專利名稱：抗瘧疾的初始/加強(qiáng)免疫疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及采用重組方法產(chǎn)生的腺病毒載體和純化蛋白、并與佐劑相結(jié)合用于預(yù)防惡性瘧疾的新的初始/加強(qiáng)免疫(prime/boost)疫苗策略。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，瘧疾在全世界是熱帶和亞熱帶地區(qū)最為流行的感染疾病之一。每年，瘧疾感染在發(fā)展中國(guó)家造成大約兩百七十萬(wàn)人死亡。瘧疾廣泛流行和發(fā)病率升高的原因在于耐藥寄生蟲(chóng)和抗殺蟲(chóng)劑的寄生蟲(chóng)載體數(shù)量的增加。其他因素包括環(huán)境和氣候的改變、國(guó)家動(dòng)蕩以及人口流動(dòng)性增加。
瘧疾是由屬于瘧原蟲(chóng)屬的、由蚊媒傳播的血液內(nèi)原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)引起的。對(duì)人類致病的有4種瘧原蟲(chóng)(惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)、間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)、卵形瘧原蟲(chóng)(P.ovale)和三日瘧原蟲(chóng)(P.malariae))；其他多種則在動(dòng)物中引起疾病，例如約氏瘧原蟲(chóng)(P.yoelii)和柏格氏鼠瘧原蟲(chóng)(P.berghei)。人類感染大多由惡性瘧原蟲(chóng)導(dǎo)致，并且是致死率最高的類型。瘧原蟲(chóng)的生命周期由4個(gè)不同的階段組成。這些階段中的每一個(gè)均能夠誘導(dǎo)針對(duì)這種寄生蟲(chóng)以及相應(yīng)出現(xiàn)的階段特異性抗原的特異性免疫應(yīng)答，不過(guò)，自然發(fā)生的瘧疾不能產(chǎn)生抗再次感染的保護(hù)性。
瘧疾寄生蟲(chóng)由若干種雌性按蚊傳播給人類。被感染的蚊子將來(lái)自瘧原蟲(chóng)的子孢子注射到哺乳動(dòng)物的血流中。子孢子在侵入肝細(xì)胞前在循環(huán)中停留幾分鐘。在這一階段，寄生蟲(chóng)處于細(xì)胞外環(huán)境中，可以受到抗體的攻擊，這些抗體主要針對(duì)的是環(huán)子孢子(circumsporozoite，CS)蛋白，后者是子孢子表面的主要成分。一旦進(jìn)入肝臟，寄生蟲(chóng)即可復(fù)制并成為裂殖體。在這一階段，侵入性寄生蟲(chóng)將進(jìn)行無(wú)性繁殖，在每個(gè)感染的細(xì)胞中產(chǎn)生多達(dá)20,000個(gè)姊妹裂殖子。在寄生蟲(chóng)的這一細(xì)胞內(nèi)階段，宿主免疫應(yīng)答的主要角色是T-淋巴細(xì)胞，特別是CD8+T-淋巴細(xì)胞(Romeroet al.1989)。大約在感染肝臟一周后，數(shù)千裂殖子釋放至血流中并進(jìn)入紅細(xì)胞(RBC)，成為抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的靶位。侵入紅細(xì)胞后，裂殖子歷經(jīng)若干階段的復(fù)制，轉(zhuǎn)變?yōu)樽甜B(yǎng)體和裂殖體，它們破裂后產(chǎn)生新一代的裂殖子，繼而感染新的RBC。紅細(xì)胞階段與明顯的臨床疾病相關(guān)。少量滋養(yǎng)體可成為雄性或者雌性配子母細(xì)胞，這是寄生蟲(chóng)的有性階段。當(dāng)易感的蚊子吞入配子母細(xì)胞時(shí)，這些配子發(fā)生受精，形成合子，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)合子，然后轉(zhuǎn)變?yōu)槁涯?，且最終轉(zhuǎn)變?yōu)樽渔咦樱渔咦舆w移至唾液腺以完成周期。
寄生蟲(chóng)進(jìn)入體內(nèi)后出現(xiàn)的病原體特異性免疫應(yīng)答的兩個(gè)主要方面是細(xì)胞應(yīng)答和體液應(yīng)答，細(xì)胞應(yīng)答這一方面涉及參與免疫應(yīng)答的CD8+和CD4+T細(xì)胞。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表達(dá)CD8并能夠特異性殺傷表面表達(dá)病原體抗原的感染細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞或T輔助細(xì)胞支持CTL的產(chǎn)生，產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，并且還幫助誘導(dǎo)B細(xì)胞分裂并產(chǎn)生特異于抗原的抗體。在體液應(yīng)答中，特異于具體抗原的B細(xì)胞被激活，復(fù)制、分化并產(chǎn)生抗原特異性抗體。
免疫應(yīng)答的這兩方面均與抗瘧疾感染的保護(hù)作用相關(guān)。當(dāng)感染性子孢子移至肝臟并進(jìn)入肝細(xì)胞后，子孢子成為細(xì)胞內(nèi)病原體，極少出現(xiàn)在感染細(xì)胞外。在這一階段，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞是尤其重要的，這是由于T細(xì)胞及其細(xì)胞因子產(chǎn)物例如干擾素-γ(IFN-γ)，可殺死感染的宿主肝細(xì)胞。在鼠科動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，肝臟細(xì)胞內(nèi)的寄生蟲(chóng)的清除依賴于針對(duì)肝臟階段寄生蟲(chóng)所表達(dá)的肽的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(Hoffman andDoolan，2000)。去除CD8+T細(xì)胞可消除抗子孢子攻擊的不戶作用，而給未經(jīng)過(guò)試驗(yàn)的動(dòng)物( animals)過(guò)繼性轉(zhuǎn)移CD8+T細(xì)胞則可使之得到保護(hù)。
當(dāng)瘧疾感染達(dá)到裂殖子在RBC內(nèi)復(fù)制的紅細(xì)胞階段時(shí)，裂殖子也隨血流到處循環(huán)。由于紅細(xì)胞不表達(dá)用于與T細(xì)胞發(fā)生同源相互作用(cognate interaction)的I類或II類MHC分子，因此認(rèn)為在這一階段抗體應(yīng)答最為重要。總之，如果能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答以及強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答來(lái)對(duì)付寄生蟲(chóng)在人體中的各個(gè)不同階段，那么這樣的的瘧疾疫苗策略將是最為有益的。
根據(jù)如上所述的寄生蟲(chóng)的不同發(fā)育階段可以對(duì)當(dāng)前的開(kāi)發(fā)瘧疾疫苗的方法進(jìn)行分類?？梢詫⒖赡艿囊呙绶譃?種類型-前紅細(xì)胞疫苗(Pre-erythrocytic vaccines)，它們針對(duì)的是被子孢子和/或裂殖體感染的肝細(xì)胞。在歷史上，基于(CS)的策略一直占據(jù)著這一方法的主導(dǎo)地位。由于前紅細(xì)胞階段的感染沒(méi)有癥狀，因此理想地，前紅細(xì)胞疫苗應(yīng)該產(chǎn)生由體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答介導(dǎo)的無(wú)菌免疫(sterile immunity)，并完全預(yù)防潛伏的瘧疾感染。
-無(wú)性血液階段疫苗，它們針對(duì)的是被感染的RBC或者裂殖子本身，其被設(shè)計(jì)為用于盡量減輕臨床癥狀的嚴(yán)重程度。這些疫苗應(yīng)該能夠降低發(fā)病率和死亡率，并可預(yù)防寄生蟲(chóng)進(jìn)入紅細(xì)胞和/或在其中繁殖。
-阻斷傳播疫苗，它們被設(shè)計(jì)用于妨礙寄生蟲(chóng)在蚊子宿主內(nèi)的發(fā)育。這一類型的疫苗應(yīng)該有助于降低整個(gè)人群的瘧疾感染率。
最后，一直在所謂的多成分和/或多階段疫苗中尋求開(kāi)發(fā)針對(duì)寄生蟲(chóng)生命周期的多個(gè)階段的組合瘧疾疫苗的可行性。
盡管抗瘧疾疫苗的開(kāi)發(fā)早在30多年前就開(kāi)始了，但現(xiàn)在還沒(méi)有商品化的抗瘧疾疫苗。以輻照減毒的子孢子免疫嚙齒動(dòng)物、非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人類可產(chǎn)生抗隨后以活子孢子攻擊的保護(hù)作用(Nussenzweig et al.1967；Clyde et al.1973)。不過(guò)，費(fèi)用問(wèn)題以及缺乏用于生產(chǎn)經(jīng)照射的子孢子的可行的大規(guī)模培養(yǎng)體系目前仍然妨礙此類疫苗的廣泛應(yīng)用(Lukeet al.2003)。
迄今為止，在人類中測(cè)試的最為有前途的候選疫苗一直基于少數(shù)子孢子表面抗原。CS蛋白是已經(jīng)被證實(shí)的當(dāng)其在人類作為抗蚊媒感染的活性免疫基礎(chǔ)時(shí)能夠穩(wěn)定預(yù)防瘧疾的唯一的惡性瘧原蟲(chóng)抗原，盡管預(yù)防的水平經(jīng)常是不充分的。理論分析指出，疫苗的覆蓋率以及疫苗的功效應(yīng)該高于85％，否則，致病力更強(qiáng)的突變體會(huì)逃脫進(jìn)入疫區(qū)(Gandon etal.2001)。
在哺乳動(dòng)物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的一種方式是通過(guò)施用感染性載體，在其基因組中載有編碼抗原的核酸。此類載體之一是重組腺病毒，該病毒已經(jīng)通過(guò)去除基因組中通常是復(fù)制不可缺少的區(qū)域(例如E1區(qū))而成為復(fù)制缺陷型。包含編碼抗原的基因的重組腺病毒的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的(WO 96/39178)。例如，已經(jīng)證實(shí)，如果通過(guò)重組腺病毒輸送來(lái)自HIV的抗原性成分，可產(chǎn)生免疫應(yīng)答(WO 01/02607；WO 02/22080；US6,733,993)。對(duì)于瘧疾，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了基于重組腺病毒的疫苗。這些載體表達(dá)約氏瘧原蟲(chóng)的完整CS蛋白，約氏瘧原蟲(chóng)是小鼠瘧疾模型之一，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些載體能夠應(yīng)答于單一免疫劑量而在小鼠中誘導(dǎo)無(wú)菌免疫 et al.2001)。已經(jīng)證實(shí)，CD8+T細(xì)胞主要介導(dǎo)這種腺病毒誘導(dǎo)的保護(hù)作用。
