本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種新型的高效抗瘧藥物。

背景技術：

瘧疾是由瘧原蟲屬原生動物造成的感染性發(fā)熱性疾病，所述瘧原蟲屬原生動物寄生在紅血細胞中，并且通過瘧蚊(anophele)屬受感染蚊子的叮咬傳播。所述疾病的特征在于以一定間隔時間發(fā)生的發(fā)冷、發(fā)熱和盜汗的發(fā)作，所述間隔時間取決于新一代寄生蟲在體內發(fā)育所需的時間。從急性發(fā)作恢復后，所述疾病傾向于變成慢性的，偶有復發(fā)。存在四種瘧原蟲，惡性瘧原蟲(plasmodiumfalciparum/p.falciparum)、間日瘧原蟲(plasmodiumvivax/p.vivax)、三日瘧原蟲(plasmodiummalariae/p.malariae)和卵形瘧原蟲(plasmodiumovale/p.ovale)。

在各種形式的人類瘧疾中，由惡性瘧原蟲引起的瘧疾的特征在于嚴重的全身癥狀，有時甚至導致死亡，它是造成人類死亡率中的大多數(shù)病例的原因。惡性瘧原蟲是危險的，不僅因為它消化紅血細胞的血紅蛋白，而且還因為它改變了所棲息細胞的粘附特性，這造成所述細胞粘到血管壁上。當受感染的血細胞粘到血管上從而阻塞血液流動時，這變得危險。所述疾病在世界上的熱帶和亞熱帶地區(qū)普遍存在，包括巴西的亞馬遜地區(qū)、東部和南部非洲以及東南亞地區(qū)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2011年世界瘧疾報告，在2010年有216,000,000例瘧疾，并且其中81％在who非洲區(qū)。在2010年估計有655,000例瘧疾有關的死亡，其中86％的受害者是5歲以下的兒童。

在整個近代史中，已經(jīng)用多種藥物來治療瘧疾，包括藥物的組合。然而，抗藥性瘧疾蟲株的出現(xiàn)已成為瘧疾治療中的顯著問題。who建議青蒿素(artemisinin)與其它種類的抗瘧疾藥組合(基于青蒿素的組合療法(act))作為由惡性瘧原蟲引起的瘧疾的一線治療。2009年在柬埔寨-泰國邊境證實出現(xiàn)并且在緬甸和越南的部分地區(qū)疑似出現(xiàn)抗青蒿素的惡性瘧原蟲，因此，本領域中急需新的高效抗瘧藥的出現(xiàn)，來遏制瘧疾的傳播。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的高效抗瘧藥物。

在本發(fā)明的第一方面，提供了quisinostat、其類似物、或其藥學上可接受鹽的用途，用于制備

(1)預防和/或治療瘧疾的藥物；和/或

(2)抑制和/或殺滅瘧原蟲的試劑。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗瘧原蟲組合物，所述組合物包括quisinostat、其類似物、或其藥學上可接受鹽。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物包括第一活性成分和第二活性成分，

其中，所述第一活性成分為quisinostat、其類似物、或其藥學上可接受鹽；

所述第二活性成分為哌喹、其類似物、或其藥學上可接受鹽，和/或

苯芴醇、其類似物、或其藥學上可接受鹽。

在另一優(yōu)選例中，所述瘧原蟲選自下組：惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲。

在另一優(yōu)選例中，所述哌喹為磷酸哌喹。

在另一優(yōu)選例中，所述第一活性成分和第二活性成分的摩爾比約為1～20：20～1，優(yōu)選地為1～10：10～1，更更優(yōu)選地為1～5：5～1。

在另一優(yōu)選例中，所述組合物中還包括藥學上可接受的載體或賦形劑。

在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物的劑型包括片劑、顆粒劑、膠囊、丸劑、注射劑、或口服液。

在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為單元劑型，每個單元劑型中所述第一活性成分和所述第二活性成分的含量約為日劑量的0.1至1(或0.25-1，或0.5-1)，其中所述日劑量為20-100mg。

