本發(fā)明涉及馬品種的鑒定方法，具體的，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬的試劑盒的
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：焉耆馬是一種古老的優(yōu)良馬品種，目前主要分布于新疆巴音郭楞州境內(nèi)的和靜縣、和碩縣、焉耆縣、博湖縣等地區(qū)；據(jù)記載，早在2000年前就存在的該品系馬種，是與蒙古馬雜交繁育的基礎(chǔ)上又與東歸部落帶來(lái)的伏爾加河流域的高大、耐寒、善走之馬種雜交，在巴音布魯克高山草原特殊的自然條件下，由蒙古族牧民精心放牧管理和馴育而形成了這個(gè)品種；焉耆馬體驅(qū)較粗重，公馬平均體高142厘米、母馬平均體高135厘米；焉耆馬以善走著稱，日行70-80公里，能日夜兼程包括爬山持續(xù)行走3-4天，具有耐力久、承重大的特征。對(duì)側(cè)步為馬術(shù)運(yùn)動(dòng)術(shù)語(yǔ)，民間俗稱“走馬”，馬蹄落地呈兩蹄聲，為兩節(jié)拍步法。走馬又按其步伐形態(tài)分為速步和對(duì)側(cè)步。速步亦稱花步或大走，是指對(duì)角線的前后蹄同時(shí)抬起、同時(shí)前邁、同時(shí)落蹄，反側(cè)亦然，呈x形交叉同步的步式。對(duì)側(cè)步亦稱小走，是指同側(cè)的前后蹄同時(shí)抬起、邁進(jìn)和落蹄的ii字型步伐。走馬在國(guó)際上較受歡迎，因其步伐最適合輕駕馬車比賽。對(duì)走馬的兩種步態(tài)，分別被稱呼為速步和對(duì)側(cè)步：速步為對(duì)角線的前后蹄同時(shí)抬起同時(shí)落下，對(duì)側(cè)步為同側(cè)的前后蹄同時(shí)抬起同時(shí)落下；一般認(rèn)為，走馬中的速步步態(tài)是較為常見(jiàn)的走馬步伐，可以通過(guò)后天訓(xùn)練培養(yǎng)出來(lái)，而對(duì)側(cè)步步態(tài)是要具備天生的能力，因此，如需選育具備對(duì)側(cè)步步態(tài)的好馬，不僅需要后天的精心訓(xùn)練，更需要具備先天的基因優(yōu)勢(shì)。焉耆馬馬種中先天對(duì)側(cè)步中概率較高，在焉耆馬種中選育對(duì)側(cè)步馬匹在馬匹選育工作中具有重要意義。而目前的傳統(tǒng)的目測(cè)方法檢測(cè)焉耆馬的對(duì)側(cè)步步態(tài)的方法，只有馬駒到了一歲以后對(duì)其進(jìn)行調(diào)教訓(xùn)練時(shí)才能很好的對(duì)其步態(tài)進(jìn)行評(píng)斷，無(wú)法對(duì)剛出生的馬駒進(jìn)行早期的檢測(cè)。最近在《nature》雜志中l(wèi)isas.andersson等人發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，馬的dmrt3基因上的一個(gè)突變對(duì)冰島馬的步態(tài)有一定的影響。冰島馬的dmrt3基因上第902個(gè)堿基由c變?yōu)閍，導(dǎo)致了編碼氨基酸由絲氨酸變?yōu)榻K止密碼子，影響了該蛋白質(zhì)在生物過(guò)程中的作用，從而影響了冰島馬的運(yùn)動(dòng)方式。該研究所示的檢測(cè)方法中，未公開(kāi)pcr擴(kuò)增的引物序列，在后續(xù)的何美升等人發(fā)表的《伊犁馬dmrt3基因多態(tài)性研究》研究成果中，雖然公開(kāi)了引物序列，但是該檢測(cè)方法在用于檢測(cè)焉耆馬的dmrt3基因時(shí)，擴(kuò)增的特異性與效率都較低，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，靈敏度和特異度較低，亟需開(kāi)發(fā)快速準(zhǔn)確鑒定焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)的檢驗(yàn)試劑盒。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中，馬的對(duì)側(cè)步步態(tài)是由可以遺傳的一個(gè)基因突變?cè)斐傻?，并且公開(kāi)了馬的dmrt3基因影響了馬的運(yùn)動(dòng)方式，盡管公開(kāi)了引物序列，但是該引物序列在用于檢測(cè)焉耆馬的dmrt3基因時(shí)，擴(kuò)增的特異性與效率都較低，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，靈敏度和特異度較低，亟需要解決；本發(fā)明旨在于提供適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，操作方法簡(jiǎn)單、快捷，針對(duì)于焉耆馬檢測(cè)靈敏度高、特異性好，有效的解決了現(xiàn)有技術(shù)中擴(kuò)增的特異性與效率都較低，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，靈敏度和特異度較低的問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：本發(fā)明提供一種適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒，試劑盒通過(guò)以下共建體系建成獲得。(1)設(shè)計(jì)引物對(duì)：根據(jù)焉耆馬dmrt3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物。(2)pcr反應(yīng)試劑：10xpcr緩沖液、taq酶、引物、2.5mmdntp、樣本基因組dna和ddh2o。(3)酶切所需試劑：ddei核酸內(nèi)切酶及其緩沖液。優(yōu)選的，試劑盒組分為：10xpcr緩沖液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、樣本基因組dna1ul、ddei內(nèi)切酶1ul、酶切緩沖液2ul和ddh2o18ul。