本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及一種新的環(huán)狀hsa_circrna_102032的應用。

背景技術：

肝臟是身體內(nèi)極其重要的代謝器官，其功能的失調(diào)會影響機體正常的新陳代謝和內(nèi)環(huán)境的變化。原發(fā)性肝癌(primarylivercancer，plc)是一類發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，一般由化學致癌物或環(huán)境因素引發(fā)的慢性肝病或肝硬化發(fā)展而來，但是目前發(fā)病機制還未闡明，病理診斷和治療手段有一定的局限性。同種異體肝移植是目前治療plc最徹底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是醫(yī)療界所面臨的問題。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)用于plc早期診斷以及治療作用評估的新生物標記物。

近年來，隨著分子生物學基因芯片技術的發(fā)展，越來越多的研究者利用該技術探索了各類生物小分子與疾病的關系，而環(huán)狀rna(circularrna,circrna)是目前研究重大疾病分子機理的熱點。circrna是一類保守性好、特異性高，對靶基因能發(fā)揮調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼rna。因此篩選出具有差異表達的circrna作為疾病相關的生物標志物，并對其進行功能研究，可以更好地了解疾病發(fā)生的分子機制，進而提高相關疾病的預防和診斷水平。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開一種新的環(huán)狀rna的序列及其應用。

本發(fā)明所采取的技術方案是：

一種環(huán)狀rna，其序列是：

ctagagttgggaagacatcactgattatgtctctggtcagtgaagaatttccagaagaggttcctccccgggcagaagaaatcaccattccagctgatgtcaccccagagagagttccaacacacattgtagattactcagaagcagaacagagtgatgaacaacttcatcaagaaatatctcaggctaatgtcatctgtatagtgtatgccgttaacaacaagcattctattgataaggtaacaagtcgatggattcctctcataaatgaaagaacagacaaagacagcag(seqidno：1)。

優(yōu)選的，該環(huán)狀rna可以作為肝癌檢測、治療、預后靶點進行應用。

一種肝癌檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的試劑。

優(yōu)選的，該試劑盒中含有實時熒光定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的引物序列。

進一步優(yōu)選的，環(huán)狀rna引物序列是：

f：5’-gataaggtaacaagtcgatggat-3’(seqidno：4)；

r：5’-tggaactctctctggggtga-3’(seqidno：5)。

一種肝功能指標檢測試劑盒，該試劑盒中含有能夠定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的試劑。

優(yōu)選的，該試劑盒中含有實時熒光定量檢測序列為seqidno：1的環(huán)狀rna的引物序列。

進一步優(yōu)選的，環(huán)狀rna引物序列是：

f：5’-gataaggtaacaagtcgatggat-3’(seqidno：4)；

r：5’-tggaactctctctggggtga-3’(seqidno：5)。

優(yōu)選的，肝功能指標為谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶中的至少一種。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明申請公開的circrna在肝癌手術前后具有比較明顯的表達差異，目前用于肝癌的臨床輔助診斷技術尚不完善，因此該circrna具有作為肝癌相關的生物標志物的潛能。

附圖說明

圖1為hsa_circrna_102032在肝移植術前1天、肝移植術后1天、3天、7天的表達量。

具體實施方式

以下具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但不作為對本發(fā)明的限定。

實施例1

在對肝癌進行研究的過程中，發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)狀rna。其序列是：

ctagagttgggaagacatcactgattatgtctctggtcagtgaagaatttccagaagaggttcctccccgggcagaagaaatcaccattccagctgatgtcaccccagagagagttccaacacacattgtagattactcagaagcagaacagagtgatgaacaacttcatcaagaaatatctcaggctaatgtcatctgtatagtgtatgccgttaacaacaagcattctattgataaggtaacaagtcgatggattcctctcataaatgaaagaacagacaaagacagcag(seqidno：1)，將其命名為hsa_circrna_102032。

實驗例2材料與處理：

1)外周血標本的收集

標本收取于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院腎臟科進行plc肝移植手術前1天、術后1天、術后3天、術后7天患者，以及于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院門診部門體檢正常的健康志愿者的外周血，每個標本收集0.5ml于0.5ml的凍存管中并置于-80℃冰箱保存，儲存?zhèn)溆?。所有研究對象均知情同意參加本項實驗，且該過程經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查批準。

2)樣品的制備與評估

rna樣品制備

實驗分為肝癌病人肝移植術前1天組、術后1天、術后3天、術后7天組和健康對照組。

每組取2ml混樣全血，用1mltrizol試劑和移液管將細胞吹吸裂解液幾次，而懸浮細胞則是在離心的沉淀中加入trizol試劑并用移液管反復吹吸以裂解細胞，在trizol試劑加入前不要洗滌細胞以免增加mrna降解的可能。

為了將核酸蛋白復合體完全解離，把加了trizol的樣品于15-30℃放置5min；每1ml的trizol試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋；手動劇烈振蕩管體15s后，15-30℃孵育2-3min；4℃下12,000×g離心15mim；離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相；rna全部被分配于水相中；水相的體積大約使勻漿時加入的trizol試劑的60％。

將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中；水相與異丙醇混合使其中的rna沉淀(加入異丙醇的量為每個樣品勻漿加入1mltrizol試劑時加0.5ml的異丙醇)；混勻后15-30℃孵育10min后，于4℃12,000×g離心10min；rna沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