在另一優(yōu)選例中，所述的日劑量為25-70mg，如25mg、40mg、50mg。

本發(fā)明的第三方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的抗瘧原蟲組合物的用途，用于制備

(1)預防和/或治療瘧疾的藥物；

(2)抑制和/或殺滅瘧原蟲的試劑。

本發(fā)明的第四方面，提供了一種預防和/或治療瘧疾的方法，所述方法包括步驟：

給需要的對象施用quisinostat、其類似物、或其藥學上可接受鹽，或者給需要的對象施用權利要求2所述的抗瘧原蟲組合物，從而預防和/或治療瘧疾。

在另一優(yōu)選例中，所述的對象包括人和非人哺乳動物(如嚙齒動物)。

在另一優(yōu)選例中，所述的施用的用量為1-1000mg/kg體重，較佳地15-700mg/kg體重，更佳地20-500mg/kg體重，以所述第一活性成分的重量計。

在另一優(yōu)選例中，所述疾病瘧疾。

應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了no.37化合物對體外培養(yǎng)瘧原蟲的生長抑制效果(ec503.91nm)，青蒿素作為陽性對照(ec506.38nm)；采用3-daysybrgreeni細胞生長測定的方法來確定瘧原蟲的生長情況。

圖2顯示了no.37化合物對人肝癌細胞系hepg2以及人腎上皮細胞系293t的細胞毒性作用；同時顯示了no.37化合物對瘧原蟲抑制效果與對不同細胞系毒性之間的選擇指數(shù)，青蒿素作為陽性對照；采用3-daycelltiterglo的方法測定細胞系的生長情況，采用3-daysybrgreeni的方法來測定瘧原蟲的生長情況。

圖3顯示了no.37化合物與常用抗瘧藥，本芴醇、青蒿素、磷酸哌喹之間的藥物互作情況；藥物互作在體外培養(yǎng)的瘧原蟲中進行，采用3-daysybrgreeni的方法來測定瘧原蟲的生長情況；fic為藥物互作指數(shù)。

圖4顯示了no.37化合物在小鼠體內的殺蟲效果；no.37化合物測試10mg/kg和20mg/kg這兩個不同的濃度，同時聯(lián)合用藥濃度分別為:no.37化合物(10mg/kg)+本芴醇(10mg/kg)；no.37化合物(10mg/kg)+磷酸哌喹(10mg/kg)，青蒿素以10mg/kg和30mg/kg作為陽性對照，dmso作為陰性對照。

圖5顯示了本發(fā)明人事先配置好濃度為400nm的各化合物溶液，在96孔板中的b1-h12孔中分別加入100ul完全培養(yǎng)基，在a1-a12孔的200ul體系中，分別加入不同體積相互作用的兩種化合物溶液。

具體實施方式

本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)quisinostat(即，本發(fā)明中的no.37化合物)對瘧原蟲具有顯著的抑制效果，在小鼠體內甚至表現(xiàn)出了比青蒿素更好的殺蟲效果。進一步地研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)quisinostat與piperaquine和lumefantrine分別聯(lián)合用藥對小鼠進行靜脈注射，表現(xiàn)出了顯著的協(xié)同作用，同樣表現(xiàn)出了比青蒿素更好的殺蟲效果。在此基礎上，完成了本發(fā)明。

在描述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這類方法和條件可以變動。還應當理解本文所用的術語其目的僅在于描述具體實施方案，并且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權利要求書限制。

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術語“約”意指該值可以從列舉的值變動不多于1％。例如，如本文所用，表述“約100”包括99和101和之間的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。

quisinostat、其類似物、或其藥學上可接受鹽

在本發(fā)明中，quisinostat和no.37化合物為同一化合物。作為本發(fā)明活性成分的no.37化合物是新型的二代hdac抑制劑，其主要作用于hdac家族classi中的hdac1。no.37化合物的化學名稱為：n-羥基-2-[4-{[(1-甲基吲哚1-3-基甲基)氨基]甲基}-1-哌啶基]-5-嘧啶羧酰胺

no.37化合物的結構如下：

no.37化合物的類似物包括但不限于：上述結構式中的一個或多個氫、和/或羥基被取代后形成的化合物，優(yōu)選地所述取代基選自下組：鹵素(f、cl、br、i)、c1-8烷基、c2-8烯基、c2-8炔基、c3-8環(huán)烷基、3-至12-元雜環(huán)基，芳基、雜芳基、cn、no2。

