的腫瘤環(huán)境中，并不僅僅在體外的實例中。更特別地，其已被證實，如從以下實施例中明確的，用代表盡可能最接近天然的環(huán)境的離體實驗或在人腫瘤組織的商業(yè)微陣列(TMA)上的分析。應(yīng)當(dāng)理解此處本發(fā)明不涉及天然形式的蛋白，S卩，這些蛋白不是存在于其天然環(huán)境中的，而是其能夠被從天然來源分離或獲得，或通過遺傳重組、或通過化學(xué)合成獲得的，然后如下面描述的，其能夠含有非天然的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，公開了一種結(jié)合蛋白，或其功能片段或衍生物，如上面所述，其不阻斷配體肝細胞生長因子(HGF)結(jié)合至cMet。更特別地，本發(fā)明的結(jié)合蛋白或其功能片段或衍生物在氨基酸殘基I和950之間與cMet的細胞外區(qū)域相互作用。根據(jù)第一個實施方式，本發(fā)明涉及一種結(jié)合蛋白，其功能片段或衍生物，其包含選自包含至少SEQ ID No. 1、2、3、4、5、6、17、18、19、20或21的序列的CDR中的至少一個CDR或最佳比對后其序列與序列SEQ ID No. 1、2、3、4、5、6、17、18、19、20或21具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個CDR。`根據(jù)第二個實施方式，本發(fā)明涉及一種結(jié)合蛋白，或其功能片段或衍生物，其包含選自包含至少SEQ ID No. 9、10、11、12、13、14、22、23、24、25或26的序列的CDR中的至少一個CDR或最佳比對后其序列與序列SEQ ID No. 9、10、11、12、13、14、22、23、24、25或26具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的至少一個CDR?？贵w的“功能片段”表示，尤其是，抗體片段，比如片段Fv、SCFv(SC=簡單鏈)、Fab、F (ab’)2、Fab’、scFv-Fc或雙特異抗體、或任何半衰期延長的片段。本說明書中將隨后詳細描述這種功能片段?？贵w的“衍生化合物”或“衍生物”表示，尤其是，由肽支架和為了保留其被識別的能力的至少一個原始抗體CDR組成的結(jié)合蛋白。這種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的衍生化合物，將隨后在本說明書中詳細描述。在第一個實施方式中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白或其功能片段或衍生物包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少一個選自序列SEQ ID No. 1-6的⑶R。在另一個實施方式中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白或其功能片段或衍生物包括抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括至少一個選自序列SEQ ID No. 9-14的⑶R。在本發(fā)明的又一個優(yōu)選實施方式中，所述結(jié)合蛋白或其功能片段或衍生物由分離的抗體組成。更優(yōu)選地，本發(fā)明包括通過遺傳重組或化學(xué)合成獲得根據(jù)本發(fā)明的抗體、其衍生的化合物或其功能片段。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，根據(jù)本發(fā)明的抗體或其衍生的化合物或功能片段的特征在于其由單克隆抗體組成?！皢慰寺】贵w”理解為表示來自早期均質(zhì)抗體群的抗體。更具體地，除了以極小比例可以發(fā)現(xiàn)的少數(shù)可能天然發(fā)生的突變外，群的個體抗體是一致的。換言之，單克隆抗體由來自單個細胞克隆(例如雜交瘤、轉(zhuǎn)染有編碼均質(zhì)抗體的DNA分子的真核宿主細胞、轉(zhuǎn)染有編碼均質(zhì)抗體的DNA分子的原核宿主細胞等)生長的均質(zhì)抗體組成，通常其特征在于一類且僅一類及亞類的重鏈和僅一種類型的輕鏈。單克隆抗體是高度特異性的，并針對單一抗原。此外，和制備多克隆抗體(其通常包括針對多種決定簇、或表位的多種抗體)對比，各單克隆抗體針對單個抗原表位。
此處必須了解，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，S卩，它們不取自其天然環(huán)境，但它們通過純化分離自或獲得自天然來源、或者通過遺傳重組或者通過化學(xué)合成獲得，因此它們可以帶有非天然氨基酸，正如將在此后描述的。更特別地，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個輕鏈，該輕鏈包含至少一個序列SEQ ID No. 1、2、3、17、18的⑶R，或至少一個在最佳比對后與序列SEQ IDNo. 1、2、3、17、18具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個輕鏈，該輕鏈包含以下3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中一 CDR-Ll包括序列SEQ ID No. I或17，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. I或17具有至少80%同一性的序列；-CDR-L2包括序列SEQ ID No. 2或18，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 2或18具有至少80%同一性的序列；和 - CDR-L3包括序列SEQ ID No. 3，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 3具有至少80%同一性的序列。因而，本發(fā)明描述一種抗體、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii )并不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，所述抗體的特征在于其包含根據(jù)頂GT定義的下面3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中CDR-Ll包括序列SEQ ID No. 1，CDR-L2包括序列SEQ ID No. 2和CDR-L3包括序列SEQID No. 3。根據(jù)另一個具體實施方式
