一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原及其應(yīng)用；該抗原的制備首先由來(lái)源于絲聚合蛋白 / 中間絲蛋白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三個(gè)小分子抗原肽通過(guò)甘氨酸連接嵌合而成，再通過(guò)在嵌合肽的N端及C端插入的兩個(gè)半胱氨酸以形成二硫鍵，合成了一條具有與蛋白質(zhì)β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)相似的環(huán)狀多肽。將該環(huán)狀嵌合肽抗原包被在固相載體上，制成間接酶聯(lián)免疫試劑盒，用于檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）血清中的多種抗瓜氨酸肽抗體亞型。本發(fā)明公布的環(huán)狀多肽抗原及其ELISA試劑盒制備及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程簡(jiǎn)單，其對(duì)RA的檢測(cè)敏感性和診斷價(jià)值較國(guó)際同類試劑盒顯著提高，結(jié)果重復(fù)性好，并可定性或定量，具有廣泛的臨床應(yīng)用和科學(xué)研究?jī)r(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于臨床免疫及醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原 及其應(yīng)用，設(shè)計(jì)合成一種能被多數(shù)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血清特異識(shí)別的環(huán)狀瓜氨酸嵌合多肽 (cyclic chimeric citrullinated peptide, CCCP)及其應(yīng)用于檢測(cè)相關(guān)抗體的酶聯(lián)免疫 試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA)是一種常見(jiàn)的慢性自身免疫性疾 病。在全世界大約有1%的人罹患此病。RA能引起關(guān)節(jié)的疼痛、僵直及腫脹。在發(fā)病1-2 年內(nèi)即可能出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)損傷，并可引起多種并發(fā)癥。及早診斷RA及給予緩解病 情的藥物治療，對(duì)控制病情時(shí)，改善預(yù)后非常重要（Gabriel SE. The epidemiology of rheumatoid arthritis. Rheum Dis Clin North Am 27 (2001) 269-281)〇
[0003] 目前診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是基于綜合臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)檢查的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì) (ACR)的分類標(biāo)準(zhǔn)（The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 1988;31:315 - 24.)。臨床醫(yī)生上在應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的指標(biāo)時(shí)受主觀因素影響較大，加上疾病本身在個(gè)體 上臨床表現(xiàn)的多樣性，經(jīng)常出現(xiàn)誤診或漏診。而由于缺乏高度敏感性或特異性的原因，當(dāng)前 尚無(wú)很理想的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。
[0004] 2000年，國(guó)外首次報(bào)道的抗環(huán)瓜氨酸肽（cyclic cirullinated peptide, CCP) 抗體的檢測(cè)，對(duì)RA具有很高的特異性（>93%)，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的類風(fēng)濕因子（RF),是實(shí)驗(yàn) 診斷RA很有前途的血清標(biāo)志物。后續(xù)的研究表明，CCP抗體不僅是RA早期診斷指標(biāo)， 而且是鑒別侵蝕性、非侵蝕性RA的靈敏指標(biāo)（Shankar S et al. Role of anti cyclic citrullinated peptide antibodies in erosive disease in patients with rheumatoid arthritis. Indian J Med Res. 2006 Dec; 124(6) :689-96.)。與 CCP 抗體陰性的患者 相比，抗CCP抗體陽(yáng)性的RA病人通常出現(xiàn)或易發(fā)展成更嚴(yán)重的關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。所以該血 清標(biāo)志物一經(jīng)問(wèn)世，就很受歡迎，現(xiàn)已在國(guó)際上得到廣泛應(yīng)用。