專利名稱：組蛋白瓜氨酸肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衍生自組蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在診斷自體免疫疾病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中的應(yīng)用。當前技術(shù)水平類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是以T和B細胞介導(dǎo)的自體免疫機制為特征的炎性關(guān)節(jié)病。在RA患者的生物液體中能檢測到不同的自體抗體。一些這種自體抗體能用于RA診斷和跟
I 示。最著名的RA生物標記是類風(fēng)濕因子(RF)，這是針對免疫球蛋白IgG同種型Fe區(qū)的IgG或IgM類抗體。然而，由于其也能在其他病理條件和老年健康個體中發(fā)現(xiàn)，RF不是特異性的RA標記。使用抗核周因子和抗角蛋白抗體發(fā)現(xiàn)RA中涉及瓜氨酸(cit)表位推·進了新型高特異性RA生物標記的鑒定。不同的瓜氨酸肽和蛋白用于設(shè)定特異和靈敏的診斷試驗，能識別RA自體抗體，因此通常稱為抗瓜氨酸肽(CP)抗體(ACPA) [US20020143143，US20070087380, EP1946109, US20070148704, W02009007846, W02009000077, W02007017556,EP1456662, W01999028344, W02008132264] 與RA相關(guān)的所有蛋白中，下列瓜氨酸序列用于診斷試驗:纖維蛋白[C. Masson-BessiSre 等，J. Tmmuno 1. 2001, 166，4177],膠原 II [H.Burkhardt 等，Eur. J. Tmmuno1. 2005, 35, 1643]，波形蛋白[E. R. Vossenaar 等，ArthritisRheum. 2004，50，3485]，絲聚蛋白[US20090028885, US7445903, US6890720]，和病毒蛋白[C. Anzilotti 等，J. Rheumatol. 2006，33，647 ;W02004087747]。測試的靈敏度通過使用絲聚蛋白衍生的合成環(huán)瓜氨酸肽(CCP)來增加，[G. A. Schellekens 等，J. Clin. Invest. 1998，101，273] [W01998022503]，所述環(huán)瓜氨酸肽特征為使瓜氨酸最佳暴露以用于抗體結(jié)合的結(jié)構(gòu)。目前，發(fā)展出三代CCP測試CCP1(靈敏度68%,特異性 98%) [G. A. Schellekens 等，Arthritis Rheum. 2000，43，155]，CCP2 (靈敏度范圍 39-94%,特異性范圍 81-100%) [J. Avouac 等，Ann. Rheum. Dis. 2006，65，845]，和 CCP3 (靈敏度范圍 51-83%,特異性范圍 93-98%) [L. Lutteri 等，Clin. Chim. Acta2007, 386，76]。這些RA診斷ELISA都市售可得(荷蘭阿納姆的ED公司(Euro-Diagnostica);蘇格蘭敦提的軸盾公司(Axis-Shield);美國圣地亞哥的INOVA公司)。近來，使用愛潑斯坦-巴爾病毒的EBNA-1 (VCPI)和EBNA-2 (VCP2)衍生的瓜氨酸序列能設(shè)定特征為特異性和靈敏度與CCP2和CCP3測試報道的那些相似的診斷試驗[F. Pratesi 等，Arthritis Rheum. 2006, 54, 733; C. Anzilotti 等，J. Rheumatol. 2006, 33, 647;TO2004087747;EP091767764]。有趣的是，基于 CCP2、CCP3、VCP1 和 VCP2 的測試性能比較表明不同的瓜氨酸序列能檢測相同患者組中抗CP抗體的不同亞組。這些結(jié)果證明與XG或XnonG單位(X=瓜氨酸)的假設(shè)獨有作用相比，瓜氨酸殘基周圍的氨基酸序列在形成抗CP表位中起重要作用[EP1693673]。通過組蛋白表示與其他自體免疫疾病相關(guān)但尚未直接涉及RA診斷的另一類蛋白。組蛋白是核小體的成分，并且分成六類H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。從Hl和H2B衍生的序列用于檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡、RA和系統(tǒng)性硬化病中的自體抗體[W003044054]。即使已知這些蛋白是天然脫亞胺并且通常被修飾[K. Arita等，PNAS2006, 103, 5291 ;A. J. ff. Zendman等，Anal. Biochem. 2007, 369，232]，至今沒有組蛋白瓜氨酸序列與RA相關(guān)。然而，描述用于抗體檢測的基于使用經(jīng)修飾組蛋白(如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化)但不是瓜氨酸化的微陣列[W007132177]。 