瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗的新用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗，具體涉及一種預(yù)防和治療瘧疾的紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗的新 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾是由瘧原蟲(chóng)屬（Plasmodium)引起的嚴(yán)重危害人類健康的全球性蟲(chóng)媒傳染性 疾病，與結(jié)核病、艾滋病并稱三大傳染病。根據(jù)瘧原蟲(chóng)的種類不同，瘧疾分為間日瘧、惡性 瘧、三日瘧和卵形瘧。對(duì)抗惡性瘧疾傳統(tǒng)手段主要依靠抗瘧藥物預(yù)防與治療，并配合殺蟲(chóng)劑 和清除蚊蟲(chóng)孽生地等衛(wèi)生措施清除傳瘧蚊媒。但由于瘧原蟲(chóng)對(duì)抗瘧藥物以及按蚊對(duì)殺蟲(chóng)劑 逐漸產(chǎn)生抗性，瘧疾疫苗的研制依然是全球當(dāng)前研宄關(guān)注的重點(diǎn)。
[0003]目前瘧疾疫苗主要分為三類，紅前期瘧疾疫苗、紅內(nèi)期瘧疾疫苗和傳播 阻斷型疫苗。其中，紅前期疫苗主要針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)子孢子階段的環(huán)子孢子蛋白 (circumsporozoiteprotein，CSP);而紅內(nèi)期疫苗多數(shù)都是基于裂殖子表面抗原和/或涉 及入侵紅細(xì)胞過(guò)程的抗原。此類抗原免疫接種有望刺激免疫者產(chǎn)生抗體，并在血液階段阻 斷瘧原蟲(chóng)入侵新的紅細(xì)胞和抑制其在紅細(xì)胞內(nèi)的裂體增殖，從而降低臨床發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)或嚴(yán) 重性；與前兩種疫苗不同，傳播阻斷型疫苗并不能阻止受試者免于感染，而是主要通過(guò)阻斷 瘧疾的傳播、防止患者將疾病帶到非流行區(qū)或者旅行者從疫區(qū)將惡性瘧疾帶回本地區(qū)造成 流行。該類疫苗以瘧原蟲(chóng)配子體或蚊期階段的特異分子為靶標(biāo)，阻斷蚊蟲(chóng)體內(nèi)瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)， 從而阻斷傳播。例如針對(duì)配子母細(xì)胞表面抗原Pf s230和PfS48/45的疫苗，其抗體可以阻 止按蚊中腸內(nèi)動(dòng)合子形成。還有一類針對(duì)按蚊中腸抗原的傳播阻斷疫苗，抑制病原體對(duì)蚊 胃壁的吸附，限制動(dòng)合子穿越蚊胃上皮細(xì)胞和子孢子進(jìn)入唾液腺。
[0004] 然而通常情況下傳播阻斷型抗原的免疫原性較弱且活性維持時(shí)間較短，部分免疫 佐劑也因安全隱患問(wèn)題而限制了其應(yīng)用。雖然痘病毒載體系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)改善了原核 表達(dá)傳播阻斷抗原的諸多不足，但重組蛋白不能復(fù)性至其天然構(gòu)象，導(dǎo)致產(chǎn)生的抗體對(duì)病 原體親和性偏低。另外，現(xiàn)有的瘧疾傳播阻斷型疫苗也面臨誘導(dǎo)抗體水平較低和免疫佐劑 引起的不良反應(yīng)等問(wèn)題。更為重要的是，由于傳播阻斷型疫苗并不能保護(hù)被免疫者，因此不 易被人群所接受，從而嚴(yán)重影響了其推廣應(yīng)用。因此，與單純的"利他型疫苗"相比，既能預(yù) 防免疫者感染又能阻斷瘧疾傳播的疫苗或許可以作為瘧疾疫苗發(fā)展的新方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供預(yù)防和治療瘧疾的紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗的一種新用途，即 將其作為傳播阻斷型疫苗應(yīng)用于瘧疾的傳播阻斷。
[0006] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0007] 1、瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗作為傳播阻斷型疫苗的應(yīng)用。