但是，綜合報(bào)道顯示，抗 CCP抗體對(duì)RA的敏感度僅在60%-72%，不及低特異性的RF (65%-85%)，目前CCP仍無(wú)法完 全替代 RF 及其它 RA 相關(guān)的自身抗體（Taylor P et al. A systematic review of serum biomarkers anti-cyclic citrullinated Peptide and rheumatoid factor as tests for rheumatoid arthritis. Autoimmune Dis. 2011:815038)(Bas S et al. Diagnostic tests for rheumatoid arthritis: comparison of anti-cyclic citrullinated peptide antibodies, anti-keratin antibodies and IgM rheumatoid factors. Rheumatology (Oxford) 2002;41:809 - 14.)。因此，為了減少漏診率，臨床醫(yī)生仍需聯(lián)合檢測(cè)RF,抗 CCP抗體或其它血清標(biāo)志物，從而增加了病人的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。這樣，提高RA患者血清中CCP抗 體的檢測(cè)敏感性，是擺在醫(yī)學(xué)科研人員面前的一個(gè)重要任務(wù)。
[0005] 抗CCP抗體是風(fēng)濕病自身抗體系統(tǒng)的一種，以IgG型為主。該抗體針對(duì)的抗原為 絲聚合蛋白/中間絲蛋白（filaggrin)的多肽片段。應(yīng)用基于filaggrin的cDNA序列而合 成的多肽，Schellekens和Girbal Neuhause于1998年首先證實(shí)了瓜氨酸殘基是類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎特異的抗filaggrin抗體識(shí)別抗原表位的必需組成部分（Schellekens GA et al. Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies. J Clin Invest1998;101:273 -81.)。他們通過(guò)對(duì)各個(gè)序列號(hào)的filggrin氨基酸序列進(jìn)行分析，合成了一條以瓜氨酸代替 精氨酸的小分子肽鏈。并試驗(yàn)證明了該瓜氨酸小分子肽鏈能被一部分RA血清所高度特異 識(shí)別。兩年后，Schellekens的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將一條瓜氨酸短肽中的絲氨酸替換為半胱氨 酸，合成了環(huán)瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide, CCP)，并將其應(yīng)用于檢測(cè)RA患者 血清中的抗環(huán)瓜氨酸肽抗體，敏感性得到了進(jìn)一步的提高（Schellekens GA et al. The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide. Arthritis Rheum2000;43:155 - 63.)。該技術(shù)一出現(xiàn)，立即 備受關(guān)注，現(xiàn)已被多家國(guó)際主要的商品化的CCP試劑盒所采用。然而，臨床評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明， 雖然這些CCP試劑盒對(duì)RA的特異性較高（90%-97%)，但其敏感性（62-72%)仍待提高，綜合 診斷價(jià)值還不很理想（Nishimura K et al. Meta-analysis: diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis. Ann Intern Med.2007Jun5;146(11):797_808)。目前商品化的CCP試劑盒 的共同缺點(diǎn)是用于檢測(cè)環(huán)瓜氨酸肽抗體的多肽抗原一般只含有單一的抗原表位，只能檢出 一部分瓜氨酸肽抗體亞型，而且不同廠家采用合成肽抗原的氨基酸序列不同，經(jīng)常造成檢 測(cè)結(jié)果的差異，給臨床醫(yī)生對(duì)RA的診斷造成困擾。
[0006] 基于以上背景，我們的研究采用創(chuàng)新的思路，首先應(yīng)用RA病人血清篩查出針對(duì)該 病高度特異的幾個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位(瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2,瓜氨酸肽3)，并發(fā)現(xiàn)不同RA病 人的血清對(duì)這些抗原多肽的識(shí)別存在明顯差異。如有些RA患者的血清只識(shí)別瓜氨酸肽1， 部分血清只識(shí)別瓜氨酸肽2或瓜氨酸肽3,而有些類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血清則能同時(shí)識(shí)別多種 抗原決定簇(瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2,瓜氨酸肽3)。這樣，如果與當(dāng)前的商業(yè)化試劑盒一 樣，只采用含單一抗原表位的合成肽，必將漏檢相當(dāng)一部分瓜氨酸肽抗體亞型，客觀上限制 了檢測(cè)敏感性的提高。而同時(shí)包被以上三條合成肽于ELISA板，由于短肽之間對(duì)有限包被 位點(diǎn)的相互競(jìng)爭(zhēng)，也對(duì)敏感性的提高造成技術(shù)上的困難。