由于很高比例的個(gè)體對(duì)通常使用的腺病毒載體例如腺病毒血清型5(Ad5)存在已有的免疫力，因此本領(lǐng)域曾開(kāi)發(fā)的新的技術(shù)，其中的重組復(fù)制缺陷型腺病毒是基于僅在一小部分健康個(gè)體中遇到以中和抗體形式存在的已有的免疫力的血清型。這些血清型通常被成為中和程度低的血清型(low-neutralized serotypes)或者少見(jiàn)血清型。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ad11，Ad24，Ad26，Ad34，Ad35，Ad48，Ad49和Ad50特別適用(WO 00/70071；WO02/40665；WO 2004/037294；WO 2004/083418；Vozels et al.2003)。
Vical，Inc.San Diego，CA，USA和Naval Medical Research Center(Horn et al.1995)開(kāi)發(fā)了含有表達(dá)惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白的質(zhì)粒的基于DNA的疫苗。小鼠模型的研究證實(shí)以質(zhì)粒DNA免疫之后誘導(dǎo)了抗原特異性CTL和抗體應(yīng)答(Doolan et al.1998)。不過(guò)，目前唯一使用的DNA疫苗在人類誘導(dǎo)保護(hù)性免疫應(yīng)答的作用并不理想。在使用DNA疫苗時(shí)發(fā)現(xiàn)被接種的志愿者沒(méi)有出現(xiàn)抗CS蛋白的抗體，這是通過(guò)針對(duì)風(fēng)干的子孢子的間接熒光抗體測(cè)試(IFAT)以及通過(guò)抗重組及合成肽的ELISA而評(píng)估的(Wang et al.2001)，不過(guò)，這些志愿者的CTL應(yīng)答很明顯。
與此不同的是，RTS，S(純化蛋白)瘧疾疫苗方法(Gordon et al.1995；US 6,306,625；WO 93/10152)能夠誘導(dǎo)針對(duì)CS蛋白的強(qiáng)抗體應(yīng)答(Kester et al.2001；Stoute et al.1997 and 1998)，不過(guò)其也是Th1型細(xì)胞免疫和體液免疫的強(qiáng)效誘導(dǎo)劑。最重要的是，該疫苗能夠可重復(fù)性地使大約半數(shù)接受疫苗者得到保護(hù)。不過(guò)，由RTS，S引發(fā)的保護(hù)作用持續(xù)時(shí)間較短(Stoute et al.1998)。以RTS，S免疫誘導(dǎo)抗CS抗體和CD4+T細(xì)胞依賴性IFN-γ誘導(dǎo)，但CD8+T細(xì)胞依賴性CTL或IFN-γ應(yīng)答較弱(Lalvani et al.1999)。不過(guò)，已經(jīng)證實(shí)所產(chǎn)生的此類最低限度的CD8+應(yīng)答與人類試驗(yàn)中的保護(hù)作用相關(guān)(Sun et al.2003)。因此，合理的改進(jìn)應(yīng)該是集中在增強(qiáng)誘導(dǎo)由RTS，S誘導(dǎo)的針對(duì)CS的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。
迄今尚未達(dá)到開(kāi)發(fā)具有至少85％的保護(hù)效力的惡性瘧疾疫苗這一目標(biāo)。這一任務(wù)特別困難之處在于，不同于其他常見(jiàn)致命疾病例如麻疹和天花，先前感染過(guò)瘧疾以及所產(chǎn)生的天然免疫力對(duì)以后的瘧疾感染沒(méi)有保護(hù)作用。在迄今已經(jīng)測(cè)試過(guò)的所有候選疫苗和疫苗輸送策略中，僅RTS，S一直穩(wěn)定地產(chǎn)生了一定水平的保護(hù)作用。其他所測(cè)試的候選疫苗或者是免疫原性不足，或者是具有免疫原性但保護(hù)性不充分。本申請(qǐng)公開(kāi)的策略在于組合疫苗制劑，其利用蛋白質(zhì)/佐劑方法的最佳的血清學(xué)免疫原性并通過(guò)重組復(fù)制缺陷型腺病毒載體出色地誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答。


圖1異源初始/加強(qiáng)免疫疫苗接種療法(Heterologous prime/boostvaccination regimens)，隨后通過(guò)IFN-γELISPOT分析測(cè)定與CS的C末端有關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。在末次加強(qiáng)免疫2周后測(cè)定應(yīng)答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖2通過(guò)IFN-γELISPOT分析測(cè)定與CS的C末端有關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。在末次加強(qiáng)免疫3個(gè)月后測(cè)定應(yīng)答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖3通過(guò)ELISA測(cè)定與CS的重復(fù)區(qū)有關(guān)的抗體應(yīng)答，加強(qiáng)免疫后2周。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖4通過(guò)ELISA測(cè)定與CS的重復(fù)區(qū)有關(guān)的抗體應(yīng)答，加強(qiáng)免疫后3個(gè)月。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖5T細(xì)胞應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)中以重組Ad35-CS載體初始免疫并以RTS，S或Ad35-CS加強(qiáng)免疫，2周(左)或者3個(gè)月(右)后通過(guò)IFN-γELISpot進(jìn)行測(cè)定。使用同源初始/加強(qiáng)/加強(qiáng)免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖6抗體應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)中以重組Ad35-CS載體初始免疫并以RTS，S或Ad35-CS加強(qiáng)免疫，2周(左)或者3個(gè)月(右)后通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)定。使用同源初始/加強(qiáng)/加強(qiáng)免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖7T細(xì)胞應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)中以重組Ad35-CS載體加強(qiáng)免疫并以RTS，S或Ad35-CS初始免疫，2周(左)或者3個(gè)月(右)后進(jìn)行測(cè)定。使用同源初始/加強(qiáng)/加強(qiáng)免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖8抗體應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)中以重組Ad35-CS載體加強(qiáng)免疫并以RTS，S或Ad5-CS初始免疫，2周(左)或者3個(gè)月(右)后進(jìn)行測(cè)定。使用同源初始/加強(qiáng)/加強(qiáng)免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖9加強(qiáng)免疫后2周，通過(guò)IFN-γELISPOT分析測(cè)定與CS的N末端有關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖10加強(qiáng)免疫后3個(gè)月，通過(guò)IFN-γELISPOT分析測(cè)定與CS的N末端有關(guān)的T細(xì)胞應(yīng)答。水平方向的短線代表幾何平均值。
圖11針對(duì)N末端的T細(xì)胞應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)中以重組Ad35-CS載體初始免疫并以RTS，S或Ad35-CS加強(qiáng)免疫，2周(左)或者3個(gè)月(右)后進(jìn)行測(cè)定。使用同源初始/加強(qiáng)/加強(qiáng)免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。
圖12針對(duì)N末端的T細(xì)胞應(yīng)答，實(shí)驗(yàn)中以重組Ad35-CS載體加強(qiáng)免疫并以RTS，S或Ad5-CS初始免疫，2周(左)或者3個(gè)月(右)后進(jìn)行測(cè)定。使用同源初始/加強(qiáng)/加強(qiáng)免疫療法RTS，S/RTS，S/RTS，S作為參照。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含存在于合適的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，所述腺病毒包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的環(huán)子孢子(CS)抗原的異源核酸；和佐劑化的蛋白質(zhì)抗原，其優(yōu)選地也來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)；其中所述重組腺病毒選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。優(yōu)選的蛋白質(zhì)抗原包含RTS，S。優(yōu)選的引起瘧疾的寄生蟲(chóng)是惡性瘧原蟲(chóng)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS抗原的異源核酸的復(fù)制缺陷型重組腺病毒以及佐劑化的蛋白質(zhì)抗原(其優(yōu)選地來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)例如惡性瘧原蟲(chóng))在制備用于治療或預(yù)防瘧疾的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是猴腺病毒或人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49或50。
本發(fā)明公開(kāi)了一些優(yōu)選的初始-加強(qiáng)免疫療法，其中優(yōu)選地將復(fù)制缺陷型重組腺病毒用作初始免疫組合物，而將佐劑化的蛋白質(zhì)抗原用作加強(qiáng)免疫組合物。