術語“藥學上可接受的鹽”指適合與對象(例如，人)的組織接觸，而不會產(chǎn)生不適度的副作用的鹽。如本文所用，藥學上可接受的鹽指no.37化合物或其類似物與藥學上可接受的無機酸和有機酸所形成的鹽，其中，優(yōu)選的無機酸包括(但并不限于)：鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；優(yōu)選的有機酸包括(但并不限于)：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。在一些實施例中，本發(fā)明的no.37化合物的藥學上可接受的鹽包括具有酸性基團的本發(fā)明的化合物的鹽(例如，鉀鹽，鈉鹽，鎂鹽，鈣鹽)或具有堿性基團的本發(fā)明的化合物的鹽(例如，硫酸鹽，鹽酸鹽，磷酸鹽，硝酸鹽，碳酸鹽)。

在體外試驗中no.37化合物表現(xiàn)出了與青蒿素相當?shù)寞懺x生長抑制效果，而在小鼠試驗中更表現(xiàn)出了比青蒿素更好的殺蟲效果。在藥物互作實驗中，發(fā)現(xiàn)no.37與現(xiàn)在最主要的幾類抗瘧藥沒有相互拮抗作用，且在小鼠聯(lián)合用藥試驗中，發(fā)現(xiàn)no.37與piperaquine(磷酸哌喹)和lumefantrine(苯芴醇)分別聯(lián)合用藥對小鼠進行靜脈注射同樣表現(xiàn)出了比青蒿素更好的殺蟲效果。這意味著在未來成藥研發(fā)以及臨床試驗中可以進行聯(lián)合用藥治療，這對于延緩抗藥性的產(chǎn)生將大有幫助，同時將會更好的更高效的進行瘧疾治療。

在體外瘧原蟲生長抑制實驗中以青蒿素作為對照，no.37作為實驗組對其瘧原蟲生長抑制ec50進行測定，no.37展現(xiàn)出了非常好的對瘧原蟲的生長抑制功能，與青蒿素相當，ec50為3.91nm。實驗已進行三次以上生物學意義上的重復，結果穩(wěn)定，可信度高。

在小鼠實驗中，對小鼠接種鼠瘧致死株系pbanka，并在接種24小時之后對小鼠進行青蒿素、no.37化合物以及no.37化合物+piperaquine、no.37化合物+lumefantrine不同濃度的靜脈注射給藥，分別為：

青蒿素10mg/kg,30mg/kg；

no.3710mg/kg,20mg/kg；

no.37(10mg/kg)+piperaquine(10mg/kg)；

no.37(10mg/kg)+lumefantrine(10mg/kg)；

每組三只作為重復。同時注射dmso作為陰性對照。實驗結果顯示no.37以及no.37+piperaquine、no.37+lumefantrine展現(xiàn)出了比青蒿素更好的對鼠瘧的抑制效果，實驗在不同種系的老鼠中做了多次重復，都得到了相似的結果，可信度高。

哌喹(piperaquine)、其類似物、或其藥學上可接受鹽

化學名：1，3-雙[4-(7-羥基喹啉-4-基)哌嗪-1基]丙烷

結構式如下：

哌喹的類似物包括但不限于：上述結構式中的一個或多個氫、和/或一個或多個cl被取代后形成的化合物，優(yōu)選地所述取代基選自下組：鹵素(f、cl、br、i)、c1-8烷基、c2-8烯基、c2-8炔基、c3-8環(huán)烷基、3-至12-元雜環(huán)基，芳基、雜芳基、cn、no2。

術語“藥學上可接受的鹽”指適合與對象(例如，人)的組織接觸，而不會產(chǎn)生不適度的副作用的鹽。如本文所用，藥學上可接受的鹽指哌喹或其類似物與藥學上可接受的無機酸和有機酸所形成的鹽，其中，優(yōu)選的無機酸包括(但并不限于)：鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；優(yōu)選的有機酸包括(但并不限于)：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。在一些實施例中，本發(fā)明的哌喹或其類似物的藥學上可接受的鹽包括具有酸性基團的本發(fā)明的化合物的鹽(例如，鉀鹽，鈉鹽，鎂鹽，鈣鹽)或具有堿性基團的本發(fā)明的化合物的鹽(例如，硫酸鹽，鹽酸鹽，磷酸鹽，硝酸鹽，碳酸鹽)。

磷酸哌喹于20世紀60年代合成，之后的20年廣泛用于中國和印度的瘧疾預防和治療，直到20世紀80年代出現(xiàn)了磷酸哌喹的耐藥蟲株；因其半衰期長，現(xiàn)在多用于與青蒿素的聯(lián)合用藥(act)進行瘧疾的預防和治療。