同時(shí)，本發(fā)明提供用于檢測(cè)對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬的引物，根據(jù)焉耆馬dmrt3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物如下所示：正向引物：5'-agcgacaaagacaccgaccag-3'；反向引物：5'-ttgccaaagtattcctcagcatca-3'。進(jìn)一步，本發(fā)明提供適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，包括以下步驟：(1)提取待檢測(cè)樣本基因組dna；(2)利用正向引物、反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；擴(kuò)增體系如下：10xpcr緩沖液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、樣本基因組dna1ul和ddh2o13.8ul，總計(jì)20μl；擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后電泳分析出現(xiàn)雙條帶判定為對(duì)側(cè)步步態(tài)的馬；出現(xiàn)單一條帶或三條帶判定為非對(duì)側(cè)步步態(tài)的馬。酶切體系如下：pcr反應(yīng)產(chǎn)物10ul、ddei核酸內(nèi)切酶1ul、酶切緩沖液2ul和ddh2o18ul。酶切反應(yīng)程序如下：37℃水浴2h，65℃水浴30min。通過(guò)采用上述提供的技術(shù)方案，本發(fā)明獲得以下有益效果：采用本發(fā)明提供的適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，操作方法簡(jiǎn)單、快捷，針對(duì)于焉耆馬檢測(cè)靈敏度高、特異性好，有效的解決了現(xiàn)有技術(shù)中擴(kuò)增的特異性與效率都較低，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)效率高，靈敏度可達(dá)90％，特異度可達(dá)100％，獲得顯著突出的技術(shù)效果。附圖說(shuō)明圖1為未知基因型的焉耆馬基因pcr分型的凝膠電泳圖；其中，泳道1-3為對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬(突變純合子)；泳道4-5為非對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬(包含突變的雜合子)；泳道6-8為非對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬(不含突變的純合子)。具體實(shí)施方式本發(fā)明中選用的所有試劑、原料和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實(shí)施方式的實(shí)施。實(shí)施例一：適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒引物用于檢測(cè)對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬的引物，根據(jù)焉耆馬dmrt3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物如下所示：正向引物：5'-agcgacaaagacaccgaccag-3'；反向引物：5'-ttgccaaagtattcctcagcatca-3'。實(shí)施例二：適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒本發(fā)明提供一種適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒，試劑盒通過(guò)以下共建體系建成獲得：設(shè)計(jì)引物對(duì)：根據(jù)焉耆馬dmrt3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物；pcr反應(yīng)試劑：10xpcr緩沖液、taq酶、引物、2.5mmdntp、樣本基因組dna和ddh2o；酶切所需試劑：ddei核酸內(nèi)切酶及其緩沖液。實(shí)施例三：適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬的試劑盒，包含：10xpcr緩沖液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、樣本基因組dna1ul、ddei內(nèi)切酶1ul、酶切緩沖液2ul和ddh2o18ul；引物如下所示：正向引物：5'-agcgacaaagacaccgaccag-3'；反向引物：5'-ttgccaaagtattcctcagcatca-3'。實(shí)施例四：適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒應(yīng)用對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬的試劑盒應(yīng)用，包括以下步驟：(1)提取待檢測(cè)樣本基因組dna；(2)利用上游引物、下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增；擴(kuò)增體系如下：10xpcr緩沖液2ul、2.5mmdntp2ul、10um正向引物0.5ul、10um反向引物0.5ul、taq酶0.2ul、樣本基因組dna1ul和ddh2o13.8ul，總計(jì)20μl；擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后電泳分析出現(xiàn)雙條帶判定為對(duì)側(cè)步步態(tài)的馬；出現(xiàn)單一條帶或三條帶判定為非對(duì)側(cè)步步態(tài)的馬。