本發(fā)明還涉及對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種的方法，其步驟包括以存在于合適的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組腺病毒對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行初始免疫，所述腺病毒包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS抗原的異源核酸；并以佐劑化的蛋白質(zhì)抗原、優(yōu)選地為RTS，S，對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含存在于藥用可接受的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，所述腺病毒包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的環(huán)子孢子(CS)抗原的異源核酸；和佐劑化的蛋白質(zhì)抗原；其中所述重組腺病毒選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。優(yōu)選地，所述重組腺病毒是人類腺病毒血清型35。同樣優(yōu)選的是本發(fā)明的一種試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS蛋白或其免疫原性片段。所述蛋白質(zhì)抗原優(yōu)選地包含形式為與乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白(hybrid protein)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)抗原包含RTS，S。同樣優(yōu)選的是所述蛋白質(zhì)抗原以QS21和3D-MPL進(jìn)行佐劑化，優(yōu)選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體進(jìn)行配制。
盡管本領(lǐng)域已知有不同的寄生蟲(chóng)在人類引起瘧疾，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式是本發(fā)明的試劑盒，其中所述引起瘧疾的寄生蟲(chóng)是惡性瘧原蟲(chóng)。
為獲得適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答，優(yōu)選地所述異源核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以提高所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人類中的產(chǎn)生。重組腺病毒可與佐劑存在于混合物中。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知猴腺病毒可用于人類基因治療和疫苗。除此之外，還發(fā)現(xiàn)其他一些非人類腺病毒例如犬腺病毒和牛腺病毒也能夠在體外感染人細(xì)胞，且由于它們?cè)谌说臉悠分械难鍖W(xué)流行程度(seroprevalence)較低，因此也適合用于人類。因此，本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包含存在于藥用可接受的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒，所述腺病毒包含編碼密碼子優(yōu)化的來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)子孢子(CS)抗原的異源核酸；和包含RTS，S的佐劑化的蛋白質(zhì)抗原，其中優(yōu)選地所述蛋白質(zhì)抗原以QS21和3D-MPL進(jìn)行佐劑化，優(yōu)選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中。
根據(jù)本發(fā)明，如果將本發(fā)明的試劑盒的不同成分以特定的順序進(jìn)行施用，則本發(fā)明的特定的初始-加強(qiáng)免疫療法在免疫應(yīng)答方面可產(chǎn)生預(yù)料不到的顯著效果。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的一種試劑盒，其中所述復(fù)制缺陷型重組腺病毒是初始免疫組合物，而所述佐劑化的蛋白質(zhì)抗原是加強(qiáng)免疫組合物。單次施用疫苗(初始免疫)所引發(fā)的免疫應(yīng)答通常不足以有效地和/或持久地提供有效的保護(hù)，而重復(fù)施用(加強(qiáng)免疫)則能夠顯著增強(qiáng)針對(duì)疫苗抗原的體液和細(xì)胞應(yīng)答(例如見(jiàn)Estcourt et al.2002)。
本發(fā)明還涉及包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS抗原的異源核酸的復(fù)制缺陷型重組腺病毒以及佐劑化的蛋白質(zhì)抗原在制備用于治療或預(yù)防瘧疾的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒或者人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49或50，其中優(yōu)選地將復(fù)制缺陷型重組腺病毒用作初始免疫組合物，而將佐劑化的蛋白質(zhì)抗原用作加強(qiáng)免疫組合物。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及本發(fā)明的用途，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS蛋白或其免疫原性片段，優(yōu)選地來(lái)惡性瘧原蟲(chóng)。所述蛋白質(zhì)抗原優(yōu)選地包含形式為與乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。RTS，S優(yōu)選地是佐劑化的蛋白質(zhì)抗原，而優(yōu)選的佐劑是QS21和3D-MPL，優(yōu)選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中。
為了在哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人類中實(shí)現(xiàn)最佳表達(dá)并隨后產(chǎn)生最佳的免疫應(yīng)答，本發(fā)明所用的異源核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以提高所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人類中的產(chǎn)生。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種的方法以下步驟以存在于藥用可接受的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組腺病毒對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行初始免疫，所述腺病毒包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS抗原的異源核酸；并以佐劑化的蛋白質(zhì)抗原對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，所述佐劑化的蛋白質(zhì)抗原包含形式為與HBsAg形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。蛋白質(zhì)抗原優(yōu)選地包含RTS，S，其中優(yōu)選的佐劑是QS21和3D-MPL，其優(yōu)選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中，其中優(yōu)選的引起瘧疾的寄生蟲(chóng)是惡性瘧原蟲(chóng)。
用于產(chǎn)生重組腺病毒以及本發(fā)明的方法中所用的優(yōu)選的腺病毒可以是人類腺病毒或者非人類腺病毒，例如猴腺病毒、犬腺病毒和牛腺病毒，對(duì)于將要施用重組病毒的(人類)宿主，高度優(yōu)選的腺病毒是不會(huì)在所述宿主中遭遇已經(jīng)存在的免疫力的腺病毒。猴腺病毒和某些人腺病毒的血清型非常適合在此所述的這一目的。用于本發(fā)明的這些方法、用途以及試劑盒中的優(yōu)選的人類腺病毒是人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。
本發(fā)明還涉及對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種的方法，其中使用本發(fā)明的試劑盒。如果使用本發(fā)明的試劑盒、采用本發(fā)明的優(yōu)選的初始-加強(qiáng)免疫療法對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種，那么優(yōu)選地在加強(qiáng)免疫之后進(jìn)行一或多次后續(xù)加強(qiáng)免疫。
本發(fā)明涉及重組腺病毒作為至少一種瘧疾抗原的載體并與一種佐劑蛋白異源組合使用在初始/加強(qiáng)免疫療法中的用途。就初期的T細(xì)胞應(yīng)答(initial T cell response)和免疫應(yīng)答的持續(xù)時(shí)間而言，將病毒載體與佐劑化的蛋白組合使用用于異源初始/加強(qiáng)免疫療法，可給靈長(zhǎng)類提供優(yōu)越的免疫應(yīng)答，這一發(fā)現(xiàn)是令人驚異的。具體而言，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以攜帶編碼抗原的核酸的病毒載體對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行初始免疫，繼以單次或者多次注射佐劑化的蛋白質(zhì)抗原的后續(xù)加強(qiáng)免疫，可在定量和/或定性免疫應(yīng)答方面得到優(yōu)越的結(jié)果。優(yōu)選的病毒載體是腺病毒載體，更加優(yōu)選的是人類腺病毒載體，且進(jìn)一步更加優(yōu)選的是那些施用于哺乳動(dòng)物宿主后在宿主體內(nèi)僅遭遇低水平中和活性(neutralizing activity)的人類腺病毒載體。特別優(yōu)選的血清型是腺病毒11、24、26、34、35、48、49和50。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述蛋白質(zhì)抗原和由所述病毒載體編碼的抗原是瘧疾抗原，更加優(yōu)選地是惡性瘧原蟲(chóng)環(huán)孢子(CS)蛋白、或其免疫原性衍生物和/或片段。作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例，由病毒載體編碼的多肽包含編碼惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白的核酸，所述CS蛋白包括N端部分、中央部分重復(fù)區(qū)、以及C端部分(缺失了最C端的14個(gè)氨基酸GPI錨序列)，而所述蛋白質(zhì)抗原包含構(gòu)建體RTS，S，其缺乏N端區(qū)域。
用于本發(fā)明的任一或者所有方面的佐劑化的蛋白質(zhì)抗原可包含來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白或其免疫原性片段，其形式可以是融合蛋白。例如，抗原可包含與乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)融合的CS蛋白或免疫原性片段的雜合蛋白，該雜合蛋白可在原核或者真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，并具有脂蛋白顆粒的形式。所述融合蛋白可包含例如CS蛋白的基本上整個(gè)C端部分、4個(gè)或者更多個(gè)串聯(lián)重復(fù)的免疫顯性區(qū)域(immunodominant region)、和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。例如，雜合蛋白包含一序列，該序列含有至少160個(gè)氨基酸并與CS蛋白的C端部分基本同源，且可以缺乏CS蛋白的C端的末尾多個(gè)氨基酸，例如末尾的10個(gè)至12個(gè)氨基酸。該雜合蛋白的形式可以是混合的脂蛋白顆粒，例如與HbsAg形成的混合的脂蛋白顆粒。