苯芴醇(lumefantrine)、其類似物、或其藥學上可接受鹽

化學名：(z)-2,7-二氯-9-[(4-氯苯基)亞甲基]-α-[(二正丁氨基)甲基]-9h-芴-4-甲醇

結構式如下：

苯芴醇的類似物包括但不限于：上述結構式中的一個或多個氫、氯和/或羥基被取代后形成的化合物，優(yōu)選地所述取代基選自下組：鹵素(f、cl、br、i)、c1-8烷基、c2-8烯基、c2-8炔基、c3-8環(huán)烷基、3-至12-元雜環(huán)基，芳基、雜芳基、cn、no2。

術語“藥學上可接受的鹽”指適合與對象(例如，人)的組織接觸，而不會產(chǎn)生不適度的副作用的鹽。如本文所用，藥學上可接受的鹽指苯芴醇或其類似物與藥學上可接受的無機酸和有機酸所形成的鹽，其中，優(yōu)選的無機酸包括(但并不限于)：鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸；優(yōu)選的有機酸包括(但并不限于)：甲酸、乙酸、丙酸、丁二酸、萘二磺酸(1,5)、亞細亞酸、草酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、庚二酸、己二酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、煙酸、異煙酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸，以及氨基酸。在一些實施例中，本發(fā)明的苯芴醇或其類似物的藥學上可接受的鹽包括具有酸性基團的本發(fā)明的化合物的鹽(例如，鉀鹽，鈉鹽，鎂鹽，鈣鹽)或具有堿性基團的本發(fā)明的化合物的鹽(例如，硫酸鹽，鹽酸鹽，磷酸鹽，硝酸鹽，碳酸鹽)。

本芴醇具有很長的半衰期，現(xiàn)在其最主要用途是和青蒿素的聯(lián)合用藥(act)進行瘧疾的防治和治療。

組合物

如本文所用，術語“組合物”包括藥物組合物和試劑。

本發(fā)明所述的組合物包含抗瘧原蟲的活性成分，和藥學上可接受的載體。抗瘧原蟲的活性成分包括第一活性成分和第二活性成分，其中，所述第一活性成分包括quisinostat、其類似物、或其藥學上可接受鹽；而第二活性成分為磷酸哌喹、其類似物、或其藥學上可接受鹽，和/或

苯芴醇、其類似物、或其藥學上可接受鹽。

本發(fā)明的藥物組合物還可以包含各種與所含化合物或組合物相適應的藥物輔料，并通過常規(guī)方法制備成有利于給藥的劑型，如：但不僅限于水溶液注射劑、粉針劑、丸劑、散劑、片劑、貼劑、栓劑、乳劑、霜劑、凝膠劑、顆粒劑、膠囊劑、氣霧劑、噴霧劑、粉霧劑、緩釋劑和控釋劑等。所述藥用輔料既可以是各種制劑中常規(guī)使用的，如：但不僅限于等滲劑、緩沖液、矯味劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、崩解劑和潤滑劑等；也可以是為了與所述物質相適應而選擇使用的，如：但不僅限于乳化劑、增溶劑、抑菌劑、止痛劑和抗氧劑等，這類輔料能有效提高組合物所含化合物的穩(wěn)定性和溶解性或改變化合物的釋放速率和吸收速率等，從而改善各種化合物在生物體內的代謝，進而增強組合物的給藥效果。此外，還可以為實現(xiàn)特定的給藥目的或方式，如：緩釋給藥、控釋給藥和脈沖給藥等，而使用的輔料，如：但不僅限于明膠、白蛋白、殼聚糖、聚醚和聚酯類高分子材料(如：但不僅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等)。所述有利于給藥的主要表現(xiàn)有：但不僅限于提高治療效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者順應性等。

在水溶液注射劑中，輔料一般包括等滲劑和緩沖液，以及必要的乳化劑(如：tweeen-80、pluronic和poloxamer等)、增溶劑和抑菌劑等。此外，還包括含有藥學上可接受的其它藥用輔料，如：抗氧劑、ph調節(jié)劑和止痛劑等。