，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個輕鏈，該輕鏈包含如根據(jù)Kabat定義的以下3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和 CDR-L3，其中 CDR-Ll 包括序列 SEQ ID No. 17，CDR_L2 包括序列 SEQ ID No. 18 和 CDR-L3包括序列SEQ ID No. 3。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含至少一個序列SEQ ID No. 4、5、6、19、20或21的⑶R，或至少一個在最佳比對后與序列SEQ ID No. 4、5、6、19、20或21具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。在一個優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含以下3種⑶R，分別為⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中- CDR-Hl包括序列SEQ ID No. 4或19，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 4或19具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；一 CDR-H2包括序列SEQ ID No. 5或20，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 5或20具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和- CDR-H3包括序列SEQ ID No. 6或21，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 6或21具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。因而，本發(fā)明描述一種抗體、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)并不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，所述抗體的特征在于，其包含一個重鏈，該重鏈包含根據(jù)頂GT定義的下面3種CDR，分別為CDR-Hl、CDR-H2 和 CDR-H3，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQ ID No. 4，CDR-H2 包括序列 SEQ IDNo. 5 和 CDR-H3 包括序列 SEQ IDNo. 6。根據(jù)另一個具體實施方式
，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含如根據(jù)Kabat定義的以下3種⑶R，分別為⑶R-H1、⑶R-H2和 CDR-H3，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQ ID No. 19，CDR_H2 包括序列 SEQ ID No. 20 和 CDR-H3包括序列SEQ ID No. 21。更特別地，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個輕鏈，該輕鏈包含至少一個序列SEQ ID No :9、10、11、22、23的⑶R，或至少一個在最佳比對后與序列SEQ IDNo :9、10、11、22、23具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個輕鏈，該輕鏈包含以下3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和⑶R-L3，其中- CDR-Ll包括序列SEQ ID No. 9或22，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 9或22具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；`— CDR-L2包括序列SEQ ID No. 10或23，或在最佳比對后與序列SEQ IDNo. 10或23具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和—⑶R-L3包括序列SEQID No. 11，或在最佳比對后與序列SEQ ID No. 11具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。因而，本發(fā)明描述一種抗體、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)并不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，所述抗體的特征在于，其包含一個輕鏈，該輕鏈包含根據(jù)頂GT定義的下面3種CDR，分別為CDR-Ll、CDR-L2 和 CDR-L3，其中 CDR-Ll 包括序列 SEQ ID No. 9，CDR-L2 包括序列 SEQ IDNo. 10 和 CDR-L3 包括序列 SEQ IDNo. 11。根據(jù)另一個具體實施方式
，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個輕鏈，該輕鏈包含如根據(jù)Kabat定義的以下3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和 CDR-L3，其中 CDR-Ll 包括序列 SEQ ID No. 22，CDR-L2 包括序列 SEQ ID No. 23 和 CDR-L3包括序列SEQ ID No. 11。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含至少一個序列SEQ ID No. 12、13、14、24、25、26的CDR，或至少一個在最佳比對后與序列SEQ ID No. 12、13、14、24、25、26具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。在一個優(yōu)選的方式中，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含以下3種⑶R，分別為⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，其中— CDR-Hl包括序列SEQ ID No. 12或24，或在最佳比對后與序列SEQ IDNo. 12或24具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；— CDR-H2包括序列SEQ ID No. 13或25，或在最佳比對后與序列SEQ IDNo. 13或25具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；以及— CDR-H3包括序列SEQ ID No. 14或26，或在最佳比對后與序列SEQ IDNo. 14或26具有至少80%、優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。