具體而言，WO 93/10152公開(kāi)了一種雜合蛋白，其在WO 93/10152中被稱為“RTS*”，但在本文中被稱為“RTS”，其形式可以是與HbsAg形成的混合的脂蛋白顆粒，在本文中稱為RTS，S。在這些混合顆粒中，雜合蛋白∶S抗原的比率例如是1∶4。
在此稱為“RTS”的雜合蛋白是使用來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)NF54(克隆3D7；Caspers et al.1989)的CS蛋白基因序列產(chǎn)生的，并基本上包含來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)NF54的CS蛋白的整個(gè)207至395區(qū)域。包括于RTS中的NF54(3D7)CS蛋白序列的部分是如下所示的189個(gè)氨基酸的序列
DPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANP NANPNANPNA NPNANPNANPNANPNANPNA NPNANPNANP NANPNKNNQG NGQGHNMPND PNRNVDENANANSAVKNNNN EEPSDKHIKE YLNKIQNSLS TEWSPCSVTC GNGIQVRIKPGSANKPKDEL DYANDIEKKI CKMEKCSSVF NVVNSSIGL (SEQ ID NO1)。
具體的RTS是●由來(lái)自釀酒酵母(Sacchromyces cerevisae)TDH3基因序列的第1059-1061位核苷酸編碼的甲硫氨酸殘基(該讀碼框的1-1058位核苷酸構(gòu)成TDH3啟動(dòng)子本身)(Musti et al.1983)●3個(gè)氨基酸Met Ala Pro，來(lái)自通過(guò)用于構(gòu)建雜合基因(hybrid gene)的克隆過(guò)程而產(chǎn)生的核苷酸序列(1062-1070)。
●由1071-1637位編碼的一段189個(gè)氨基酸(見(jiàn)上，SEQ ID NO1)，其代表惡性瘧原蟲(chóng)株NF54(克隆3D7；Caspers et al.1989)的CS蛋白的207至395位氨基酸。
●由1638至1640位核苷酸編碼的氨基酸(Gly)，通過(guò)用于構(gòu)建雜合基因的克隆過(guò)程而產(chǎn)生。
●4個(gè)氨基酸，Pro Val Thr Asn，由1641至1652位核苷酸編碼，并代表乙型肝炎病毒(adw血清型)preS2蛋白(Valenzuela et al.1979)的4個(gè)羧基端氨基酸。
●一段226個(gè)氨基酸，由1653至2330位核苷酸編碼，且具體為乙型肝炎病毒(adw血清型)的S蛋白(Valenzuela et al.1979)。
RTS可以是混合顆粒的形式，即RTS，S，其中RTS∶S比率例如是1∶4。
盡管本發(fā)明決不限于瘧疾抗原，但在詳細(xì)講解本發(fā)明時(shí)使用的是編碼瘧疾抗原的病毒載體并結(jié)合佐劑化的蛋白質(zhì)性瘧疾抗原。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠使用來(lái)自其他致病因素的不同的抗原性插入物和相應(yīng)的蛋白質(zhì)抗原對(duì)本發(fā)明的教導(dǎo)進(jìn)行改動(dòng)，所述致病因素包括寄生蟲(chóng)、細(xì)菌、病毒、酵母、或者是自身抗原，后者包括但不限于腫瘤抗原(如PSA、gp100、CEA、MUC1、Her2/neu)等等。
本發(fā)明涉及復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，其包含編碼惡性瘧原蟲(chóng)抗原的異源核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述病毒載體是來(lái)自選自如下一組的血清型的腺病毒Ad11，Ad24，Ad26，Ad34，Ad35，Ad48，Ad49和Ad50。如此選擇人類腺病毒的原因在于將一般的腺病毒用作疫苗載體通常存在障礙，因?yàn)槿祟惼毡楦腥具^(guò)野生型腺病毒，后者可引起輕度的或者不明顯的疾病，例如普通感冒。當(dāng)隨后使用重組腺病毒血清型作為重組疫苗載體時(shí)，例如使用采用腺病毒的抗瘧疾疫苗時(shí)，由親代野生型血清型感染引起的免疫應(yīng)答可負(fù)面影響重組腺病毒血清型的效力。不同腺病毒血清型在全世界人群中的傳播隨地理區(qū)域的不同而不同。通常，優(yōu)選的血清型應(yīng)該在世界上的絕大多數(shù)地區(qū)的宿主中遭遇較低的中和活性，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)此已經(jīng)有若干概括性的報(bào)道。
本發(fā)明人現(xiàn)將重組腺病毒與純化蛋白的一種新的組合形式用于順序免疫接種方案，在此稱為異源初始/加強(qiáng)免疫，該方案利用的是由初始/加強(qiáng)免疫疫苗的不同組分所誘導(dǎo)的不同的免疫應(yīng)答。重組載體的選擇會(huì)受到重組載體在一小部分需要接種疫苗的人群中遭遇中和活性的影響。出乎意料的是，腺病毒載體化的抗原和佐劑化的蛋白質(zhì)抗原較單獨(dú)使用兩者中的任何一種疫苗可產(chǎn)生明顯增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。如本申請(qǐng)所公開(kāi)的，通過(guò)對(duì)體內(nèi)施用了疫苗的恒河猴的免疫應(yīng)答進(jìn)行體外測(cè)定可說(shuō)明這種免疫力的增強(qiáng)。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，重組復(fù)制缺陷型腺病毒是猴腺病毒，例如是自黑猩猩中分離的病毒。一些實(shí)例包括C68(也稱為Pan 9；US6,083,716)和Pan 5、6和7(WO 03/046124)。
在本發(fā)明的另一個(gè)具體方面，復(fù)制缺陷型重組病毒載體包含編碼CS蛋白或其免疫原性部分或者片段的核酸序列。優(yōu)選地，所述異源核酸序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以增強(qiáng)在哺乳動(dòng)物、優(yōu)選地在人類中的表達(dá)。密碼子優(yōu)化基于感興趣的哺乳動(dòng)物的所需氨基酸含量、及其通常最佳的密碼子使用情況，并需要避免一些方面以確保適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)。這些方面可以是剪接供體或者受體位點(diǎn)、終止密碼子、Chi位點(diǎn)、poly(A)段、富含GC和AT序列、內(nèi)部TATA盒、等等。哺乳動(dòng)物宿主的密碼子優(yōu)化方法是本領(lǐng)域人員熟知的，且可參見(jiàn)一些分子生物學(xué)文獻(xiàn)。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，其中所述異源核酸中腺嘌呤加胸腺嘧啶的含量與胞嘧啶加鳥(niǎo)嘌呤的含量相比低于87％，優(yōu)選地低于80％，更加優(yōu)選地低于59％，且最優(yōu)選地等于大約45％。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，其中CS蛋白是WO 2004/055 187中公開(kāi)的任一CS蛋白，最優(yōu)選地是來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的CS蛋白或其免疫原性片段。
如何產(chǎn)生攜帶異源基因的重組腺病毒載體是本領(lǐng)域人員已知的，且通常包括使用包裝細(xì)胞系、適配構(gòu)建體(adapter constructs)和粘粒，并自腺病毒基因組中缺失E1區(qū)域的至少一個(gè)功能性部分(包裝系統(tǒng)和優(yōu)選的細(xì)胞系可參見(jiàn)下文)。
本發(fā)明還涉及試劑盒，作為其成分，試劑盒一方面包含在宿主中遭遇較低中和活性的重組腺病毒載體，另一方面包含純化的蛋白質(zhì)，其中優(yōu)選地所述純化的蛋白質(zhì)的形式為與佐劑形成的混合物。優(yōu)選的佐劑是QS21和3D-MPL，優(yōu)選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中。在異源初始/加強(qiáng)免疫疫苗輸送策略的成分中，優(yōu)選地將重組腺病毒載體作為初始免疫劑而首先施用，然后將純化蛋白作為加強(qiáng)免疫劑而施用，該加強(qiáng)免疫可重復(fù)一次以上。所述成分通常存在于藥用可接受的載體中。藥用可接受的載體是本領(lǐng)域熟知的且廣泛用于各種治療產(chǎn)品中。優(yōu)選地，所述載體適合用于疫苗。更優(yōu)選地，所述疫苗還包含佐劑。本領(lǐng)域熟知佐劑可進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)所施用的抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的試劑盒在瘧疾的治療、預(yù)防或者診斷中的用途。
本發(fā)明涉及治療哺乳動(dòng)物的瘧疾感染或者預(yù)防哺乳動(dòng)物的瘧疾感染的方法，所述方法包含(按照任一順序或者同時(shí))以下步驟施用攜帶惡性瘧原蟲(chóng)抗原的重組腺病毒；并施用至少一種純化的惡性瘧原蟲(chóng)蛋白，所述蛋白與佐劑混合。優(yōu)選地，所述重組腺病毒選自Ad11，Ad24，Ad26，Ad34，Ad35，Ad48，Ad49和Ad50，而重組腺病毒攜帶編碼CS蛋白或其免疫原性片段的基因也是優(yōu)選的。用于與重組腺病毒進(jìn)行組合的優(yōu)選的純化蛋白是RTS，S，而優(yōu)選的佐劑是QS21和3D-MPL，其優(yōu)選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中。
產(chǎn)生免疫應(yīng)答背后的驅(qū)動(dòng)力是細(xì)胞因子，后者是多種已知的蛋白質(zhì)信使，其作用在于輔助免疫系統(tǒng)的細(xì)胞并將最終的免疫應(yīng)答導(dǎo)向Th1或者Th2應(yīng)答。因此，高水平的Th1型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)針對(duì)給定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的Th2型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)針對(duì)抗原的體液免疫應(yīng)答。重要的是，Th1和Th2型免疫應(yīng)答的區(qū)別并非是絕對(duì)的。在實(shí)際情況中，個(gè)體將支持將免疫應(yīng)答描述為是Th1占主導(dǎo)的或者Th2占主導(dǎo)的。不過(guò)，通?？煞奖愕馗鶕?jù)Mosmann和Coffman(1989)所述的鼠科CD4+T細(xì)胞克隆的細(xì)胞因子家族對(duì)其加以考慮。通常，Th1型應(yīng)答與T-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ和IL-2細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)。其他通常與誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答直接相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子(例如IL-12)不是由T細(xì)胞產(chǎn)生的。相反，Th2型應(yīng)答與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和腫瘤壞死因子-(TNF-β)的分泌相關(guān)聯(lián)。