用于制取口服液體制劑的輔料一般包括溶劑，以及必要的矯味劑、抑菌劑、乳化劑和著色劑等。

用于制取片劑的輔料一般包括填充劑(如：淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可壓性淀粉、微晶纖維素、硫酸鈣、磷酸氫鈣和甘露醇等)、粘合劑(如：乙醇、淀粉漿、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、明膠溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解劑(如：干淀粉、羧甲基淀粉鈉、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)和潤滑劑(如：硬脂酸鎂、微粉硅膠、滑石粉、氫化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸鎂等)等。

用于制取乳劑的輔料一般為水、油(如：脂肪酸)、乳化劑，以及必要的防腐劑和矯味劑等。

用于制取顆粒劑的輔料與片劑類似，但造粒過程不同。根據(jù)需要，將制得的顆粒劑與助流劑混合后裝入膠囊即得膠囊劑。

如本文所用，術語“對象”、“生物體”、“動物”或“患者”包括人、野生動物和家畜(livestock)。野生動物為自然狀態(tài)下未經(jīng)人工馴化的動物。家畜是為了提供食物來源而人工飼養(yǎng)的動物，如：但不僅限于狗、貓、鼠、大鼠、倉鼠、豬、兔、奶牛、水牛、公牛、綿羊、山羊、鵝和雞等。給予治療的“患者”或“生物體”優(yōu)先選擇哺乳動物，尤其是人。

如本文所用，術語“預防”是指在未被臨床標準認定的疾病前，各種用于防止疾病發(fā)生或發(fā)展的手段或措施，包括醫(yī)學、物理或化學的方法，以阻止和降低疾病各種癥狀的發(fā)生或發(fā)展。

如本文所用，術語“治療”是指為了阻止和降低疾病的發(fā)生或發(fā)展，使疾病病程的發(fā)展或加重得以抑制、遏制、減輕、改善、減緩、停止、延遲或反轉，所描述的保持和/或用藥時的疾病的、紊亂的或病理學狀態(tài)的各種指標包括減輕或減少癥狀或并發(fā)癥，或治愈或消除疾病、紊亂或狀況。

如本文所用，術語“藥物”是指可以用于預防或治療某種疾病的單一化合物、多種化合物形成的組合物，或指以單一化合物為主要活性成分的組合物或制劑(formulation)，還指由多種化合物為活性成分的組合物或制劑。“藥物”應理解為不僅指根據(jù)一國之法律規(guī)定，通過其設立的行政機構審批并準予生產(chǎn)的產(chǎn)品，還指在為了獲得通過審批和準予生產(chǎn)的過程中，所形成的含單一化合物為活性成分的各類物質形態(tài)?！靶纬伞睉斫鉃橥ㄟ^化學合成、生物轉化或購買等途徑獲得。

本發(fā)明提供的作為藥物組合物的給藥途徑，包括但不僅限于，口服(oral)、鼻腔(nasal)、(面)頰(buccal)、透皮(transdermal)、肺部(pulmonal)、陰道(vaginal)、皮下(subcutaneous)或靜脈(intravenous)給予生物體。

本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：

(1)首次揭示了quisinostat(即，本發(fā)明中的no.37化合物)對瘧原蟲具有顯著的抑制效果；

(2)首次發(fā)現(xiàn)quisinostat與piperaquine和lumefantrine分別聯(lián)合用藥表現(xiàn)出了對瘧原蟲的顯著的協(xié)同抑制作用。

(3)提供了一類新的，效果顯著的抗瘧藥物。

(4)提供了一種對瘧藥蟲株更為有效的預防和治療方案，同時該方案能有效的減緩瘧原蟲耐藥性的出現(xiàn)。

下面結合具體實施例，進一步詳陳本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如美國sambrook.j等著《分子克隆實驗室指南》(黃培堂等譯，北京：科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲得。

材料和方法

一、材料

1.artemisinin(青蒿素)sigmaaldrichcat.no.361593-100mg。

2.no.37化合物：selleckchemcat.no.s1096

3.惡性瘧原蟲(3d7c8)：購自atcc。

4.293t細胞株:購自atcc。

5.hepg2細胞株:購自atcc。

6.sybrgreeni:invitrogencat.no.s-7585

7.celltiterglo:promegacat.no.g7572

8.96-孔板:corning

9.胰酶-edta:gbicocat.no.25200-072

10.dmem:gbicocat.no.11965-092

11.fbs:gbicocat.no.10082-147

13.hepes,ultrol級(100g)calbiochemcat.no.391338

14.次黃嘌呤(hypoxanthine，25g)sigmacat.no.h9377

二、方法

1.瘧原蟲培養(yǎng)：瘧原蟲培養(yǎng)使用rpmi(含nahco3,hepes,albumaxi,hypoxanthine，genaotamicin)完全培養(yǎng)基(completemedium)，在37℃培養(yǎng)箱(5％co2，5％02)中培養(yǎng)。