因而，本發(fā)明描述一種抗體、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet,但ii )不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet,所述抗體的特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含根據(jù)頂GT定義的下面3種⑶R，分別為⑶R-H1、CDR-H2 和 CDR-H3，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQID No. 12，CDR-H2 包括序列 SEQ ID No. 13 和CDR-H3 包括序列 SEQ ID No. 14。根據(jù)另一個具體實施方式
，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物之一，其特征在于其包含一個重鏈，該重鏈包含如根據(jù)Kabat定義的以下3種⑶R，分別為⑶R-H1、⑶R-H2和 CDR-H3，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQ ID No. 24，CDR-H2 包括序列 SEQ ID No. 25 和 CDR-H3包括序列SEQ ID No. 26。在本說明書中，術(shù)語“多肽”、“多肽序列”、“肽”和“附著至抗體化合物或其序列的
蛋白質(zhì)”是可互換的。此處必須了解，本發(fā)明不涉及天然形式的抗體，S卩，它們不取自其天然環(huán)境，但它們通過純化分離自或獲得自天然來源、或者通過遺傳重組或者通過化學(xué)合成獲得，因此它 們可以帶有非天然氨基酸，正如將在此后描述的。在第一個實施方式中，互補決定區(qū)、或CDR表示如Kabat等人定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)(Kabat等人，Sequences of proteins of immunologicalinterest, 5thEd. , U. S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991,及其隨后的版本)。有三個重鏈⑶R和三個輕鏈⑶R。此處，術(shù)語“⑶R”用于表示，取決于具體情況，一種或更多種、或甚至所有區(qū)，所述區(qū)含有負責(zé)對其識別的抗原或表位的抗體結(jié)合親和性的大部分氨基酸殘基。 在第二個實施方式中，通過⑶R區(qū)或⑶R，意圖表示如IMGT定義的免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高度可變區(qū)。無論抗原受體、鏈的類型、或物種如何，定義了 MGT獨特編號來比較可變結(jié)構(gòu)域(Lefranc M. -P. , Immunology Today 18, 509(1997)/Lefranc Μ. -P. , Thelmmunologist,7,132-136 (1999) /Lefranc, Μ. -P. , Pommie, C. , Ruiz, Μ. , Giudicelli, V. , Foulquier, Ε. , Truong, L. , Thouvenin-Contet, V.和 Lefranc, Dev. Comp. Tmmunol · , 27, 55-77(2003))。 在IMGT獨特編號中，保守的氨基酸總是具有相同的位點，例如半胱氨酸23 (第一-CYS)、色氨酸41 (保守的-TRP)、疏水氨基酸89、半胱氨酸104 (第二-CYS)、苯丙氨酸或色氨酸118 (J-PHE或J-TRP)。IMGT獨特編號提供框架區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)界限(FR1-MGT :位點I至26、FR2-IMGT 39 至 55、FR3-IMGT 66 至 104 以及 FR4-MGT :118 至 128)以及互補決定區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)界限CDR1-IMGT :27 至 38、CDR2-IMGT 56 至 65 以及 CDR3-MGT :105 至 117。正如間隔代表未占據(jù)的位點，⑶R-IMGT長度(顯示于括號之間，并由點隔開，如(8. 8. 13 ))成為重要的信息。在二維圖示中使用頂GT獨特編號，如頂GT Colliers de Perles所指定的(Ruiz, Μ.和 Lefranc, Μ. -P. , Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) /Kaas, Q.和Lefranc, Μ. -P.，Current Bioinformatics, 2，21-30(2007))，以及在 MGT/3D 結(jié)構(gòu)-DB 中的三維結(jié)構(gòu)中(Kaas, Q.，Ruiz, M.和 Lefranc, Μ·-P.，T cell receptor and MHCstructuraldata. NucI. Acids. Res. , 32, D208-D210 (2004))。存在三個重鏈⑶R和三個輕鏈⑶R。術(shù)語⑶R此處根據(jù)情況用于表示，這些區(qū)的一個或幾個、或甚至這些區(qū)的全部，所述區(qū)含有負責(zé)對其識別的抗原或表位的抗體結(jié)合親和性的大部分氨基酸殘基。為了更加明確，應(yīng)當(dāng)理解在下面的描述中，更特別地在表2a、2b和3中，將通過IMGT編號和Kabat編號定義CDR。在本發(fā)明的意思中，兩條核酸或氨基酸序列之間的“同一性百分比”表示最佳比對后獲得的待比較的兩條序列之間一致的核苷酸或氨基酸殘基的百分比，此百分比是純統(tǒng)計學(xué)的，并且兩條序列之間的差異沿著其長度隨機分布。兩條核酸或氨基酸序列的比較傳統(tǒng)上在它們最佳比對之后通過比較序列來進行，所述比較能夠通過節(jié)段或通過使用“比對窗”進行?？梢赃M行用于比較的序列的最佳比對，除了手工比較，通過Smith和Waterman 的局部同源算法(1981 )(Ad. App. Math. 2:482)、通過 Neddleman 和 Wunsch( 1970)(J. Mol. Biol. 48:443)的局部同源算法、通過Pearson和Lipman的相似性搜索方法(1988)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444)、或通過使用這些算法的計算機軟件(Wisconsin遺傳軟件包中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA，Genetics Computer Group, 575ScienceDr. Madison, WI，或者通過比較軟件 BLASTNR 或 BLAST P)。