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原及其應(yīng)用，設(shè)計(jì)合成一種對(duì)類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有高度特異并含有多個(gè)絲聚合蛋白/中間絲蛋白（filaggrin)優(yōu)勢(shì)抗原表 位的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽（CCCP)，并將其應(yīng)用于制備檢測(cè)相關(guān)抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，以克 服目前商品化CCP試劑盒只能檢測(cè)一種瓜氨酸肽抗體亞型的局限性，從而提高檢測(cè)CCP抗 體的敏感性，改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)診斷水平。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原，該抗原由瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三個(gè)小分 子合成肽通過(guò)甘氨酸連接嵌合，再通過(guò)在嵌合肽的N端及C端插入的半胱氨酸產(chǎn)生的二硫 鍵，從而形成了具有與蛋白質(zhì)￠-轉(zhuǎn)角相似結(jié)構(gòu)的環(huán)狀嵌合肽，其氨基酸序列如下： CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC 其中X為瓜氨酸。
[0009] 所述多肽具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其富含瓜氨酸殘基的氨基酸序列包含了來(lái)源于絲聚合蛋 白/中間絲蛋白中能被類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異識(shí)別的多個(gè)抗原表位。
[0010] 線性瓜氨酸嵌合肽，瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3的氨基酸序列如下(其中 X為瓜氨酸）： 線性瓜氨酸嵌合肽： XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX； 瓜氨酸肽 I (CPl) :XGGXQGSYHEQSVDX; 瓜氨酸肽 2 (CP2) :HGQSGPXSASXQTX; 瓜氨酸肽 3(CP3) :GXXQDSSVVGX。
[0011] 其中，各瓜氨酸化的合成肽序列來(lái)源于絲聚合蛋白/中間絲蛋白（filaggrin),由 FMOC固相合成方法合成，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC)分析和純化，抗原純度達(dá)到90%以上。
[0012] 所述的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原（CCCP)在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用，是將CCCP抗原包被 在固相載體上，用于抗瓜氨酸肽抗體的檢測(cè)。
[0013] 其中，所述的固相載體包括聚乙烯微孔板、硝酸纖維素膜（NC)和聚偏二氟乙烯膜 (PVDF膜）或微球（beads )等。
[0014] 所述的抗瓜氨酸肽抗體的檢測(cè)方法包括間接ELISA法，具體為：將環(huán)狀瓜氨酸嵌 合肽抗原（CCCP)抗原包被在酶標(biāo)板上，制成間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其組成如下： (1) 包被CCCP抗原的ELISA板； (2) 辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體； (3) TMB底物顯色液； (4) IM硫酸反應(yīng)終止液； (5) 磷酸鹽-Tween 20洗滌液（PBST); (6) 標(biāo)本稀釋液：含1%的小牛血清白蛋白的磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST); (7) CCCP抗體校準(zhǔn)品； (8) 陰性及陽(yáng)性對(duì)照血清。
[0015] 進(jìn)一步的，所述的包被CCCP抗原的ELISA板的制備過(guò)程為： (1) 將CCCP抗原用pH 9. 6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋至20 i! g / ml，每ELISA板孔加 100ul，4°C 過(guò)夜； (2) 次日用PBST洗滌2次； (3) 每孔加入IOOul含1%的牛血清白蛋白的封閉液，放置37°C孵育2小時(shí)封閉ELISA 板，后用PBST洗滌3次，拍干；（4)該ELISA板可立即用于檢測(cè)抗瓜氨酸肽抗體或密封防潮 避光保存于4°C。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明原創(chuàng)性設(shè)計(jì)合成的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原，包含了來(lái)源于filaggrin蛋白，能被 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血清特異識(shí)別的多個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位。