2.哺乳動物細胞培養(yǎng)：哺乳動物細胞系293t和hepg2使用dmem(含10％fbs，1xp/s)在37℃培養(yǎng)箱(5％co2)中培養(yǎng)。

3.化合物瘧原蟲體外生長抑制ec50測定：100ul完全培養(yǎng)基加入到96孔板中，在第一孔中加入適量的1um的化合物并用完全培養(yǎng)基定容至200ul使得化合物的終濃度為400nm，然后用機器手按1/2的比例進行梯度稀釋(11個濃度梯度),artemsinin作為正對照，不加任何化合物作為陰性對照，不加瘧原蟲和化合物作為實驗背景。之后用機器手每孔加入100ul的瘧原蟲培養(yǎng)物(1％ringparasitemia，4％hct)使得最終的hct和parasitemia為2％和1％，化合物的終濃度梯度為(200nm、100nm、50nm、25nm、12.5nm、6.25nm、3.125nm、1.5625nm、0.78125nm、0.390625nm、0.195313nm)。加樣完成之后96孔板放置到37℃培養(yǎng)箱(5％co2,5％o2)中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)完成之后每孔加入100ullysisbuffer(10xsybrgreeni,0.5％v/vtritonx-100,0.5mg/mlsaponin，0.75％edtaintris-clbuffer)，混勻之后，室溫避光孵育2h。孵育完成之后用孔板熒光讀數(shù)機讀取數(shù)值(最大激發(fā)光/最大接受光：485nm/535nm)。根據(jù)熒光讀值計算抑制率，抑制率＝(陰性對照組-實驗組)/(陰性對照組-實驗背景)，根據(jù)不同濃度的抑制率繪制生長抑制曲線并通過graphpad6計算ec50。

4.化合物細胞毒性ic50測定：哺乳動物細胞293t、hepg2培養(yǎng)至p5代，采用胰酶-edta消化，用dmem(10％fbs,1xp/s)重懸，用血球計算板計數(shù)并稀釋至10⁵cell/ml。用機器手在96孔板中每孔加入100ul細胞懸液，37℃、5％co2培養(yǎng)24h。在新的96孔板中每孔加入100uldmem(10％fbs、nop/s)，在96孔板的第一孔中加入200ul1um的化合物(溶于dmem)用機器手按1/2比例進行梯度稀釋(11個濃度梯度)，不加任何化合物作為陰性對照，只加dmem作為背景。之后將先前96孔板中的培養(yǎng)液吸掉，再將梯度稀釋之后的培養(yǎng)液對應加入到96-wellk孔板中。37℃5％co2培養(yǎng)72h。培養(yǎng)完成之后取出96孔板在室溫下平衡30min以上，之后每孔加入50ulcelltitle-glo試劑(預先室溫避光平衡1h以上)，室溫搖晃孵育10分鐘，之后用熒光檢測儀器進行熒光檢測。根據(jù)熒光讀值計算抑制率，抑制率＝(陰性對照-實驗組)/(陰性對照-背景)，根據(jù)不同藥物濃度下的抑制率繪制生長抑制曲線并通過graphpad6計算ic50。

與常用抗瘧藥相互作用測定：根據(jù)化合物和抗瘧藥的單一ec50選擇一個最佳的起始濃度，以確保ec50的濃度值位于濃度梯度的中間為最佳，在本實驗中，化合物與常用抗瘧藥的起始濃度值都定為200nm，因此本發(fā)明人事先配置好濃度為400nm的各化合物溶液，在96孔板中的b1-h12孔中分別加入100ul完全培養(yǎng)基，在a1-a12孔的200ul體系中，分別加入不同體積相互作用的兩種化合物溶液，如圖5所示。