[0008] 滅活全蟲(chóng)疫苗是以瘧原蟲(chóng)全部蟲(chóng)體成分為抗原，輔以氫氧化鋁等佐劑制備的紅內(nèi) 期疫苗，包含了紅內(nèi)期原蟲(chóng)的全部成分（蛋白、核酸以及多糖等），現(xiàn)有技術(shù)中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表 明滅活全蟲(chóng)疫苗能顯著降低瘧原蟲(chóng)再次感染時(shí)的原蟲(chóng)血癥，減輕宿主的癥狀，縮短宿主患 病時(shí)間。
[0009] 進(jìn)一步，所述紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗是以瘧原蟲(chóng)全部蟲(chóng)體成分作為抗原，輔以佐劑 制備的紅內(nèi)期疫苗。
[0010] 進(jìn)一步，所述瘧原蟲(chóng)為間日瘧原蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、約氏瘧 原蟲(chóng)、伯氏瘧原蟲(chóng)、夏氏瘧原蟲(chóng)或文氏瘧原蟲(chóng)。
[0011] 進(jìn)一步，所述紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗為NSM蟲(chóng)株蟲(chóng)體抗原的PBS懸液與氫氧化鋁 佐劑按1:1的體積比混合而成；所述蟲(chóng)體抗原的PBS懸液中蟲(chóng)體抗原濃度為IX IO8個(gè) /50 y L ;所述PBS的pH值為7. 4,濃度為0? ImoVL0
[0012] 進(jìn)一步，所述NSM蟲(chóng)體抗原為用瘧原蟲(chóng)NSM蟲(chóng)株感染鼠后分別于第4天和第9天 收集的NSM原蟲(chóng)。
[0013] 常用的全蟲(chóng)疫苗抗原獲取僅在單個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集蟲(chóng)體抗原（比如感染后第4天），然 而由于瘧原蟲(chóng)具有很強(qiáng)的逃避宿主免疫的能力，比如var基因不同的修飾和編碼順序使得 瘧原蟲(chóng)不斷產(chǎn)生新的抗原逃避宿主體內(nèi)抗體的識(shí)別和殺傷。為此，本發(fā)明選擇在多個(gè)時(shí)間 點(diǎn)進(jìn)行蟲(chóng)體抗原收集，以便獲取更豐富的抗原類型。需要說(shuō)明的是，收集原蟲(chóng)的時(shí)間不限于 蟲(chóng)株感染后第4和第9天，還可有其它的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置。
[0014]2、瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗在制備預(yù)防或治療瘧疾的傳播阻斷型藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)將瘧原蟲(chóng)免疫血清應(yīng)用到瘧原蟲(chóng)的蚊期傳播 階段，發(fā)現(xiàn)用于紅內(nèi)期的全蟲(chóng)疫苗表現(xiàn)出一定的傳播阻斷效果，擴(kuò)大了全蟲(chóng)疫苗的使用范 圍，不僅對(duì)個(gè)體起到預(yù)防和治療，還能夠防止瘧疾在個(gè)體間相互傳播。
[0016] 紅前期遺傳減毒子抱子疫苗（Genetic attenuated sporozoite，GAS)作為一種多 效性瘧疾疫苗既可以保護(hù)免疫者抵御子孢子感染，又能保護(hù)免疫者免于低劑量的紅內(nèi)期瘧 原蟲(chóng)感染，具有良好應(yīng)用前景和潛在的市場(chǎng)價(jià)值。然而，受蚊媒飼養(yǎng)和感染平臺(tái)以及子孢子 來(lái)源、純化及運(yùn)輸?shù)葐?wèn)題制約，減毒子孢子疫苗在實(shí)際推廣應(yīng)用中受到明顯限制。