兩條核酸或氨基酸序列之間的同一性百分比可以通過比較兩條最佳-比對的序列來確定，其中待比較的核酸或氨基酸序列，同兩序列間用于最佳比對的參考序列相比，有增加或刪除。通過確定兩條序列間一致的氨基酸核苷酸或殘基的位點數(shù)，將一致位點的數(shù)除以比對窗中整個位點數(shù)，結(jié)果乘以100獲得兩條序列間的同一性百分比，來計算同一性`百分比。例如，BLAST程序，網(wǎng)站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html 上可獲得的 “BLAST 2 序列”(Tatusova 等人，“Blast 2sequences_a new tool forcomparingprotein and nucleotide sequences，，, FEMS Microbiol. , 1999, Lett. 174:247 -250)，可配合使用缺省參數(shù)(尤其地，參數(shù)“空位開放罰分”:5，以及“空位擴展罰分”:2 ;選擇矩陣?yán)绯绦蛲扑]的“BL0SUM 62”矩陣);直接通過程序計算待比較的兩條序列間的同一性百分比。對于和參考氨基酸序列表現(xiàn)出至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選的實例包括那些含有參考序列、某些修飾、尤其是至少一個氨基酸的刪除、增加或取代、截短或延長的序列。在取代一個或更多個連續(xù)或非連續(xù)氨基酸的情況下，取代優(yōu)選其中取代的氨基酸被“等價”氨基酸代替。此處，表述“等價氨基酸”意圖表示任何可能被結(jié)構(gòu)氨基酸中的一個所取代的氨基酸，而不改變相應(yīng)抗體的生物活性，那些具體實例如下描述?？梢酝ㄟ^其和被取代的氨基酸的結(jié)構(gòu)同源性，或通過可能產(chǎn)生的各種抗體間的生物活性的比較測試結(jié)果，來確定等價氨基酸。作為非限定性實例，如下表I總結(jié)了可能實施的不導(dǎo)致相應(yīng)的修飾抗體顯著的生物活性改變的可能取代；在相同條件下，相反的取代在天然中是可能的。表I
原始殘基[M
Ala(A)Val, Gly, Pro
Arg(R)Lys, HisAsn(N)Gln
Asp (D)Glu
Cys(C)Ser
Gln(Q)Asn
Glu(G)Asp
Gly(G)Al^
His (H)Arg
He (I)Leu
Leu (L)He, Val, Met
Lys(K)Arg
Met (M)Leu
Phe(F)Tyr
Pro (P)Ala
Ser(S)Thr, Cys
Thr(T)Ser
Trp(W)Tyr
Tyr(Y)Phe，Trp
Val (V)Leu, Ala本領(lǐng)域技術(shù)人員公知在本領(lǐng)域的目前狀況下，在3個重鏈⑶R上，更特別地，在該
重鏈的⑶R-H3上發(fā)現(xiàn)6個⑶R間的最大可變性(長度和組成)。在一個具體實施方式
中，本發(fā)明涉及小鼠抗體、或其衍生的化合物或功能片段。本發(fā)明的另一個實施方式公開了一種抗體、或其功能片段或衍生物之一，其包括
輕鏈，該輕鏈包括根據(jù)頂GT的下述3種⑶R 一序列SEQ ID No. I或最佳比對后與序列SEQ ID No. I具有至少80%，優(yōu)選85%、
90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Ll ；一序列SEQ ID No. 2或最佳比對后與序列SEQ ID No. 2具有至少80%，優(yōu)選85%、
90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2 ;和一序列SEQ ID No. 3或最佳比對后與序列SEQ ID No. 3具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3 ;和重鏈，該重鏈含 有根據(jù)MGT的下述3種⑶R ；一序列SEQ ID No. 4或最佳比對后與序列SEQ ID No. 4具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Hl ；一序列SEQ ID No. 5或最佳比對后與序列SEQ ID No. 5具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的⑶R-H2 ;和-序列SEQID No. 6或最佳比對后與序列SEQ ID No. 6具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，其包含a)輕鏈，該輕鏈包含根據(jù)MGT定義的下面3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和CDR-L3，其中 CDR-Ll 包括序列 SEQ ID No. 1，CDR_L2 包括序列 SEQ ID No. 2 和 CDR-L3 包括序列SEQ ID No. 3，和b)重鏈，該重鏈包含根據(jù)MGT定義的下面3種⑶R，分別為⑶R-H1、CDR-H2 和 CDR-H3，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQ ID No. 4，CDR-H2 包括序列 SEQ ID No. 5 和CDR-H3 包括序列 SEQ ID No. 6。另外，本發(fā)明的另一個實施方式公開了一種抗體、或其功能片段或衍生物之一，其包括輕鏈，該輕鏈包括根據(jù)頂GT的下述3種⑶R 一序列SEQ ID No. 9或最佳比對后與序列SEQ ID No. 9具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Ll ；一序列SEQ ID No. 10或最佳比對后與序列SEQ ID No. 10具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2 ;和一序列SEQ ID No. 11或最佳比對后與序列SEQ ID No. 11具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3 ;和重鏈，該重鏈含有根據(jù)MGT的下述3種⑶R ；一序列SEQ ID No. 12或最佳比對后與序列SEQ ID No. 12具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Hl ；一序列SEQ ID No. 13或最佳比對后與序列SEQ ID No. 