用于本發(fā)明的合適的佐劑包括鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(alum)或者磷酸鋁，但也可以使鈣鹽、鐵鹽或者鋅鹽，或者可以是?；睦野彼岬牟蝗苄詰乙?、或者酰化的糖、陽(yáng)離子或陰離子衍生的多糖、含磷氮鏈聚合物(polyphosphazenes)、或Montanide脂質(zhì)體。
在用于本發(fā)明的疫苗配制品中，就腺病毒載體方面而言，可施用或者不施用佐劑。就這一組合中的蛋白質(zhì)成分而言，可選擇優(yōu)先誘導(dǎo)Th1應(yīng)答的佐劑組合物。此外，也可以誘導(dǎo)其他應(yīng)答，包括其他體液應(yīng)答。
某些疫苗佐劑特別適合于刺激Th1或Th2型細(xì)胞因子應(yīng)答。通常，在接種疫苗或者感染之后，免疫應(yīng)答的Th1∶Th2平衡的最佳指標(biāo)包括在以抗原再次刺激后在體外直接測(cè)定T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的Th1 or Th2細(xì)胞因子，和/或測(cè)定抗原特異性抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2a比率。因此，Th1型佐劑是這樣一種佐劑，當(dāng)以抗原在體外再次刺激分離的T細(xì)胞群時(shí)，其刺激分離的T細(xì)胞群產(chǎn)生高水平的Th1型細(xì)胞因子，并誘導(dǎo)與Th1型同種型相關(guān)聯(lián)的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答。例如，那些可以配制為用于產(chǎn)生適合用于本發(fā)明的佐劑的Th1型免疫刺激劑可包括單磷酰基脂質(zhì)A，特別是3-de-O-?；膯瘟柞；|(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL是熟知的佐劑，生產(chǎn)商是Ribi Immunochem，Montana。在化學(xué)上，其通常是作為3-de-O-?；膯瘟柞；|(zhì)A與4、5、或者6?；逆湹幕旌衔锒峁┑??？刹捎肎B 2122204B所公開(kāi)的方法對(duì)其進(jìn)行純化和制備，該文獻(xiàn)還公開(kāi)了制備二磷酰基脂質(zhì)A及其3-O-去?；淖凅w。其他純化的或者合成的脂多糖已經(jīng)被公開(kāi)(US Pat.6,005,099，EP 0729473 B1，EP 0549074B1)。在一個(gè)實(shí)施方式中，3D-MPL的形式是微粒配制品，具有直徑小于0.2μm的小顆粒大小，其制備方法在EP 0689454中已經(jīng)公開(kāi)。
皂角苷是Th1免疫刺激劑的另一種實(shí)例，可用于本發(fā)明。皂角苷熟知的佐劑。例如，Quil A(來(lái)自南美洲的樹(shù)木Quillaja Saponaria Molina的樹(shù)皮)及其成分公開(kāi)于US Pat.5,057,540和EP 0362279 B1。溶血性皂角苷QS21和QS17(Quil A的HPLC純化成分)已經(jīng)被公開(kāi)為強(qiáng)效的全身性佐劑，其生產(chǎn)方法公開(kāi)于US Pat.5,057,540和EP 0362279 B1。這些文獻(xiàn)還公開(kāi)了QS7(Quil-A的非溶血性成分)的用途，其作為強(qiáng)效的佐劑用于全身性疫苗。QS21與聚山梨醇酯或環(huán)糊精的組合也是已知的(WO99/10008)。包含QuilA的成分如QS21和QS7的微粒性佐劑系統(tǒng)公開(kāi)于WO 96/33739和WO 96/11711。
免疫刺激劑的另一個(gè)實(shí)例是免疫刺激性寡核苷酸，其含有未甲基化的CpG二核苷酸(″CpG″)。CpG是DNA中的胞嘧啶-鳥(niǎo)嘌呤核苷二核苷酸基序的縮寫(xiě)。已知CpG當(dāng)通過(guò)全身途徑和粘膜途徑施用時(shí)均可作為佐劑(WO 96/02555，EP 0468520)。歷史上，曾發(fā)現(xiàn)卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)的DNA成分能夠產(chǎn)生抗腫瘤作用。在進(jìn)一步的研究中，來(lái)自BCG基因序列的合成的寡核苷酸被發(fā)現(xiàn)能夠誘導(dǎo)免疫刺激作用(體外和體內(nèi)均有)。這些研究的作者認(rèn)為某些回文順序，包括中心CG基序，具有這種活性。詳細(xì)的分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CG基序肯定存在于特定的序列關(guān)系中，且此類序列常見(jiàn)于細(xì)菌DNA，當(dāng)罕見(jiàn)于脊椎動(dòng)物DNA。免疫刺激序列通常是嘌呤、嘌呤、C、G、嘧啶、嘧啶；其中CG基序是沒(méi)有甲基化的，但其他未甲基化的CpG序列已知具有免疫刺激性并可用于本發(fā)明。
在這6個(gè)核苷酸的特定組合中可以出現(xiàn)回文順序。這些基序中的一些，其或是一個(gè)基序的重復(fù)或是不同基序的組合，可出現(xiàn)于同一個(gè)寡核苷酸中。存在一或多種這些含有免疫刺激序列的寡核苷酸可激活各種免疫亞型，包括天然殺傷細(xì)胞(其產(chǎn)生干擾素-γ并具有細(xì)胞毒活性)和巨噬細(xì)胞。其他含有未甲基化的CpG卻不具有這一共有序列的序列也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)作用。當(dāng)配制到疫苗中時(shí)，CpG通常以游離溶液的形式與游離抗原一同施用(WO 96/02555，68)或者與抗原共價(jià)結(jié)合施用(WO 98/16247)，或者以載體例如氫氧化鋁配制(肝炎表面抗原)。
上述的此類免疫刺激劑可與載體一同配制，所述載體例如為脂質(zhì)體、水包油乳液和/或金屬鹽類，包括鋁鹽(如氫氧化鋁)。例如，3D-MPL可與氫氧化鋁(EP 0689454)或水包油乳液(WO 95/17210)一起配制；QS21可方便地與含有膽固醇的脂質(zhì)體(WO 96/33739)、水包油乳液(WO 95/17210)或者alum(WO 98/15287)一起配制；CpG可與alum或者其他陽(yáng)離子載體一起配制。
還可以使用免疫刺激劑的組合，例如單磷?；|(zhì)A和皂角苷衍生物的組合(WO 94/00153；WO 95/17210；WO 96/33739；WO 98/56414；WO 98/05355；WO 99/12565；WO 99/11241)或QS21和3D-MPL的組合物，見(jiàn)WO 94/00153?；蛘?，本發(fā)明也可以使用CpG加皂角苷(例如QS21)的組合。因此，合適的佐劑系統(tǒng)包括，例如，單磷?；|(zhì)A如3D-MPL與鋁鹽的組合。另一個(gè)實(shí)施方式是單磷酰基脂質(zhì)A與皂角苷衍生物的組合，例如QS21和3D-MPL的組合，參見(jiàn)WO 94/00153，或者一種反應(yīng)原性更低的組合物，其中QS21被淬滅于(quenched in)含有膽固醇的脂質(zhì)體(DQ)，參見(jiàn)WO 96/33739。而另一種佐劑配制品包括QS21、3D-MPL和生育酚，存在于水包油乳液中，參見(jiàn)WO 95/17210。在另一個(gè)實(shí)施方式中，單獨(dú)使用CpG寡核苷酸或?qū)⑵渑c鋁鹽一起使用。
用于本發(fā)明的合適的佐劑是傾向于刺激Th1的佐劑，例如包含皂角苷如QS21或單磷?；|(zhì)A衍生物如3D-MPL的佐劑，或同時(shí)包含上述兩者以及任選地與含有膽固醇的脂質(zhì)體的佐劑。例如WO 96/33739公開(kāi)了與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中的QS21和3D-MPL的組合。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是多方面的。重組病毒，例如重組腺病毒，可通過(guò)使用被認(rèn)為是安全的細(xì)胞以很高的滴度進(jìn)行制備，所述細(xì)胞能夠在懸液中生長(zhǎng)達(dá)到很高的量，所使用的培養(yǎng)基不含有任何來(lái)自動(dòng)物或者人的組分。此外，已知重組腺病毒可引發(fā)針對(duì)由腺病毒基因組中的異源核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的顯著的免疫應(yīng)答。本發(fā)明將這些特征組合于一種攜帶惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)子孢子基因的載體中并利用佐劑化的蛋白質(zhì)來(lái)加強(qiáng)應(yīng)答。此外，所述基因已經(jīng)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以使得表達(dá)水平適合于在人體產(chǎn)生合適的免疫應(yīng)答。本發(fā)明提供抗瘧疾感染的疫苗，其利用的是不會(huì)遭遇高滴度的中和抗體的腺病毒。用于這一目的的高度優(yōu)選的腺病毒是血清型11和35(Ad11和Ad35，見(jiàn)WO 00/70071和WO 02/40665)。
在引起瘧疾的病原體如惡性瘧原蟲(chóng)與感興趣的宿主例如人類之間，其核酸含量是非常不同的。本發(fā)明提供密碼子優(yōu)化的核酸，其能夠在哺乳動(dòng)物例如人體內(nèi)達(dá)到更高的表達(dá)水平。