[0017] 相對(duì)而言，紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)可以通過(guò)體外培養(yǎng)獲得，更具有可操作性。本發(fā)明研宄發(fā) 現(xiàn)，紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗免疫小鼠的血清可以抑制瘧原蟲(chóng)在按蚊體內(nèi)的發(fā)育：通過(guò)尾靜脈將免 疫血清過(guò)繼至感染瘧原蟲(chóng)的小鼠體內(nèi)，按蚊叮吸上述處理小鼠后，其卵囊數(shù)量較對(duì)照組減 少45. 6~95.9%(表1);通過(guò)純化免疫血清中特異性IgG抗體和在小鼠體內(nèi)添加抗⑶4+T 細(xì)胞抗體詰抗CD4+T細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)，特異性抗體成分是紅內(nèi)期全蟲(chóng)疫苗發(fā)揮蚊期傳播 阻斷效果的主要因素。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0019] 圖1全蟲(chóng)免疫血清在紅內(nèi)期的保護(hù)效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面以約氏瘧原蟲(chóng)NSM蟲(chóng)株為例，對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施 例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0021] 實(shí)施例1滅活全蟲(chóng)疫苗制備
[0022] 首先復(fù)蘇液氮中保存的瘧原蟲(chóng)NSM蟲(chóng)株，然后將復(fù)蘇的NSM感染8-10只Balb/c小 鼠，并分別在感染后第4天和第9天收集NSM原蟲(chóng)作為蟲(chóng)體抗原。蟲(chóng)體抗原獲取過(guò)程主要流 程為：通過(guò)心臟取血獲取小鼠血液成分，并加入含有肝素的離心管中避免發(fā)生凝血；上述 血細(xì)胞經(jīng)pH值為7. 4,濃度為0. lmol/L的PBS清洗3次除去肝素后，添加終濃度為0. 5 % 的皂素以裂解紅細(xì)胞釋放出胞內(nèi)蟲(chóng)體抗原；上述組分經(jīng)PBS清洗3次除去血紅素后，通過(guò)反 復(fù)凍融方式使原蟲(chóng)細(xì)胞裂解，以獲取可供實(shí)驗(yàn)用抗原；將按上述操作獲得的第4天和第9天 抗原分別以PBS重懸至最終濃度為5 X IO7個(gè)/25 y L ;上述兩種抗原各取25 y L混合成為含 IX IO8個(gè)/50 y L的懸液，此懸液即為最終抗原。
[0023] 取50 y L上述最終抗原與50 y L氫氧化鋁佐劑混合，注射器反復(fù)抽吸使其充分 混勻形成100 UL乳液，此即為1只Babl/c小鼠的免疫用量。采用皮下多點(diǎn)注射的方式 (50 y L/次）免疫Balb/c小鼠，并于2周和4周后分別做第2次和第3次免疫，最后收集免 疫血清-80°C保存，供后續(xù)使用。
[0024] 實(shí)施例2全蟲(chóng)免疫血清對(duì)紅內(nèi)期保護(hù)效果
[0025] 復(fù)蘇液氮中保存的瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株NSM，按IX IO6個(gè)原蟲(chóng)/只的用量感染3只實(shí)施例1 中3次免疫后的Balb/c小鼠，并以3只正常Babl/c小鼠作對(duì)照；間隔24h取尾尖血制作血 涂片統(tǒng)計(jì)原蟲(chóng)血癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1，其中M1-M3為對(duì)照小鼠，M4-M6為全蟲(chóng)免疫小鼠。由 圖1可知，全蟲(chóng)免疫Balb/c小鼠獲得對(duì)大劑量紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)感染的良好保護(hù)效果：受免疫 小鼠最大原蟲(chóng)率降低75%以上，原蟲(chóng)清除時(shí)間縮短至7天，這是由于全蟲(chóng)疫苗包含了瘧原 蟲(chóng)紅內(nèi)期的所有抗原，故能誘導(dǎo)宿主的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。
[0026] 實(shí)施例3滅活全蟲(chóng)疫苗阻斷蚊期傳播
[0027] 首先用瘧原蟲(chóng)感染按蚊：復(fù)蘇液氮中保存的瘧原蟲(chóng)蟲(chóng)株NSM，按IX IO6個(gè)/只的計(jì) 量感染6只Balb/c小鼠，4天后血涂片評(píng)價(jià)瘧原蟲(chóng)配子體情況，從中選取配子體情況相當(dāng)?shù)?小鼠供后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。