這種新型的抗原具有如下的多個(gè)結(jié)構(gòu) 優(yōu)點(diǎn)：（1)嵌合了多個(gè)代表優(yōu)勢(shì)抗原表位的短肽，增加了檢出各類抗瓜氨酸肽抗體亞型的 機(jī)率，從而提高了檢測(cè)敏感性；（2)環(huán)狀的多肽結(jié)構(gòu)不僅可以增加多肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，還 便于暴露抗原表位，增加了多肽的抗原性，進(jìn)一步提高了敏感性；；（3)與Schellekens采 用的替換源序列的絲氨酸為半胱氨酸的方法不同，本發(fā)明的環(huán)狀多肽的結(jié)構(gòu)合成是通過(guò)在 嵌合肽的N端及C端直接插入額外的兩個(gè)半胱氨酸而形成的二硫鍵，這樣有助于保持源 序列的完整性；（4)通過(guò)在各小分子瓜氨酸肽間插入甘氨酸，可以避免因不同抗瓜氨酸肽 抗體亞型與該嵌合肽抗原結(jié)合時(shí)所產(chǎn)生的空間位阻現(xiàn)象；（5)該嵌合肽抗原既利用了環(huán)狀 合成肽易與抗體結(jié)合的特點(diǎn)，還能避免多條短肽同時(shí)包被于ELISA板而產(chǎn)生的位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn) 象；（6)由于環(huán)狀嵌合肽抗原("大環(huán)肽"）含有的氨基酸數(shù)量較只含單一抗原表位的環(huán)狀短 肽("小環(huán)肽"）明顯增多，其較大的分子量使之更易于包被于固相載體如ELISA板，纖維素 膜上；（7)與化學(xué)提純的天然抗原和重組多肽抗原相比，該嵌合肽具有制備簡(jiǎn)單，質(zhì)量穩(wěn)定 等特點(diǎn)，且不含與待檢抗體無(wú)關(guān)的氨基酸序列，有助于避免與其他自身抗體的交叉反應(yīng)，從 而保證了高特異性。
[0017] 由于嵌合了多個(gè)對(duì)RA特異的抗原表位，以純化的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽為檢測(cè)抗原 的酶聯(lián)免疫（ELISA)試劑盒具有同時(shí)檢測(cè)多種抗瓜氨酸肽抗體亞型的能力，因此能夠在保 證高特異性（94. 7%)的前提下，將其對(duì)RA的檢測(cè)敏感性提高到82. 7%，顯著領(lǐng)先于目前國(guó)際 上同類瓜氨酸肽抗體檢測(cè)試劑盒70%以下的敏感性，在診斷價(jià)值上明顯優(yōu)于其他的CCP商 業(yè)化試劑盒。本發(fā)明的ELISA試劑盒制備過(guò)程簡(jiǎn)單，其檢測(cè)抗瓜氨酸肽抗體的準(zhǔn)確性高，重 復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，并可定性或定量，可廣泛應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測(cè)及科學(xué)研究，具有很好的 應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1含多種抗原表位的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽（CCCP)與線性瓜氨酸嵌合肽（LCCP)，以 及與含單一抗原表位的三種瓜氨酸合成肽（CP1，CP2，CP3)在檢測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血 清中相關(guān)抗體的敏感性（sensitivity)比較。
[0019] 圖2本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒（CCCP)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者及其對(duì)照組血清 的結(jié)果分布。圖中虛線（24Au/ml)為陽(yáng)性界值，受檢者包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA) 150例， 疾病對(duì)照組168例：其中硬皮?。⊿cleroderma，Scl) 15例，混合結(jié)締組織病（MCTD) 15例， 系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE) 27例，銀屑?。≒soriasis) 10例，干燥綜合征（SS) 13例，其它疾病 (other diseases) 88 例，以及健康對(duì)照（Healthy) 60 例。
[0020] 圖3本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒（CCCP)與兩種國(guó)際同類試劑盒的診斷價(jià)值對(duì)比 (受試者工作特征曲線，receiver operating characteristic curve，簡(jiǎn)稱ROC 曲線)。AUC: ROC曲線下方區(qū)域面積；RA :類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；Controls :疾病及健康對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不僅限于此。
[0022] 實(shí)施例1 : 1.瓜氨酸肽序列的合成及應(yīng)用 首先應(yīng)用類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清篩選出三個(gè)針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異識(shí)別，來(lái)源于 filaggrin蛋白富含瓜氨酸的優(yōu)勢(shì)抗原表位（瓜氨酸肽1，瓜氨酸肽2和瓜氨酸肽3)，然后 經(jīng)甘氨酸（G)連接嵌合而成，并通過(guò)在嵌合肽的N端及C端各插入一個(gè)半胱氨酸（C)而形 成的二硫鍵，最終設(shè)計(jì)合成出一條包含上述三個(gè)抗原表位，具有蛋白3 -轉(zhuǎn)角相似結(jié)構(gòu)的 環(huán)狀嵌合肽抗原（CCCP)。