利用不同的實(shí)體進(jìn)行在此所述的初始/加強(qiáng)免疫療法提供了一種免疫方法，其能夠同時(shí)提供免疫系統(tǒng)的細(xì)胞免疫和體液免疫這兩方面的合適的免疫應(yīng)答。其涉及CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和抗體。這些疫苗這的任一種單獨(dú)應(yīng)用均不能產(chǎn)生持久的、能夠激發(fā)最佳水平的抗原特異性CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和抗體的免疫應(yīng)答。此外，不同組分的施用順序可改變這些免疫應(yīng)答，并可能造成抗將來(lái)感染的保護(hù)作用持續(xù)不同時(shí)間。本發(fā)明的方法和試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)引發(fā)對(duì)付寄生蟲(chóng)在人體中的生命周期的所有不同階段的免疫應(yīng)答，從循環(huán)的子孢子和裂殖子到感染的肝細(xì)胞和RBC。此外，其能夠在一長(zhǎng)段時(shí)期內(nèi)提供抗瘧疾感染的持久的保護(hù)作用。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及重組腺病毒的用途，通過(guò)使得腺病毒基因組的E1區(qū)的至少部分被缺失已經(jīng)使得所述重組腺病毒成為復(fù)制缺陷型，該E1區(qū)對(duì)于新產(chǎn)生的腺病毒進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和包裝等過(guò)程來(lái)說(shuō)是必需的。缺失E1的載體通常是在能夠?qū)λ笔У腅1功能進(jìn)行互補(bǔ)的細(xì)胞系上產(chǎn)生的。關(guān)于此類細(xì)胞系及其在產(chǎn)生重組病毒中的用途已經(jīng)有詳細(xì)的描述并且在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的。優(yōu)選地，可使用由以保藏號(hào)ECACC no.96022940保藏于Centre for AppliedMicrob iology and Research(CAMR，UK)的European Collection of AnimalCell Cultures(ECACC)的細(xì)胞所代表的PER.C6細(xì)胞或其衍生細(xì)胞來(lái)防止產(chǎn)生能夠復(fù)制的腺病毒(rca)。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用的細(xì)胞支持除來(lái)自腺病毒血清型5(Ad5)的重組腺病毒以外的重組腺病毒的生長(zhǎng)。在此引用以下文件WO 97/00326、WO 01/05945、WO01/07571、WO 00/70071、WO 02/40665和WO 99/55132，其中公開(kāi)了如何獲得Ad5的以及其他腺病毒血清型的無(wú)rca腺病毒原液的方法和手段，所述其他腺病毒血清型例如為重組復(fù)制缺陷型Ad35，后者能夠在通過(guò)來(lái)自Ad35的E1而達(dá)到永生的HER細(xì)胞上產(chǎn)生，或者在PER.C6細(xì)胞上產(chǎn)生，PER.C6細(xì)胞進(jìn)一步包含來(lái)自Ad35的E1基因以便對(duì)B型腺病毒提供合適的互補(bǔ)。
需要注意的是，在下述公開(kāi)的文獻(xiàn)中WO 00/03029、WO02/24730、WO 00/70071和WO 02/40665，Ad50被錯(cuò)誤地稱為Ad51。在以上提及的文獻(xiàn)中，其中提到的Ad51血清型與De Jong et al.(1999)的一篇出版物中的血清型Ad50是相同的，在De Jong et al.(1999)的出版物中其被稱為B群腺病毒。為清楚起見(jiàn)，在此所用的Ad50是De Jonget al.(1999)所提到的B群Ad50血清型。
本發(fā)明的疫苗通常用于初始/加強(qiáng)免疫方案，例如Ad/蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)/Ad；蛋白質(zhì)/Ad/Ad；Ad/蛋白質(zhì)/Ad；Ad/Ad/蛋白質(zhì)；Ad/蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)；Ad/蛋白質(zhì)/病毒載體/蛋白質(zhì)，等等。能夠預(yù)見(jiàn)的是，與另一種類型的疫苗(例如裸DNA或不同于腺病毒的重組病毒載體)的組合也可與本發(fā)明的初始/加強(qiáng)免疫藥劑組合使用。還可使用額外的瘧疾抗原或者(多)肽。
在此，如果一種核酸可通過(guò)對(duì)得自野生型病毒的野生型序列進(jìn)行直接克隆而得到，則使用序列“來(lái)自”的表述，雖然它們也可例如利用不同段的DNA作為模板通過(guò)PCR而得到。這也意味著此類序列可以是野生型的形式以及改變的形式。達(dá)到同樣結(jié)果的另一種方法通過(guò)組合合成的DNA。應(yīng)該理解的是，“來(lái)自”并不排他性地意味著對(duì)野生型DNA進(jìn)行直接克隆。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員還能意識(shí)到可利用分子生物學(xué)方法獲得特定的一段核酸的突變體形式。術(shù)語(yǔ)“其功能性部分、衍生物和/或類似物”應(yīng)理解為等同于它們與之有關(guān)的核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解這一事實(shí)，即某些缺失、交換、(點(diǎn))突變、添加等等，仍可得到具有與原始核酸序列相似的功能的核酸序列，且一旦翻譯后能夠產(chǎn)生相似的或者甚至是相同的多肽。因此應(yīng)該理解的是，此類并不顯著改變核酸序列的功能性的變化落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如果特定的腺病毒載體來(lái)自所選擇的特定的腺病毒血清型，也應(yīng)該理解最終的產(chǎn)品可通過(guò)間接途徑獲得，例如采用本領(lǐng)域已知的方法直接克隆和合成特定的基因組DNA段。不改變本發(fā)明的具體方面而對(duì)基因組的內(nèi)容作出的特定缺失、突變或者其他變化仍被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。此類變化的實(shí)例是例如病毒骨架內(nèi)的缺失，以便能夠克隆更大的異源核酸段。此類突變的實(shí)例是例如E3缺失或者腺病毒的E2和/或E4蛋白的編碼區(qū)域的缺失和/或變化。對(duì)腺病毒骨架進(jìn)行的此類變化是本領(lǐng)域已知的且經(jīng)常采用的，因?yàn)榭臻g對(duì)于待包裝的腺病毒來(lái)說(shuō)是一個(gè)限制因素；這是要缺失腺病毒基因組的某些部分的主要原因。改變基因組的E2、E3和/或E4區(qū)域的其他原因可能涉及腺病毒載體的穩(wěn)定性或者整體性，例如參見(jiàn)WO03/104467和WO 2004/001032)。這些申請(qǐng)涉及將來(lái)自一個(gè)亞群的血清型的E4orf6基因用于來(lái)自另一亞群的腺病毒的骨架內(nèi)，以確保在包裝細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和包裝的過(guò)程中，E4orf6活性與E1B-55K活性相適合。它們還涉及使用合適的功能性pIX啟動(dòng)子來(lái)獲得更高的pIX表達(dá)水平和更穩(wěn)定的重組腺病毒載體。
“復(fù)制缺陷型”在此意味著病毒載體在非互補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制。在互補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)，復(fù)制所需的功能且由此產(chǎn)生病毒載體所需的功能是由互補(bǔ)細(xì)胞提供的。本發(fā)明的復(fù)制缺陷型病毒載體沒(méi)有攜帶在除互補(bǔ)細(xì)胞之外的任何宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制所需的全部元件。
“異源”在此當(dāng)與核酸有關(guān)時(shí)意味著核酸序列來(lái)自與該異源核酸所克隆入其中的野生型病毒載體不同的來(lái)源。例如就腺病毒而言，克隆入復(fù)制缺陷型腺病毒載體的異源核酸不是腺病毒的核酸序列，而是來(lái)自感興趣的某些其他致病因素。
“異源”在此當(dāng)與初始-加強(qiáng)免疫疫苗策略有關(guān)時(shí)意味著施用兩種或者多種不同的組分，作為實(shí)例的是將一種重組非復(fù)制型腺病毒載體與一種佐劑化的蛋白質(zhì)有意圖地組合使用，而不是如現(xiàn)有技術(shù)中所通常采用的那樣，將一種組分施用若干次。
“抗原”在此是指任何來(lái)自一原料的抗原，所述原料在被輸送(施用)了決定簇的宿主內(nèi)引發(fā)免疫應(yīng)答?？乖梢詠?lái)自外來(lái)原料，如病原體、寄生蟲(chóng)、或者甚至是自身抗原?？刹捎帽景l(fā)明的復(fù)制缺陷型重組病毒來(lái)輸送的瘧原蟲(chóng)抗原的實(shí)例是環(huán)子孢子蛋白(CS)、SE36多肽、裂殖子表面蛋白-1 19kDa C端多肽(MSP-1p19)、MSP-1、MSP-1p42、ApicalMerozoite Antigen-1(AMA-1)、Liver Stage Antigen 1(LSA-1)或LiverStage Antigen-3(LSA-3)，或者上述任一的片段。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)子孢子(CS)蛋白。
“密碼子優(yōu)化”在此意味著序列的核酸內(nèi)容已經(jīng)被改變，以便在將編碼所述蛋白的基因輸送于其中的感興趣的宿主中使得感興趣的蛋白具有足夠高的表達(dá)水平。足夠高的表達(dá)水平在此是指蛋白質(zhì)的水平應(yīng)該高到足以在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答以便保護(hù)宿主抵抗感染或者抵抗疾病。本領(lǐng)域人員已知某些疫苗在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，由此大約60％的被接種個(gè)體可抵抗隨后由使用病原體(如子孢子)進(jìn)行攻擊而誘導(dǎo)的疾病。因此，如果60％或者更多的被處理的個(gè)體能夠抵抗隨后的感染而得到保護(hù)，那么可認(rèn)為表達(dá)水平是足夠的。可以相信，通過(guò)將可施用的腺病毒方面與在此所公開(kāi)的抗原選擇相組合，可以達(dá)到這些百分?jǐn)?shù)。優(yōu)選地，85％的個(gè)體得到保護(hù)，不過(guò)最優(yōu)選的是超過(guò)90％的被接種宿主可抵抗隨后的攻擊而得到保護(hù)。本發(fā)明公開(kāi)的核酸經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在人類表達(dá)。根據(jù)Narum et al.(2001)，與胞嘧啶加鳥(niǎo)嘌呤(C+G)的百分?jǐn)?shù)相比，人類DNA中腺嘌呤加胸腺嘧啶(A+T)的含量約為59％。惡性瘧原蟲(chóng)的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量總體約為80％。惡性瘧原蟲(chóng)的CS基因的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量約為87％。為得到足夠的保護(hù)作用，認(rèn)為有必要提高宿主內(nèi)的產(chǎn)生水平。實(shí)現(xiàn)這一目的的一個(gè)途徑是調(diào)整密碼子的使用以保持最終的氨基酸序列相同，不過(guò)使用的是哺乳動(dòng)物進(jìn)行表達(dá)時(shí)更通常使用的密碼子序列。為此，本發(fā)明的復(fù)制缺陷型重組病毒載體在本發(fā)明的異源核酸中具有的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量低于87％，優(yōu)選地低于80％，且更加優(yōu)選地低于或等于大約59％?；谌祟惖拿艽a子使用規(guī)則和惡性瘧原蟲(chóng)和約氏瘧原蟲(chóng)的CS基因的氨基酸含量，密碼子優(yōu)化的基因的百分比甚至更低，大約達(dá)到本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸含量的45％。因此，就CS基因而言，它們優(yōu)選地具有約45％的腺嘌呤加胸腺嘧啶含量。應(yīng)該理解的是，如果待治療的是不同于人的另一物種，該物種可具有不同的腺嘌呤加胸腺嘧啶濃度(低于或者高于59％)和/或不同的密碼子使用規(guī)則，可以調(diào)整本發(fā)明的編碼CS蛋白的基因以便適合所需的含量并產(chǎn)生適合于所述具體宿主的表達(dá)水平。當(dāng)然，也不能排除的是，在世界上不同的地理區(qū)域內(nèi)，含量的微小改變可造成表達(dá)水平的微小改變。也應(yīng)該理解，蛋白質(zhì)的氨基酸序列內(nèi)重復(fù)序列數(shù)量出現(xiàn)微小改變，百分比會(huì)相應(yīng)地不同?？蓪?duì)其他感興趣的抗原進(jìn)行類似的修飾。所有這些調(diào)整的含量均為本發(fā)明的一部分。