Osborne 等[Biochemistry, 2007，46(46)，13370-13381]描述了在位點 17 和 19 有瓜氨酸殘基的組蛋白H4片段(1-21)的化學(xué)合成以用于酶學(xué)研究。Wysocka 等[Frontiers in Bioscience, 2006, 11, 344-355]公開了體內(nèi)僅在位點3被瓜氨酸化的組蛋白H4和由體外脫氨可得的在位點3、17和19有瓜氨酸殘基的組蛋白H4。Hagiwara 等[Biochemistry, 2005, 44 (15), 5827-5834]公開了在位點 3 有 Cit 的組蛋白H4片段(1-23)和(1-5)。W02009/147201公開了結(jié)合劑，例如與包含酶促瓜氨酸組蛋白H4在內(nèi)的瓜氨酸肽特異性結(jié)合的抗體。這些結(jié)合劑用于預(yù)防或治療自體免疫疾病，特別是RA。W02010/117694公開了包含位點23和95處瓜氨酸殘基的組蛋白H4片段組合的序列。W02004/078098公開了與組蛋白不相關(guān)并且主要由瓜氨酸殘基組成的肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及衍生自核心組蛋白H4的瓜氨酸合成肽，及其在診斷自體免疫疾病特別是RA中的應(yīng)用。RA中組蛋白脫亞氨基作用的研究產(chǎn)生衍生自H4的一系列瓜氨酸序列的定義。這些序列能識別對RA特異的自體抗體。根據(jù)本發(fā)明的瓜氨酸肽衍生自人H4的氨基酸序列，特別是衍生自包含所述序列氨基酸(aa)l_aa50的序列(Swiss-PiOtP62805aa2-aa51)。因此本發(fā)明的目標是通過以下定性肽-抗原有效性和能特異結(jié)合自體免疫疾病特異性抗體，和-從氨基到羧基末端包含氨基酸序列S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K PA I X5X6LA X7X8G G V K X9I S G L I (SEQ ID No. I,式I，也稱為H4 (1-50))或其至少7個氨基酸長的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，并且X1-X9中至少兩個是瓜氨酸殘基。本發(fā)明所述的和具有至少兩個瓜氨酸殘基的肽，顯示對RA的特異診斷非常合適。對包含至少7個aa殘基和衍生自H4 (1-50)(式I)的更短肽序列特別感興趣。優(yōu)選所述肽是SEQ ID No. I的功能片段，并且包含所述氨基酸序列S G X1G K G GKGLGKGGAKX2H X3K (SEQ ID No. I 的 aal_aa20)或G A KX2H X3K V L X4D N I Q GITKPA I (SEQ ID No. I 的 aal4_aa34，也稱為 H4 (14-34))或 K P A I X5X6L A X7X8G GV K X9I S G L I (SEQ ID No. I 的 aa31_aa50，也稱為 H4 (31-50))或其至少 7 個氨基酸長的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，并且X1-X7中至少兩個是瓜氨酸殘基。優(yōu)選，所述肽包含序列S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K VL CitD N I Q G I T K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit I S G L I(SEQ ID No. 1，其中所有X1-X9是瓜氨酸(CU)殘基，式II)或是其至少7個氨基酸長的功能片段。優(yōu)選，所述肽包含選自下組的序列SGCitGKGGKGLGKGGA KCit HCit K(SEQ ID No. I 的 aal-aa20，其中 X1-X3 是瓜氨酸(Cit)殘基，式 III)，G A K Cit HCit K V L Cit D N I Q G I T K P A I (SEQ ID No. I 的 aal4_aa34，其中 X2-X4 是瓜氨酸(Cit)殘基，式 IV)，K P A I Cit Cit L A Cit Cit G G V K Cit IS G L I (SEQ ID No. I的aa31_aa50，其中&_\是瓜氨酸(CU)殘基，式V)或是其至少7個氨基酸長的功能片段。優(yōu)選，上述肽是線形形式或多亞基分支肽形式或其他偶聯(lián)復(fù)合體形式。多亞基分支肽優(yōu)選由以下組成-MAP 核結(jié)構(gòu)； -有式III、IV和/或V的氨基酸序列的線形肽，通過化學(xué)鍵結(jié)連接每一個MAP核結(jié)構(gòu)的氨基末端殘基，其中線形肽彼此相同或不同。根據(jù)本發(fā)明，MAP核結(jié)構(gòu)是
權(quán)利要求
1.一種肽，所述肽的特征為 -抗原有效性和能特異結(jié)合自體免疫疾病特異性抗體，和 -從氨基到羧基末端包含氨基酸序列S G X1G K G G K G L G K G G A K X2H X3K V L X4D N I Q G I T K PA I X5X6L AX7X8G G V K X9I S G L I (SEQ ID No. I)或其至少7個氨基酸長的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，并且X1-X9中至少兩個是瓜氨酸殘基。