移去上清液，每1mltrizol試劑勻漿的樣品中加入至少75％的乙醇1ml用于清洗rna沉淀；振蕩后，4℃7,500×g離心5min。

最后，為了不降低rna的可溶性，在空氣中不完全干燥rna沉淀5-10min。溶解rna時，先加入無rna酶的水用槍反復吹打幾次，然后55-60℃孵育10min。獲得的rna溶液保存于-70℃。

總rna純化及質(zhì)檢

使用nanodropnd-1000評估rna量和質(zhì)量，吸光度在260和280mn處測定，a260/a280的比值需要接近2.0(1.8-2.1之間均可)，并且a260/a230比值要大于1.8。rna完整性和純度通過標準變性凝膠電泳進行評估。具體實驗過程如下。

在微量離心管中分別加入重新溶解的rna≤85μl、10×反應緩沖液10μl、baseline-zerodna酶5μl、無rna酶的水至100μl；37℃孵育30min；加入350μl緩沖液rlt，混勻；加入250μl乙醇(96–100％)，吸打混勻；將上述700μl的樣品加入到安裝在2ml收集管上的rneasy小型離心柱中，小心地蓋上蓋子，在≥8000×g的離心機上離心15s，棄去流體；在rneasy小柱中加入500μl緩沖液rpe(rpe緩沖液第一次使用前，按瓶上所述加入4倍體積的96-100％乙醇配成工作溶液)，小心地蓋上蓋子≥8000×g離心15s，洗滌rneasy膜，棄去流體；再次加入500μl緩沖液rpe，蓋上蓋子，≥8000×g離心2min，洗滌rneasy膜；把rneasy柱放在一新的2ml的收集管中，用過濾法去除舊的收集管，全速離心1min；rneasy柱轉(zhuǎn)移到一新的1.5ml的離心管中，吸取適量無rna酶的水直接加入到rneasy膜中；蓋上管蓋，≥8000×g離心1min，洗脫；最后進行rna定量和質(zhì)量控制。

實驗例3實時熒光定量pcr檢測

引物設計

根據(jù)術前組(術前1天組)與健康對照組比較上調(diào)且術后組(術后1天、3天、7天組)與術前組比較下調(diào)，或者術前組與健康對照組比較下調(diào)且術后組與術前組比較上調(diào)的篩選原則隨機挑選驗證的circrna進行熒光定量驗證。以2-δδct法計算差異倍數(shù)，通過rt-pcr檢測。pcr引物序列如下：

表1rt-pcr引物列表

rt-pcr進行驗證

采用rt-pcr進行驗證。建立8μl體系，加入2×mastermix5μl，正、反向引物各0.5μl，蒸餾水2μl。將8μl混合液加到384-pcr板對應的每個孔中，加入對應的2μlcdna，小心粘上sealingfilm封口膜，并短暫離心混合。將上述384-pcr板置于realtimepcr儀上進行pcr反應。反應程序如下：95℃，10min；40個pcr循環(huán)(95℃，10s；60℃，60s收集熒光)。為了建立pcr產(chǎn)物的熔解曲線，擴增反應結束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行-ramprate為0.05℃/s)。由于受rna濃度定量誤差和rna逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的2μl體積的cdna其含量并不完全相同，為校正此差異，我們使用管家基因β-actin(不同樣品間表達量基本恒定)作為內(nèi)參，以樣品待測基因的值除以此樣品內(nèi)參的值，最終得到的比值為樣品的待測基因相對含量。

肝移植術前1天、術后1天、術后3天、術后7天及健康對照者的5組外周血標本均可見擴增曲線，引物的擴增效率較高，熔解曲線符合標準，引物的特異性較好(表2)。

表2cricrna在標準曲線中與擴增相關的數(shù)值

實驗例4rt-pcr檢測結果分析

為了檢測hsa_circrna_102032在肝移植術前1天(肝癌患者)、術后1天、術后3天、術后7天以及健康對照組之間是否存在差異表達，發(fā)明人將circrna的ct值經(jīng)β-actin內(nèi)參基因的ct校正后得到的△ct值用于兩組間相對表達比值：2^-△△ct，以及兩組間是否存在顯著差異的p值計算(表3、表4)。從圖1可知，hsa_circrna_102032在肝移植術前1天的表達量相對于健康對照組極其顯著上調(diào)(p<0.01)，并且在肝移植術后1天、3天、7天有著顯著下調(diào)的趨勢。

表3肝移植組和健康對照組circrna的△ct值

表4肝移植組和健康對照組之間circrna表達的p值和2^-△△ct值

注：*p<0.05代表兩組之間存在顯著差異表達；**p<0.01代表兩組之間存在極其顯著差異表達。

實驗例5肝移植患者圍手術期實驗組

收取4例2014年12月1日至2015年8月31日于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院確診為plc并進行肝移植手術的患者。4例患者均為男性，平均年齡40.25±6.40歲，中位年齡42.5歲。所有患者有長期大量飲酒病史，治療前診斷為酒精性肝硬化發(fā)展成plc，且無其他腫瘤病史和肝炎感染病史。

患者和健康個體的臨床特征從第181醫(yī)院的數(shù)據(jù)庫中提取并總結在表2-1中。谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartatetransaminase，ast)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase，alt)是用于評估肝功能的常用指標，在0-50iu/l之間為正常參考值，表5顯示，經(jīng)移植術后plc患者的肝功能逐漸恢復正常。

表5肝移植患者和健康對照組的臨床特征

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