稱為RTS，S的蛋白質(zhì)是融合蛋白，由惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白C端一半組成(中心41個(gè)NANP重復(fù)序列中的17個(gè)加C端部分的絕大部分)，表達(dá)為與乙型肝炎病毒表面抗原形成的融合蛋白。
不能復(fù)制的腺病毒載體的顯著優(yōu)點(diǎn)之一在于親代病毒具有較小的致病性，并有報(bào)道認(rèn)為這些載體在任何個(gè)體、包括在具有免疫抑制的個(gè)體內(nèi)不會(huì)引起明顯的疾病。在小鼠瘧疾(約氏瘧原蟲(chóng))模型中的研究提示，表達(dá)CS蛋白的重組腺病毒構(gòu)建體不僅引起突出的細(xì)胞免疫應(yīng)答，它們還提供出色的抗感染保護(hù)作用。因此，為了提高T細(xì)胞應(yīng)答的強(qiáng)度和延長(zhǎng)針對(duì)CS的總體免疫應(yīng)答，本發(fā)明人決定將腺病毒方法與重組蛋白質(zhì)方法進(jìn)行組合，成為一種新的異源初始-加強(qiáng)免疫策略。
不過(guò)，小鼠并不是預(yù)測(cè)人類應(yīng)答的理想模型，對(duì)于腺病毒35(Ad35)尤為如此。標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)制缺陷型載體是腺病毒5(Ad5)，但其已經(jīng)在載體能力優(yōu)化方面表現(xiàn)出一些問(wèn)題，原因在于該病毒具有廣泛的地區(qū)性流行，且在全球范圍內(nèi)的人群中有相當(dāng)大的比例對(duì)親代病毒已經(jīng)具有了預(yù)先存在的免疫力。Ad35在作為疫苗方面顯示出具有更大的應(yīng)用前景。攜帶Ad5和Ad35CSP的構(gòu)建體均已能夠得到，這樣便能夠?qū)镁唧w誘導(dǎo)CS免疫力的不同構(gòu)建體的兩種順序異源腺病毒免疫接種進(jìn)行評(píng)價(jià)。
樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，而Ad5和Ad35兩者均既靶向人類DC又靶向恒河猴DC這一事實(shí)是使得它們成為出色的疫苗載體的多種生物學(xué)因素之一。不過(guò)，僅Ad5有效感染鼠科DC；Ad35僅可靠地感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物的DC。因此，盡管有關(guān)Ad35構(gòu)建體的基本效力的問(wèn)題能夠在小動(dòng)物模型中找到答案，但有關(guān)Ad35的真實(shí)的免疫原性只能在非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物中進(jìn)行研究。
本發(fā)明人決定檢測(cè)RTS，S與含有CS基因的腺病毒載體組成的初始-加強(qiáng)免疫組合，以確定其抗瘧疾細(xì)胞和/或體液應(yīng)答是否較單獨(dú)應(yīng)用RTS，S而言是一種提高。此外，對(duì)兩劑腺病毒疫苗單獨(dú)使用的療法進(jìn)行了優(yōu)化。
實(shí)施例使用重組腺病毒載體和純化的佐劑化蛋白質(zhì)對(duì)恒河猴進(jìn)行異源初始/加強(qiáng)免疫接種實(shí)驗(yàn)的目的是評(píng)價(jià)RTS，S隨后Ad35，以及Ad35隨后RTS，S，與標(biāo)準(zhǔn)的3劑RTS，S免疫接種療法和標(biāo)準(zhǔn)的2劑Ad35療法進(jìn)行直接對(duì)比。次要目的是優(yōu)化所述的2劑腺病毒療法。研究了將這些構(gòu)建體進(jìn)行組合的幾種不同療法的過(guò)程中以及隨后的血清學(xué)和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
恒河猴(Macaca mulatta)是研究人類免疫應(yīng)答的出色的模型，原因在于其與人類在系統(tǒng)發(fā)生上關(guān)系密切。特別仔細(xì)觀察了MHC II類等位基因；共有等位基因的產(chǎn)生估計(jì)在兩千五百萬(wàn)年前，早于人和恒河猴達(dá)到物種形成。因此，在將抗原呈遞給Th細(xì)胞時(shí)使用的是相似的表位，這極大地增強(qiáng)了該模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。更重要的是以往已經(jīng)證實(shí)恒河猴模型在針對(duì)瘧疾抗原和HIV的人類免疫原性應(yīng)答方面均具有很高的預(yù)測(cè)性，HIV是另一種因免疫應(yīng)答的復(fù)雜性而妨礙疫苗開(kāi)發(fā)的人類疾病。
已經(jīng)使用小鼠瘧疾約氏瘧原蟲(chóng)的腺病毒CS構(gòu)建體在小鼠中進(jìn)行了初步的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其具有出色的免疫原性和保護(hù)效力。不過(guò)，在尋求開(kāi)發(fā)抗惡性瘧疾疫苗的過(guò)程中長(zhǎng)期以來(lái)一直無(wú)法成功地自小鼠瘧疾模型的結(jié)果直接推斷出在人類的情況，這一點(diǎn)要求在非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物模型中進(jìn)行過(guò)渡實(shí)驗(yàn)。恒河猴代表了最佳的候選物種，原因在于這些疫苗在這一物種中有廣泛深入的已有數(shù)據(jù)庫(kù)，在于其與人類在系統(tǒng)發(fā)生上的近親關(guān)系，在于其大小允許取得足量的血液樣品以保證對(duì)免疫應(yīng)答進(jìn)行充分的分析，還在于已有的試劑和方法都已經(jīng)非常適合這一物種且因此不需要輔助的方案以及多年的摸索。此外，腺病毒35構(gòu)建體只有在非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物中才能進(jìn)行合適的測(cè)試，因?yàn)檫@種病毒不能有效侵入其他哺乳動(dòng)物的樹(shù)突狀細(xì)胞。
有關(guān)構(gòu)建和產(chǎn)生用于本實(shí)驗(yàn)研究的攜帶惡性瘧原蟲(chóng)CS編碼基因(Ad5CS和Ad35CS)的重組復(fù)制缺陷型腺病毒，在WO 2004/055187(克隆02-659；見(jiàn)其圖2)的實(shí)施例中已經(jīng)進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。簡(jiǎn)言之，腺病毒載體包含編碼CS蛋白的異源基因，所述CS蛋白的氨基酸序列類似于NF54株3D7克隆的CS蛋白，并具有N端信號(hào)序列、27個(gè)NANP重復(fù)、一簇3個(gè)NVDP重復(fù)和一個(gè)單獨(dú)的NVDP重復(fù)、通用表位(Lockyeret al.1989；Zevering et al.1994；Nardin et al.2001)、以及缺失了最后14個(gè)氨基酸(位于C末端)，等等。RTS，S蛋白質(zhì)的不同之處在于RTS，S缺乏N端信號(hào)序列和大部分的重復(fù)區(qū)以及位于C端的GPI錨信號(hào)序列的絕大部分，后者也不存在于腺病毒構(gòu)建體中。
本實(shí)驗(yàn)對(duì)為了優(yōu)化RTS，S與攜帶Ad5和Ad35CS的構(gòu)建體(Ad5CS和Ad35CS)的初始-加強(qiáng)免疫策略、以及為了優(yōu)化Ad5CS和Ad35CS單獨(dú)的使用策略而進(jìn)行的各種組合和時(shí)程策略進(jìn)行了隨機(jī)化、盲化的安全性和免疫原性研究。作為與新策略進(jìn)行對(duì)比的對(duì)象，以往的最佳療法是肌肉注射3劑50μg的RTS，S和佐劑，分別在第0、1和3個(gè)月注射。這是組1，即陽(yáng)性對(duì)照組。表1A概括了所有的組。在所有的情況中，佐劑均是50μg的3D-MPL、50μg的QS21，與含有膽固醇的脂質(zhì)體存在于一配制品中，參見(jiàn)WO 96/33739。
組2在第0和1個(gè)月接受2劑RTS，S/佐劑，隨后在第3個(gè)月接受1劑Ad35CS。組3在第0個(gè)月接受1劑Ad35CS，隨后在第1和3個(gè)月接受2劑RTS，S/佐劑。
組4、5和6僅接受腺病毒構(gòu)建體。以往在不同疾病中使用2劑腺病毒5構(gòu)建體的經(jīng)驗(yàn)提示，當(dāng)免疫接種之間的間隔是至少6個(gè)月時(shí)，可得到最佳的血清學(xué)和細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于必須在人體或者非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物中評(píng)價(jià)Ad35構(gòu)建體，對(duì)該載體而言，兩劑之間的最佳時(shí)間還未確定。因此，組4在第0和3個(gè)月接受2劑Ad35CS(用于蛋白質(zhì)組的直接對(duì)照)，而組5在第0和6個(gè)月接受2劑。為了評(píng)價(jià)是否2劑相同的腺病毒構(gòu)建體的效果不如對(duì)CS蛋白進(jìn)行改變的構(gòu)建體，將組5與組6進(jìn)行比較，組6在第0和6個(gè)月接受Ad5CS，隨后是Ad35CS。
最后，對(duì)照組7在第0和3個(gè)月接受2劑空白(無(wú)瘧疾基因插入物)Ad35，作為評(píng)價(jià)免疫原性的免疫接種對(duì)照組。
將注射部位剃毛并清楚地標(biāo)記以便于觀察疫苗的反應(yīng)原性。此外，在注射后24、48、72小時(shí)和第7和14天，給動(dòng)物施用鎮(zhèn)靜劑并直接檢查注射部位是否有硬化、腫脹、發(fā)熱、發(fā)紅或者其他異常等表現(xiàn)。盡管預(yù)期不會(huì)出現(xiàn)全身性毒性表現(xiàn)，但仍然在上述時(shí)間點(diǎn)給動(dòng)物施用鎮(zhèn)靜劑并檢查淋巴結(jié)病變、蜂窩組織炎、化膿、關(guān)節(jié)炎、食欲減退以及體重下降，并監(jiān)測(cè)其血液學(xué)和臨床生化指標(biāo)的變化。
在每次注射后24、48、72小時(shí)和第7和14天取血進(jìn)行全血計(jì)數(shù)(CBC)和一組臨床生化分析，其包括(但不必限于)確定BUN、肌酐、AST、ALT、GGT、和CK。