酶切的體系如下：pcr反應(yīng)產(chǎn)物10ul、ddei核酸內(nèi)切酶1ul、酶切緩沖液2ul和ddh2o18ul。酶切的反應(yīng)程序如下：37℃水浴2h，65℃水浴30min。實(shí)施例五：適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒效果驗(yàn)證從不同的焉耆馬飼養(yǎng)牧戶中，挑選了10匹對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬和8匹非對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬，使用本發(fā)明所述的試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算靈敏度及特異度。其中，計(jì)算公式：靈敏度＝真陽(yáng)性數(shù)/(真陽(yáng)性數(shù)+假陰性數(shù))*100％。特異度＝真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù)))*100％。檢測(cè)結(jié)果如表1所示：表1：實(shí)際檢測(cè)焉耆馬步態(tài)與電泳條帶匹配情況個(gè)體編號(hào)品種性別步態(tài)電泳結(jié)果yq01焉耆母對(duì)側(cè)步雙條帶yq02焉耆母對(duì)側(cè)步三條帶yq03焉耆母非對(duì)側(cè)步三條帶yq06焉耆母非對(duì)側(cè)步三條帶yq07焉耆公非對(duì)側(cè)步單條帶yq08焉耆母非對(duì)側(cè)步三條帶yq09焉耆母非對(duì)側(cè)步三條帶yq10焉耆母非對(duì)側(cè)步三條帶yq11焉耆母非對(duì)側(cè)步單條帶yq12焉耆母對(duì)側(cè)步雙條帶yq13焉耆公對(duì)側(cè)步雙條帶yq14焉耆母非對(duì)側(cè)步三條帶yq15焉耆公對(duì)側(cè)步雙條帶yq16焉耆母對(duì)側(cè)步雙條帶yq17焉耆母對(duì)側(cè)步雙條帶yq18焉耆母對(duì)側(cè)步雙條帶yq19焉耆公對(duì)側(cè)步雙條帶yq20焉耆公對(duì)側(cè)步雙條帶根據(jù)表1計(jì)算，本發(fā)明提供的試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)已知步態(tài)的焉耆馬進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算可得靈敏度為90％，特異度為100％。由此可知本發(fā)明在對(duì)對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢出率較高，具有較高的實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中，公開(kāi)的引物序列在用于檢測(cè)焉耆馬的dmrt3基因時(shí)，擴(kuò)增的特異性與效率都較低，容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)，且檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)效率低，靈敏度和特異度較低，亟需要解決的問(wèn)題，根據(jù)焉耆馬dmrt3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以樣本基因組dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增并進(jìn)行電泳分析，出現(xiàn)雙條帶判定為對(duì)側(cè)步步態(tài)的馬；出現(xiàn)單一條帶或三條帶判定為非對(duì)側(cè)步步態(tài)的馬，利用電泳條帶的差異可以判別挑選對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬。本發(fā)明中對(duì)側(cè)步步態(tài)焉耆馬檢測(cè)方法檢測(cè)周期短，檢測(cè)效率高，而且本發(fā)明的靈敏度可達(dá)90％，特異度可達(dá)100％。如上所述，即可較好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明,上述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種改變和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明確定的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用<130>人工序列<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><221>人工序列<222>(1)..(21)<400>1agcgacaaagacaccgaccag21<110>新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種適用焉耆馬對(duì)側(cè)步步態(tài)控制的檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用<130>人工序列<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<220><221>人工序列<222>(1)..(24)<400>1ttgccaaagtattcctcagcatca24當(dāng)前第1頁(yè)12