13具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的⑶R-H2 ;和一序列SEQ ID No. 14或最佳比對后與序列SEQ ID No. 14具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的抗體、或其功能片段或衍生物在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，其包含a)輕鏈，該輕鏈包含根據(jù)MGT定義的下面3種⑶R，分別為⑶R-L1、⑶R-L2和CDR-L3，其中 CDR-Ll 包括序列 SEQ ID No. 9，CDR-L2 包括序列 SEQ ID No. 10 和 CDR-L3 包括序列SEQ ID No. 11，和b)重鏈，該重鏈包含根據(jù)MGT定義的下面3種⑶R，分別為⑶R-H1、CDR-H2 和 CDR-H3，其中 CDR-Hl 包括序列 SEQ ID No. 12，CDR_H2 包括序列 SEQ ID No. 13 和CDR-H3 包括序列 SEQ ID No. 14。本發(fā)明的另一個實施方式公開了一種抗體、或其功能片段或衍生物之一，其包括輕鏈，該輕鏈包括根據(jù)Kabat的下述3種⑶R
一序列SEQ ID No. 17或最佳比對后與序列SEQ ID No. 17具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Ll ；一序列SEQ ID No. 18或最佳比對后與序列SEQ ID No. 18具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L2 ;和一序列SEQ ID No. 3或最佳比對后與序列SEQ ID No. 3具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3 ;和重鏈，該重鏈包括根據(jù)Kabat的下述3種⑶R ；一序列SEQ ID No. 19或最佳比對后與序列SEQ ID No. 19具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Hl ；一序列SEQ ID No. 20或最佳比對后與序列SEQ ID No. 20具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的⑶R-H2 ;和
·
—序列SEQID No. 21或最佳比對后與序列SEQ ID No. 21具有至少80%同一性的序列的CDR-H3。本發(fā)明的另一個實施方式公開了一種抗體、或其功能片段或衍生物之一，其包括輕鏈，該輕鏈包括根據(jù)Kabat的下述3種⑶R 一序列SEQ ID No. 22或最佳比對后與序列SEQ ID No. 22具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Ll ；—序列SEQID No. 23或最佳比對后與序列SEQ ID No. 23具有至少80%同一性的序列的Q)R_L2 ;和一序列SEQ ID No. 11或最佳比對后與序列SEQ ID No. 11具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-L3 ;和重鏈，該重鏈含有根據(jù)Kabat的下述3種⑶R ；一序列SEQ ID No. 24或最佳比對后與序列SEQ ID No. 24具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-Hl ；一序列SEQ ID No. 25或最佳比對后與序列SEQ ID No. 25具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的⑶R-H2 ;和一序列SEQ ID No. 26或最佳比對后與序列SEQ ID No. 26具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列的CDR-H3。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的抗體或其功能片段或衍生物，其特征在于，其含有序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，該序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 7或最佳比對后與序列SEQ IDNo. 7具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和/或序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，該序列包含氣基酸序列SEQ ID No. 8或最佳比對后與序列SEQ ID No. 8具有至少80%,優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。因而，本發(fā)明描述一種抗體、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，所述抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID No. 7的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含氨基酸序列SEQID No. 8的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的抗體或其功能片段或衍生物，其特征在于，其含有序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，該序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 15或最佳比對后與序列SEQ IDNo. 15具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列；和/或序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，該序列包含氨基酸序列SEQ ID No. 16或最佳比對后與序列SEQ ID No. 16具有至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%和98%同一性的序列。因而，本發(fā)明描述一種抗體、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上，i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet，所述抗體包括包含氨基酸序列SEQ ID No. 15的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和包含氨基酸序列SEQID No. 16的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。