[0023] 該多肽由多肽生化公司采用FMOC固相合成方法自動(dòng)或人工合成，經(jīng)HPLC分析和 純化，抗原純度達(dá)到90%以上。其相關(guān)的氨基酸序列如下（X為瓜氨酸） ： (1) 含多抗原表位的瓜氨酸嵌合肽氨基酸序列 環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽（CCCP): CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC 線性瓜氨酸嵌合肽（LCCP): XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX (2) 含單個(gè)抗原表位的瓜氨酸肽氨基酸序列 瓜氨酸肽 I (CPl) XGGXQGSYHEQSVDX 瓜氨酸肽 2 (CP2) HGQSGPXSASXQTX 瓜氨酸肽 3 (CP3) GXXQDSSVVGX 2.包被瓜氨酸肽抗原于ELISA板 以純化的瓜氨酸肽抗原包被酶標(biāo)板，發(fā)展出一種間接酶聯(lián)免疫（ELISA)試劑盒，用于檢 測(cè)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人血清中的抗瓜氨酸肽IgG抗體。
[0024] 將瓜氨酸嵌合肽抗原用碳酸鹽包被緩沖液（PH 9. 6)稀釋至20 ii g /ml，每ELISA 板孔加l〇〇ul，4°C過(guò)夜。次日用磷酸鹽TWEEN 20緩沖液（PBST)洗滌2次。然后每孔加 入IOOul含1%的牛血清白蛋白的封閉液（PBST)，放置37°C孵育2小時(shí)封閉ELISA板，后用 PBST洗滌3次，拍干，該ELISA板可立即用于檢測(cè)抗瓜氨酸肽抗體或密封防潮避光保存于 4。。。
[0025] 3.間接法ELISA檢測(cè)抗環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗體（1)加樣：將1:100稀釋的患 者血清（含待檢抗體）IOOul加入上述已包被環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽（CCCP)的ELISA反應(yīng)孔 中，同時(shí)做空白（樣本稀釋液)、瓜氨酸肽抗體校準(zhǔn)品，陰性對(duì)照（健康人血清）及陽(yáng)性對(duì)照 (瓜氨酸肽抗體陽(yáng)性的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血清)。然后將ELISA板置37°C孵育1小時(shí)后， PBST洗滌3次。
[0026] (2)添加酶標(biāo)二抗：于反應(yīng)孔中，加入HRP酶標(biāo)記的第二抗體（羊抗人IgG抗體） 100ul，37°C孵育45分鐘，PBST洗滌3次。（3)加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入TMB顯 色液IOOul ,室溫避光孵育30分鐘。（4)終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入IM硫酸IOOul,混 勻10秒。
[0027] (5)結(jié)果檢測(cè)及判定：在ELISA檢測(cè)儀上，選擇主波長(zhǎng)450nm，副波長(zhǎng)620nm讀取光 密度（OD)值，并以空白對(duì)照孔調(diào)零。
[0028] 4?結(jié)果判定 樣本結(jié)果=(樣本孔OD /校準(zhǔn)孔0D) X參考值（30 Au/ml))。
[0029] 陽(yáng)性臨界值為24Au/ml (從ROC曲線上選擇)，樣本結(jié)果高于或等于陽(yáng)性界值為抗 CCCP抗體陽(yáng)性，反之為陰性。
[0030] 實(shí)施例2: 分別包被含多抗原表位的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽（CCCP)和線性瓜氨酸嵌合肽（LCCP)以及 含單一抗原表位的瓜氨酸肽KCPl)，瓜氨酸肽2 (CP2)，瓜氨酸肽3(CP3)短肽于ELISA板， 同時(shí)檢測(cè)50例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎血清。如圖1所示，以ELISA光密度（OD) 0. 2作為陽(yáng)性的 界值，環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽對(duì)RA血清的檢測(cè)敏感性達(dá)83%，遠(yuǎn)優(yōu)于線性瓜氨酸嵌合肽（72%)， 瓜氨酸肽1 (45%)，瓜氨酸肽2 (29%)和瓜氨酸肽3 (31%)。
[0031] 實(shí)施例3: 對(duì)本發(fā)明的ELISA試劑盒進(jìn)行臨床驗(yàn)證，分別檢測(cè)了 150例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)病 人，疾病對(duì)照組168例：其中硬皮?。⊿cleroderma，Scl)15例，混合結(jié)締組織病（MCTD) 15 例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE) 27例，銀屑?。≒soriasis) 10例，干燥綜合征（SS) 13例，其它疾 ?。╫ther diseases) 88例，以及健康對(duì)照（Healthy)60 例。
[0032] 結(jié)果見(jiàn)圖2。以24AU/ml作為陽(yáng)性的界值（圖中虛線)，發(fā)現(xiàn)絕大部分（82. 7%)RA顯 示陽(yáng)性結(jié)果，而疾病對(duì)照陽(yáng)性率極低（7. 1%)，健康對(duì)照則100%為陰性。統(tǒng)計(jì)表明本發(fā)明的 試劑盒對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的檢測(cè)敏感性達(dá)到82. 7%，特異性達(dá)94. 7%(表1)。而同時(shí)檢 測(cè)上述血清的兩種目前國(guó)際上常用的商業(yè)化ELISA試劑盒EuroimmunCCP和Quanta Lite CCP2,按照其說(shuō)明書(shū)提供的陽(yáng)性界值計(jì)算，敏感性分別只有65. 9%和67. 1%，特異性分別為 94.9%和94. 5% (表2)。說(shuō)明本發(fā)明的ELISA試劑盒在維持高特異性的同時(shí)，敏感性較國(guó) 際上常用的商業(yè)化CCP ELISA試劑盒有顯著的提高。