2.如權(quán)利要求I所述的肽，其特征在于，所述SEQID No. I的功能片段包含所述氨基酸序列 Sgx1Gkggkglgkggakx2H x3k (seq idno. I 的 aai-aa20)或g a k x2hX3K V L X4D N I Q G I T K P A I (SEQ IDNo. I 的 aal4_aa34)或K P A I X5X6L A X7X8G GV K X9I S G L I (SEQ IDNo. I的aa31_aa50)或其至少7個氨基酸長的功能片段，其中所述氨基酸X1-X9獨立選自精氨酸殘基或瓜氨酸殘基，并且X1-X7中至少兩個是瓜氨酸殘基。
3.如權(quán)利要求I所述的肽，其特征在于，所述肽包含序列SG Cit G K G GK G L G K GG A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I Cit Cit L A Cit CitG G V K CitISGL I (SEQ ID No. I，其中所有X1-X9是瓜氨酸(CU)殘基，式II)或其至少7個氨基酸長的功能片段。
4.如權(quán)利要求2所述的肽，其特征在于，所述肽包含選自下組的序列SGCit G K G GK G L G K G G A K Cit H Cit K (SEQ ID No. I 的 aal_aa20，其中 X1-X3 是瓜氨酸(Cit)殘基)，G A K Cit H Cit K V L Cit D N I Q G I T K P A I(SEQ ID No. I 的 aal4_aa34，其中 X2-X4 是瓜氨酸(Cit)殘基)，K P A I Cit Cit LA Cit Cit G G V K Cit I S G LI (SEQ ID No. I的aa31_aa50，其中X5-X9是瓜氨酸(CU)殘基)或其至少7個氨基酸長的功能片段。
5.如前述權(quán)利要求中任一項所述的肽，其特征在于，所述肽是線形的。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的肽，其特征在于，所述肽是多亞基分支肽的形式。
7.如權(quán)利要求6所述的肽，其特征在于，所述肽包含4個如權(quán)利要求1-4所述肽的相同拷貝。
8.如權(quán)利要求7所述的肽，其特征在于，所述肽選自(S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit K) 4K2K ^ A, S G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H CitS G Cit G K G G K G L G K G G A K Cit H Cit \
9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的肽，其特征在于，所述自體免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
10.一種診斷對象中自體免疫疾病的方法，所述方法包含在生物樣品中檢測自體免疫疾病特異性抗體的步驟，通過 -合適條件下使所述生物樣品與至少一種如權(quán)利要求1-9中任一項所述的肽反應(yīng)以產(chǎn)生復(fù)合物； -檢測所述復(fù)合物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述生物樣品與包含序列(GAK Cit H
12.如權(quán)利要求10或11中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法是免疫學(xué)試驗。
13.一種自體免疫疾病的診斷藥盒，所述藥盒包括至少一種如權(quán)利要求1-9中任一項所述的肽，或其至少7個氨基酸長的功能片段。
14.如權(quán)利要求13所述的藥盒,其特征在于,所述藥盒包含所述序列(GAK Cit H Cit
15.如權(quán)利要求10所述的方法或權(quán)利要求13所述的藥盒，其特征在于，所述自體免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
16.針對如權(quán)利要求1-9中任一項所述的肽的抗體，所述抗體用于自體免疫疾病的診斷試驗。
17.如權(quán)利要求16所述的抗體，其特征在于，所述自體免疫疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明涉及衍生自組蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在診斷自身免疫疾病特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)中的應(yīng)用。
文檔編號G01N33/68GK102971339SQ201180031890
公開日2013年3月13日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月2日
發(fā)明者F·普拉泰西, M·C·阿爾卡洛, M·切利, F·羅利, I·寶里尼, A·M·帕皮尼, P·羅維霍, P·米廖里尼 申請人:托斯卡納生物標志有限公司