[0028] 通過(guò)過(guò)繼全蟲(chóng)免疫血清的方式觀察滅活全蟲(chóng)疫苗免疫血清在蚊期傳播阻斷中的 作用；通過(guò)Protein-a蛋白親和層析凝膠分離得到全蟲(chóng)免疫血清中的特異性IgG抗體，通 過(guò)IgG過(guò)繼方式觀察特異性抗體在蚊期傳播阻斷中的作用（表1);通過(guò)往小鼠體內(nèi)注射抗 CD4+T細(xì)胞抗體以拮抗抑制CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生以干擾素（IFN-Y)為主的炎癥因子的方式，觀 察細(xì)胞因子在蚊期傳播阻斷中的作用（表2)。
[0029] 取實(shí)施例1中的全蟲(chóng)免疫血清、IgG抗體、對(duì)照血清（正常血清）分別按200 y L/ 只的計(jì)量尾靜脈注射至配子體情況相當(dāng)?shù)男∈笾?，然后將小鼠固定以供按?血餐"。"血 餐"30min后的按蚊在23°C飼養(yǎng)7天后，解剖蚊胃并統(tǒng)計(jì)卵囊數(shù)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-2。
[0030] 表1.全蟲(chóng)免疫血清及其IgG成分對(duì)蚊期瘧原蟲(chóng)發(fā)育抑制率
[0031]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗作為傳播阻斷型疫苗的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗是以瘧原蟲(chóng)全部 蟲(chóng)體成分作為抗原，輔以佐劑制備的紅內(nèi)期疫苗。
3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述瘧原蟲(chóng)為間日瘧原蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)、三 曰瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、約氏瘧原蟲(chóng)、伯氏瘧原蟲(chóng)、夏氏瘧原蟲(chóng)或文氏瘧原蟲(chóng)。
4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗為NSM蟲(chóng)株蟲(chóng)體抗 原的PBS懸液與氫氧化鋁佐劑按1:1的體積比混合而成；所述蟲(chóng)體抗原的PBS懸液中蟲(chóng)體 抗原濃度為IXIO8個(gè)/50yL;所述PBS的pH值為7. 4,濃度為0?lmol/L。
5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述NSM蟲(chóng)體抗原為用瘧原蟲(chóng)NSM蟲(chóng)株感染 鼠后分別于第4天和第9天收集的NSM原蟲(chóng)。
6. 瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗在制備預(yù)防或治療瘧疾的傳播阻斷型藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗的新用途，具體為瘧疾紅內(nèi)期滅活全蟲(chóng)疫苗作為傳播阻斷型疫苗的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)將瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期免疫血清應(yīng)用到瘧原蟲(chóng)的蚊期傳播階段，發(fā)現(xiàn)用于紅內(nèi)期的全蟲(chóng)疫苗表現(xiàn)出一定的阻斷蚊期傳播效果，擴(kuò)大了全蟲(chóng)疫苗的使用范圍，不僅對(duì)免疫個(gè)體起到預(yù)防和治療作用，還能夠大幅降低瘧疾在群體間的傳播機(jī)會(huì)。
【IPC分類】A61P33-06, A61K39-015
【公開(kāi)號(hào)】CN104771752
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510190955
【發(fā)明人】徐文岳, 朱鋒
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年4月21日