如上所示，本發(fā)明還涉及任何衍生自本發(fā)明所述抗體的化合物。更具體地，本發(fā)明的抗體、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述衍生化合物 由包含肽支架的結(jié)合蛋白組成，所述肽支架上嫁接有至少一個⑶R，以這種方式來保留所有或部分原始抗體的抗體決定簇識別特性。本發(fā)明所述的CDR序列之中的一個或更多個序列還可以出現(xiàn)在各種免疫球蛋白支架上。在這種情況下，蛋白質(zhì)序列使得能夠重新建造適合所嫁接的⑶R進行折疊的肽骨架，使其保留其抗體決定簇抗原-識別特性。通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何確定在其上嫁接至少一個來自原始抗體的CDR的蛋白質(zhì)支架類型。更具體地，已知，要選擇這樣的支架必須滿足如下盡可能多的原則(Skerra A. , J. Mol. Recogn. , 2000, 13:167-187)-良好的系統(tǒng)發(fā)育保守性；-已知的三維結(jié)構(gòu)(如，例如，通過晶體學(xué)、NMR光譜或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何其它技術(shù));-尺寸??；-很少或沒有轉(zhuǎn)錄后修飾；和/或-易于生產(chǎn)、表達和純化。這種蛋白質(zhì)支架的來源可以是，但不限于，選自如下的結(jié)構(gòu)纖維連接蛋白和優(yōu)選III型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域10、脂質(zhì)運載蛋白、抗運載蛋白(anticalin) (SkerraA.，J.Biotechnol. , 2001, 74 (4) : 257-75)、來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白 A的結(jié)構(gòu)域B的蛋白Z、硫氧還蛋白A或帶有重復(fù)基序比如“錨蛋白重復(fù)”(Kohl等人，PNAS,2003，vol. 100, No. 4，1700-1705)、“犰狳蛋白重復(fù)”、“富有亮氨酸重復(fù)”和“三角形四肽重復(fù)(tetratricopeptide repeat)，，的蛋白質(zhì)。來自毒素的支架，比如，例如來自蝎子、昆蟲、植物、軟體動物等的毒素，以及神經(jīng)NO合成酶(PIN)的蛋白抑制劑也應(yīng)當(dāng)提及。這種雜交構(gòu)建的一個實例，絕非限制，是將抗-⑶4抗體的⑶R-Hl (重鏈)，即13B8. 2，插入到PIN的一個環(huán)中，如此獲得的新結(jié)合蛋白保留了和原始抗體相同的結(jié)合特性(Bes 等人,Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2006, 343 (I), 334-344)?；诩兇庹f明性的基礎(chǔ)，也可以提及將抗溶菌酶VHH抗體的CDR-H3 (重鏈)嫁接至新致癌菌素的一個環(huán)上(Nicaise 等人，Protein Science, 2004，13(7) : 1882-1891)。最后，如上所述，這種肽支架可包括I至6個來自原始抗體的⑶R。優(yōu)選，但不是必須的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將選擇至少一個來自重鏈的CDR，后者被認(rèn)為主要和抗體的特異性有關(guān)。一個或更多個相關(guān)的CDR的選擇對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，本領(lǐng)域技術(shù)人員將隨后選擇合適的公知技術(shù)(Bes等人，F(xiàn)EBSletters 508, 2001, 67-74)。本發(fā)明從而涉及抗體、或其衍生化合物或功能片段，特征在于肽支架選自這樣的蛋白質(zhì)a)系統(tǒng)發(fā)育上保守性良好，b)堅固的結(jié)構(gòu)，c)具有公知的三維分子組織，d)尺寸小和/或e)包括可以通過不改變穩(wěn)定特性的刪除和/或插入進行修飾的區(qū)。根據(jù)優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的抗體、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述肽支架選自如下i)來自纖維連接蛋白，優(yōu)選III型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域10、脂質(zhì)運載蛋白、抗運載蛋白、來自金黃色葡萄球菌蛋白A的結(jié)構(gòu)域B的蛋白Z、硫氧還蛋白A或帶有重復(fù)基序比如“錨蛋白重復(fù)” (Kohl等人，PNAS, 2003，vol. 100，No. 4，1700 - 1705)、“犰狳蛋白重復(fù)”、“富有-亮氨酸重復(fù)”和“三角形四肽重復(fù)”的蛋白的支架，或iii)神經(jīng)NO合成酶(PIN)的蛋白抑制劑。本發(fā)明的另一方面涉及上述抗體的功能片段。更具體地，本發(fā)明針對抗體、或其衍生化合物或功能片段，特征在于所述功能片段選自片段Fv、Fab、F (ab ’)2、Fab ’、scFv、scFv-Fc或雙特異抗體、或任何半衰期延長的片段比如聚乙二醇化的片段。根據(jù)本發(fā)明的這種抗體功能片段由，例如，片段Fv、scFv (sc=簡單鏈)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc或雙特異抗體、或任何通過化學(xué)修飾，比如增加聚亞烷基二醇，如聚乙二醇(聚乙二醇化)(聚乙二醇化的片段涉及Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F (ab’)2_PEG和Fab’ -PEG)或通過并入脂質(zhì)體、微球體或PLGA延長半衰期的片段組成，所述片段具有至少一個本發(fā)明特有的CDR，其尤其能夠，以常規(guī)或甚至部分的方式，展現(xiàn)其所來自的抗體的活性。優(yōu)選，所述功能片段將包括或包含其所來自的抗體的可變重鏈或輕鏈的部分序列，所述部分序列足以保留和其所來自的所述抗體相同的結(jié)合特異性和足夠的親和性，親和性優(yōu)選至少等于其所來自的抗體的1/100，更優(yōu)選至少1/10。這種功能片段將含有其所來自抗體的序列的至少5個氨基酸，優(yōu)選6、7、8、10、15、25、50或100個連續(xù)氨基酸。優(yōu)選這些功能片段將屬于Fv、scFv、Fab、F (ab’)2、F (ab，)、scFv_Fc或雙特異抗 體類型，其通常具有和其所產(chǎn)生的抗體相同的結(jié)合特異性。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明抗體的片段可以通過如方法比如酶消化，包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶、和/或通過化學(xué)還原切割二硫橋從上述抗體獲得。所述抗體片段還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的重組遺傳技術(shù)或通過例如自動肽合成儀(比如Applied BioSystems等銷售的那些)的方式進行的肽合成來獲得。為了更加清楚，下表2a總結(jié)了根據(jù)IMGT的對應(yīng)本發(fā)明抗體的各種氨基酸序列，而表2b總結(jié)了根據(jù)Kabat的對應(yīng)本發(fā)明抗體的各種氨基酸序列。表2a (其中Mu. =鼠科)