之后從a-b按1/2比例進行梯度稀釋，最后在每孔中加入100ulrbc壓積為4％原蟲率為1％的培養(yǎng)物使得最終的rbc壓積為2％原蟲率為1％，化合物的濃度梯度為(200nm，100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.5625nm)，加樣完成之后將96孔板放入三氣培養(yǎng)箱中(5％co2,5％o2)培養(yǎng)72h，培養(yǎng)完成之后每孔加入100ullysisbuffer(10xsybrgreeni,0.5％v/vtritonx-100,0.5mg/mlsaponin，0.75％edtaintris-clbuffer)，混勻之后，室溫避光孵育2h。孵育完成之后用孔板熒光讀數(shù)機讀取數(shù)值(最大激發(fā)光/最大接受光：485nm/535nm)。根據(jù)熒光讀值計算抑制率，抑制率＝(陰性對照組-實驗組)/(陰性對照組-實驗背景)，根據(jù)不同濃度的抑制率繪制不同組別生長抑制曲線并通過graphpad6計算出每組的ec50。最后根據(jù)每組的ec50計算出兩種化合物的相關系數(shù)，并繪制他們的相互作用關系圖。

化合物在小鼠體內的殺蟲效率分析：選擇兩種不同品系的小鼠(icr和balb/c分別進行此實驗，第0天，對所有小鼠進行鼠瘧致死株系pbanka的接種，每只小鼠接種10⁶個瘧原蟲，24小時之后對小鼠進行青蒿素、no.37以及no.37+piperaqiuoine、no.37+lumefantrine不同濃度的靜脈注射給藥，分別為青蒿素10mg/kg,30mg/kg；no.3710mg/kg,20mg/kg；no.37+piperaquine(10mg+10mg)/kg；no.37+lumefantrine(10mg+10mg)/kg,每組三只小鼠作為重復。同時注射dmso作為陰性對照。連續(xù)按相同的方式給藥四天，每天對所有小鼠進行尾部采血制作血涂片計算小鼠體內原蟲率，連續(xù)觀察10天以上，并根據(jù)結果作圖。

實施例1化合物瘧原蟲體外生長抑制ec50測定：

本發(fā)明人對no.37化合物進行ec50的測定，以青蒿素(artemsinin)作為陽性對照，以200nm作為起始濃度按1/2的比例進行梯度稀釋(11個梯度)按照上面描述的方法進行培養(yǎng)和對抑制率進行計算，最后使用graphpad計算化合物對瘧原蟲生長抑制的ec50。本發(fā)明人得到的結果如(圖.1)，化合物no.37與青蒿素的效果相當，表現(xiàn)出了對瘧原蟲(惡性瘧原蟲(3d7c8))生長很強的抑制效果。

實施例2化合物細胞毒性ec50測定：

本發(fā)明人采用人腎上皮細胞293t和人肝癌細胞系hepg2進行細胞毒性實驗測定，化合物1um作為起始濃度并按1/2的比例進行梯度稀釋(11個梯度)，青蒿素作為對照，按上面所描述的方法進行培養(yǎng)和抑制率計算。最后使用graphpad進行ec50計算。如圖所示(圖2)，化合物no.37對細胞表現(xiàn)出很微弱的毒性，相比于對瘧原蟲生長抑制的ec50其細胞毒性ec50要高出約1000倍(圖2)。

實施例3與常用抗瘧藥相互作用檢測：

本發(fā)明人將no.37化合物與幾種常用抗瘧藥，青蒿素(artemisinin)，磷酸哌喹(piperaqiuoine)，本芴醇(lumefantrine)進行藥物互作測試，實驗結果如圖3所示，no.37化合物與這三種常用抗瘧藥都未出現(xiàn)拮抗作用。

實施例4化合物在小鼠體內的殺蟲效率分析：

在小鼠試驗中，本發(fā)明人采用有兩個不同品系的小鼠(balb/c，icr)來分別進行藥物實驗，給藥前分別每只老鼠接種10⁶的瘧原蟲，24小時之后進行給藥,連續(xù)給藥4天，dmso作為負對照，青蒿素作為正對照，并連續(xù)記錄小鼠原蟲率的變化情況，如圖4顯示本發(fā)明人可以看到，對照組在接種之后很快原蟲率就變得很高，而實驗組則幾乎看不到瘧原蟲，或者其出現(xiàn)的時間相對于對照組推遲很多，而且本發(fā)明人可以看到no.37化合物組以及其聯(lián)合用藥組的效果明顯要優(yōu)于青蒿素的對照組。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。