[0033] 表1本發(fā)明的ELISA檢測(cè)試劑盒（CCCP)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者及其對(duì)照組的結(jié) 果統(tǒng)計(jì)

【權(quán)利要求】
1. 一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：該抗原由來(lái)源于絲聚合蛋白/中間絲蛋 白的瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3三個(gè)小分子合成肽通過(guò)甘氨酸連接嵌合，再通過(guò)在 嵌合肽的N端及C端插入的半胱氨酸產(chǎn)生的二硫鍵，從而形成了具有與蛋白質(zhì)β-轉(zhuǎn)角相 似結(jié)構(gòu)的環(huán)狀嵌合肽，其氨基酸序列如下： CXGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGXC, 其中X為瓜氨酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：所述多肽具有環(huán) 狀結(jié)構(gòu)，其富含瓜氨酸殘基的氨基酸序列包含了來(lái)源于絲聚合蛋白/中間絲蛋白中能被類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎特異識(shí)別的多個(gè)抗原表位。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：線性瓜氨酸嵌合 肽，瓜氨酸肽1、瓜氨酸肽2、瓜氨酸肽3的氨基酸序列如下： 線性瓜氨酸嵌合肽： XGGXQGSYHEQSVDXGHGQSGPXSASXQTXGGXXQDSSVVGX ； 瓜氨酸肽 1 :XGGXQGSYHEQSVDX ; 瓜氨酸肽 2 :HGQSGPXSASXQTX ; 瓜氨酸肽 3 :GXXQDSSVVGX。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原，其特征在于：各瓜氨酸合成肽 段序列來(lái)源于絲聚合蛋白/中間絲蛋白，由FMOC固相合成方法自動(dòng)或人工合成，經(jīng)高效液 相色譜法分析和純化，抗原純度達(dá)到90%以上。
5. -種如權(quán)利要求1所述的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在 于：將環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原包被在固相載體上，用于抗瓜氨酸肽抗體的檢測(cè)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的固相載體包括聚乙烯微孔板、硝酸纖維素膜（NC)和聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）或微 球。
7. 如權(quán)利要求5所述的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于：所 述的抗瓜氨酸肽抗體的檢測(cè)方法包括間接ELISA法，具體為：將環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽包被在 酶標(biāo)板上，制成間接酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，其組成如下 ： (1) 包被環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原的酶標(biāo)板； (2) 辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的抗人IgG抗體； (3) TMB底物顯色液； (4) 1M硫酸反應(yīng)終止液； (5) 磷酸鹽-Tween 20洗滌液； (6) 標(biāo)本稀釋液：含lwt. %的小牛血清白蛋白的磷酸鹽吐溫緩沖液； (7) 抗瓜氨酸肽抗體校準(zhǔn)品； (8) 陰性及陽(yáng)性對(duì)照血清。
8. 如權(quán)利要求7所述的環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于：所 述的包被環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原的酶標(biāo)板的制備過(guò)程為： (1)將環(huán)狀瓜氨酸嵌合肽抗原用pH 9. 6的碳酸鹽包被緩沖液稀釋至20μ g / ml，每個(gè) 酶標(biāo)板孔加1〇〇μ 1，4°C過(guò)夜； (2) 次日用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌2次； (3) 每孔加入lOOul含lwt. %的牛血清白蛋白的封閉液即磷酸鹽吐溫緩沖液，放置37°C 孵育2小時(shí)封閉酶標(biāo)板，后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，拍干； (4) 該酶標(biāo)板可立即用于檢測(cè)抗瓜氨酸肽抗體或密封防潮避光保存于4°C。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104262489SQ201410519287
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】陳仁奮, 魏秀妹 申請(qǐng)人:陳仁奮