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合蛋白、或其功能片段或衍生物，其在腫瘤上i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，其特征在于 i)其不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet;和，任選， ii)其不阻斷配體HGF結(jié)合至cMet;和,任選， iii)其在氨基酸殘基I和950之間與cMet的細胞外區(qū)域相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白、或其功能片段或衍生物，其特征在于，其由選自如下的分離的抗體或其功能片段或衍生物組成 a)一種抗體、或其功能片段或衍生物，包括 -輕鏈，所述輕鏈包括根據(jù)頂GT定義的下面3種⑶R，分別為具有序列SEQ IDNo. I的CDR-Ll、具有序列 SEQ ID No. 2 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID No. 3 的 CDR-L3 ;和 -重鏈，所述重鏈包括根據(jù)頂GT定義的下面3種⑶R，分別為具有序列SEQ IDNo. 4的CDR-H1、具有序列 SEQ ID No. 5 的 CDR-H2 和具有序列 SEQ ID No. 6 的 CDR-H3，和 b)一種抗體、或其功能片段或衍生物，包括 -輕鏈，所述輕鏈包括根據(jù)頂GT定義的下面3種⑶R，分別為具有序列SEQ IDNo. 9的CDR-Ll、具有序列 SEQ ID No. 10 的 CDR-L2 和具有序列 SEQ ID No. 11 的 CDR-L3 ;和 -重鏈，所述重鏈包括根據(jù)頂GT定義的下面3種⑶R，分別為具有序列SEQ IDNo. 12的CDR-Hl、具有序列 SEQ ID No. 13 的 CDR-H2 和具有序列 SEQ ID No. 14 的 CDR-H3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體、或其功能片段或衍生物，其特征在于，其選自如下 a)—種抗體、或其功能片段或衍生物，其包括具有氨基酸序列SEQID No. 7的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和具有氨基酸序列SEQ ID No. 8的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域；和 b)一種抗體、或其功能片段或衍生物，其包括具有氨基酸序列SEQ ID No. 15的序列的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和具有氨基酸序列SEQ ID No. 16的序列的重鏈可變結(jié)構(gòu)域。
4.一種能夠分泌根據(jù)權(quán)利要求2或3的抗體的鼠雜交瘤，所述鼠雜交瘤選自保藏于2009年11月18日，CNCM，巴黎巴斯德研究所，保藏號1-4247的雜交瘤和保藏于2009年11月18日，CNCM，巴黎巴斯德研究所，保藏號1-4246的雜交瘤。
5.源自雜交瘤1-4247或1-4246或其亞克隆的單克隆抗體，其腫瘤上i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet。
6.一種分離的核酸，其特征在于其選自以下的核酸 a)編碼如權(quán)利要求I要求的結(jié)合蛋白的核酸、DNA或RNA； b)編碼如權(quán)利要求2、3和5中的一項要求的抗體的核酸、DNA或RNA； c)包含DNA序列的核酸,該DNA序列包含序列SEQID No. 27至32或35至40 ; d)包含DNA序列的核酸，該DNA序列包含序列SEQID No. 33、34、41或42 ； e)如c)或d)中定義的核酸的相應(yīng)的RNA核酸；和 f)如a)、b)、c)和d)中定義的核酸的互補核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的單克隆抗體，或其功能片段或衍生物，用于鑒定配體非依賴激活形式的cMet的用途。
8.一種用于區(qū)分樣本中配體非依賴激活形式的cMet和其它形式的cMet，包括非激活的或配體依賴激活形式的cMet的方法,所述方法包括步驟 a)使所述樣本與根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5的中的一項的抗體，或其功能片段或衍生物接觸，和 b)檢測所述結(jié)合蛋白或抗體與樣本的結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體，或其功能片段或衍生物，用于體外診斷與配體非依賴激活形式的cMet相關(guān)的致癌疾患或通過免疫標(biāo)記確定發(fā)展成與配體非依賴激活形式的cMet相關(guān)的致癌疾患的預(yù)后的用途。
10.一種通過免疫標(biāo)記檢測受試者中配體非依賴激活形式的cMet表達腫瘤的存在和/或位點的方法，其中所述方法包括步驟 a)使來自受試者的樣本與根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體，或其功能片段或衍生物接觸，和 b)檢測所述結(jié)合蛋白或抗體與樣本的結(jié)合。
11.一種通過免疫標(biāo)記確定來自受試者的cMet表達腫瘤中配體非依賴激活形式的cMet表達水平的方法，其中所述方法包括步驟 a)使來自受試者的樣本與根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體，或其功能片段或衍生物接觸，和 b)在所述樣本中定量所述結(jié)合蛋白或抗體與配體非依賴激活形式的cMet結(jié)合的水平。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中通過免疫組織化學(xué)(IHC)測量配體非依賴激活形式的cMet的表達水平。
13.—種通過免疫標(biāo)記診斷受試者中配體非依賴激活形式的cMet表達腫瘤或通過免疫標(biāo)記確定受試者中發(fā)展成配體非依賴激活形式的cMet表達腫瘤的預(yù)后的方法，其中所述方法包括步驟 a)確定根據(jù)權(quán)利要求11的配體非依賴激活形式的cMet的表達水平，和 b)比較步驟a)的表達水平與來自正常組織的配體非依賴激活形式的cMet的參考表達水平。
14.一種通過免疫標(biāo)記確定受試者腫瘤的配體非依賴激活形式的cMet狀態(tài)的方法，其 中所述方法包括步驟 a)確定根據(jù)權(quán)利要求11的配體非依賴激活形式的cMet的表達水平， b)針對所述腫瘤的配體非依賴激活形式的cMet表達水平評分，和 c)比較所述評分與獲對照樣本的評分。
15.一種確定致癌疾患是否對用抗配體非依賴激活形式的cMet結(jié)合蛋白或抗體、或其片段或衍生物的治療敏感的方法，其中所述方法包括步驟 a)通過免疫標(biāo)記確定根據(jù)權(quán)利要求11的受試者腫瘤的配體非依賴激活形式的cMet狀態(tài),和 b)如果狀態(tài)是配體非依賴激活形式的cMet( + )，確定致癌疾患對用抗配體非依賴激活形式的cMet結(jié)合蛋白或抗體、或其片段或衍生物的治療敏感。
16.一種試劑盒，其包括至少根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體、或其功能片段或衍生物，所述結(jié)合蛋白或抗體是被標(biāo)記的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的試劑盒用于通過免疫標(biāo)記檢測受試者中配體非依賴激活形式的cMet表達腫瘤的存在和/或位點，所述試劑盒進一步包括對檢測所述標(biāo)記的結(jié)合蛋白或抗體與配體非依賴激活形式的cMet間結(jié)合程度有用的試劑。
18.—種包括抗體的結(jié)合蛋白、或其功能片段或衍生物，其特征在于其與根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體交叉競爭結(jié)合配體非依賴激活形式的 cMet。
19.根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體、或其功能片段或衍生物，用于鑒定能夠特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet的包括抗體的結(jié)合蛋白中的用途。
20.一種鑒定配體非依賴激活形式的cMet的結(jié)合配偶體的方法，其特征在于，其包括步驟 a)使配體非依賴激活形式的cMet與根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體、或其功能片段或衍生物接觸； b)使a)的復(fù)合物與化合物庫接觸， c)鑒定破壞a)的復(fù)合物的化合物。
21.—種純化配體非依賴激活形式的cMet的方法，其特征在于其包括以下步驟 a)在允許所述結(jié)合蛋白或抗體與配體非依賴激活形式的cMet特異地結(jié)合的條件下，根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體或其功能片段或衍生物與樣本進行孵育；和 b)從樣本中分離結(jié)合蛋白或抗體，并獲得純化的配體非依賴激活形式的cMet。
22.由根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體、或其功能片段或衍生物與配體非依賴激活形式的cMet結(jié)合形成的復(fù)合物。
23.根據(jù)權(quán)利要求I的結(jié)合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求2、3和5中的一項的抗體、或其功能片段或衍生物作為意圖使生物活性化合物特異地靶向表達配體非依賴激活形式的cMet的細胞的媒介的用途。
24.一種生產(chǎn)抗體、或其功能片段或衍生物的方法，其i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet,但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet,所述方法的特征在于其包括步驟 a)用轉(zhuǎn)染的或表達cMet蛋白或其片段的腫瘤細胞系免疫動物； b)從動物中取出抗體產(chǎn)生細胞； c)將所述抗體產(chǎn)生細胞與骨髓瘤細胞融合，從而獲得雜交瘤細胞； d)進行篩選分析，從而選擇產(chǎn)生抗體的雜交瘤細胞，其中抗體i)特異地結(jié)合配體非依賴激活形式的cMet，但ii)不結(jié)合非激活的和/或配體依賴激活形式的cMet ； e)在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生抗體的選擇的雜交瘤；以及 f )從細胞培養(yǎng)物取出抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其特征在于所述步驟d)的篩選分析由IHC篩選分析組成，所述IHC篩選分析優(yōu)選包括步驟 a)從表達不同形式cMet的腫瘤中收集組織切片， b)使用權(quán)利要求24的雜交瘤細胞，同時在步驟a)的不同的組織切片上進行IHC染色，步驟c),c)選擇在 表達配體非依賴激活形式的CMet的組織切片上具有特異反應(yīng)，而在其它組織切片上沒有反應(yīng)的雜交瘤細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及患者中增殖性疾病的預(yù)后和/或診斷領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及能夠特異性結(jié)合人cMet受體的新型抗體，以及編碼這些抗體的氨基酸和核酸序列。同樣地，本發(fā)明包括所述抗體的用途、和相應(yīng)的用于檢測和診斷與cMet表達相關(guān)的病理性過度增殖的致癌疾患的方法。在特定實施方式中，所述疾患是相對于正常而言與增加的cMet多肽表達有關(guān)的致癌疾患，或與cMet過度表達關(guān)聯(lián)的任何其它病理。最后，本發(fā)明包括包含至少用于特定癌癥預(yù)后或診斷的此種抗體的產(chǎn)品和/或組合物或試劑盒。
文檔編號G01N33/574GK102971343SQ201180032337
公開日2013年3月13日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月29日
發(fā)明者A·茹阿諾 申請人:皮埃爾法布雷醫(yī)藥公司