為了確定排泄物中沒(méi)有非復(fù)制型載體，在每次注射腺病毒的第0至10天每日收集排泄物樣品并保存于-70℃，用于隨后檢測(cè)腺病毒。
在每次注射后的1、2和4周以及至少其后每月一次收集1-3ml血清，用于通過(guò)ELISA確定針對(duì)CS R32(用于對(duì)CS蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化ELISA分析所使用的CS蛋白的重復(fù)區(qū)，見(jiàn)下文)的抗體應(yīng)答的性質(zhì)和程度。血清樣品存放于-70℃直至使用，在臨近實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行批處理以盡量縮小內(nèi)部分析可變性。收集的血清的量要足夠，以便對(duì)于每次腺病毒注射可在第0、1、7和14天以及其后每4周使用0.5-1.0ml血清用于確定抗腺病毒抗體的滴度。在首次免疫接種之前、第二次免疫接種之后4周(如果量的要求允許)、第三次免疫接種之后4周、以及第三次免疫接種6個(gè)月之后收集大量(20-40ml)的EDTA或者肝素抗凝血用于采集細(xì)胞。采用密度離心分離的標(biāo)準(zhǔn)方法自這些樣品中濃縮外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。盡管不同動(dòng)物個(gè)體的細(xì)胞產(chǎn)率可明顯不同，但總體而言樣品量越大，采集的細(xì)胞的數(shù)量越大。由于無(wú)法預(yù)測(cè)確切的細(xì)胞回收率，因此優(yōu)選地盡可能取得更大的樣品，這樣便得到了足夠的細(xì)胞，以便進(jìn)行重復(fù)測(cè)定以滿足統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的有效性。將細(xì)胞冷凍以便在以后的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行批處理并由此提高質(zhì)量控制。將細(xì)胞在含有10％DMSO的自體血清中進(jìn)行冷凍，采用控制降溫速度技術(shù)，并在蒸氣相液氮中存放至少1周后使用。
在初始免疫之后，但在加強(qiáng)免疫之前，自那些CBC數(shù)據(jù)提示其可能耐受良好的較大的動(dòng)物收集額外的樣品以便采集細(xì)胞。由于在第8周前，接受2劑RTS，S/佐劑的猴子為14只(兩組)，接受單劑Ad35CS的猴子為14只，因此預(yù)期至少對(duì)一半動(dòng)物進(jìn)行采樣并由此保持統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著性。注射后不超過(guò)4周就會(huì)有細(xì)胞采集物。由于僅接受腺病毒構(gòu)建體的組僅接受2次注射，且因此與接受3次注射的猴子相比其采血計(jì)劃并不苛刻，因此在兩次注射中間進(jìn)行細(xì)胞收集應(yīng)該不會(huì)造成任何困難。
細(xì)胞免疫應(yīng)答分析包括用于對(duì)抗原特異性的產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞進(jìn)行定量的短期ELISPOT測(cè)定。對(duì)經(jīng)抗原刺激的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析不能確定在ELISPOT分析中所采集的數(shù)據(jù)，但提供了與發(fā)生應(yīng)答的抗原特異性細(xì)胞的表型有關(guān)的額外信息。因此，還通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞儀研究了抗原特異性CD8+的分泌IFN-γ的亞群。
進(jìn)行的其他的分析包括針對(duì)其他細(xì)胞因子的大批ELISPOT分析、其他細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)染色T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、定量抗原特異性T細(xì)胞亞群細(xì)胞因子產(chǎn)生的其他基于流式細(xì)胞儀的分析、以及用于與其他方法相印證的定量RT-PCR。
將猴子分成年齡、性別、體重和地理來(lái)源均勻匹配的組，然后將各組進(jìn)行隨機(jī)化。所有臨床評(píng)估和安全性終點(diǎn)的確定均是在不了解猴子的分組情況的條件下確定的。類似地，所有免疫學(xué)測(cè)定均是在不了解各個(gè)樣品屬于哪些組的情況下進(jìn)行的。這一盲化原則的例外是相對(duì)于0、1、和3個(gè)月的時(shí)間表，有些動(dòng)物按照0和6個(gè)月的時(shí)間表還是接受免疫接種；不過(guò)，就給予的具體注射而言，仍然維持盲化原則。
基于已有的、來(lái)自類似的但并不明顯相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每個(gè)測(cè)試組7只動(dòng)物(對(duì)照組4只)是理想的，這可使得組的規(guī)模最小但仍然能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到組間的差異。
使用標(biāo)準(zhǔn)的分析法對(duì)ELISA分析結(jié)果的幾何平均值進(jìn)行參數(shù)比較，例如Student t-檢驗(yàn)，假定等方差和雙側(cè)，和ANOVA。ELISPOT測(cè)定結(jié)果表示為每200,000個(gè)細(xì)胞的點(diǎn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行類似的處理并使用非參數(shù)分析例如Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。需要進(jìn)行組間比較時(shí)，使用Student t-檢驗(yàn)，利用原始數(shù)據(jù)或者對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)，確定任何兩組之間的差異。
注射之前剪除毛發(fā)并以70％的酒精擦拭清潔，以不退色的墨水在皮膚上畫(huà)出2.5-3cm的圓圈，以便定位注射部位用于隨后進(jìn)行觸診和評(píng)估反應(yīng)原性。在即將進(jìn)入猴舍前將RTS，S的注射劑與佐劑混合。注射劑的終體積是0.5ml，并通過(guò)25-29號(hào)針頭輸送至前肢的肌肉組織內(nèi)。如前所述(WO 2004/055187)在緩沖液中制備腺病毒構(gòu)建體并以0.5ml的終體積肌肉內(nèi)施用至同樣的部位。
無(wú)論對(duì)于血清還是細(xì)胞，最初的生物樣品是血液。表1B給出了采血時(shí)間表。監(jiān)測(cè)動(dòng)物的血液學(xué)狀態(tài)，其提示個(gè)體維持重復(fù)取樣的能力或者表明需要減少原計(jì)劃的取樣時(shí)間表。每次取血均以Coulter自動(dòng)化血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(需要＜50μl的不凝集血液)進(jìn)行全血計(jì)數(shù)(CBC)。采用生產(chǎn)商推薦的GLP樣指導(dǎo)進(jìn)行保養(yǎng)和維護(hù)。密切隨診血細(xì)胞比容、血紅蛋白、平均血球體積(MCV)、紅細(xì)胞(RBC)計(jì)數(shù)、以及網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比，以確保動(dòng)物不出現(xiàn)貧血。
使用20-24號(hào)針和注射器或者真空管自股靜脈、隱靜脈或者頭靜脈采集靜脈血。通常，對(duì)于抽取少于10ml的血液而言，隱靜脈或者頭靜脈是優(yōu)選的，而在抽取10ml以上的體積時(shí)為避免溶血并縮短靜脈穿刺的時(shí)間則股靜脈是優(yōu)選的。
在免疫接種前、末次免疫接種后2周、以及末次免疫接種后3個(gè)月，自動(dòng)物收集外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。在這一方案中，采用密度離心的標(biāo)準(zhǔn)方法分離PBMC，并凍存于45％自體血清(45％的鹽水和10％DMSO)。簡(jiǎn)言之，將全血平鋪于Lymphoprep(Axis-Shield，Oslo，Norway)ficoll-hypaque細(xì)胞分離介質(zhì)上，并在650g離心20分鐘。取出細(xì)胞層并以dPBS(Bio Whittaker，Walkersville，MD)洗滌2次，每次400g洗滌15分鐘。使用Coulter ACT*10血球計(jì)計(jì)數(shù)活細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀以1×107/ml重懸于50％dPBS、50％鹽水中。滴加DMSO至終體積的10％。將細(xì)胞冷凍于0.55ml的小瓶中，每瓶準(zhǔn)確為5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，置于-70℃冰箱的控制降溫isoropanol溶液中過(guò)夜，并存在于液氮蒸氣相備用。
末次疫苗接種后，在以全抗原和C端和N端特異性混合肽刺激后(詳見(jiàn)下文)，采用ELISpot分析來(lái)鑒定來(lái)自不同猴子的血液樣品中的分泌干擾素γ(IFN-γ)的T細(xì)胞。結(jié)果示于圖1(末次疫苗接種后2周)和圖2(末次疫苗接種后3個(gè)月)，并以每百萬(wàn)細(xì)胞的中位數(shù)點(diǎn)形成單位(median spot forming unit(SFU))分別表示于表2和表4；在對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)上使用方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。比較了所有的組。在檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的情況下，可對(duì)組-組比較進(jìn)行post-hoc分析(結(jié)果未顯示)。
為比較不同處理策略之間的ELISpot結(jié)果，計(jì)算出了以Ad35作為初始處理的策略的滴度幾何平均值的比率。在這些比率中，將單獨(dú)使用RTS，S(第0，2，3個(gè)月)所得到的滴度幾何平均值作為參照處理(圖5和圖6，以及表10)。類似地，計(jì)算出了以Ad35作為加強(qiáng)處理的策略的比率(圖7和圖8，以及表11)。
對(duì)N末端特異性刺激T細(xì)胞ELISpots的結(jié)果進(jìn)行了類似的分析。結(jié)果分別示于圖9和圖10以及分別表12和14。最后，計(jì)算出結(jié)果并分別顯示于圖11(Ad35初始免疫策略)和圖12(Ad35加強(qiáng)免疫策略)以及表16和表17。
采用標(biāo)準(zhǔn)方法，在底部裝有PVDF的MultiScreen-IP ELISpot板(Millipore，Bedford，MA)中，以解凍的凍存PBMC進(jìn)行了ELISpots。嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作，直至在第二天取出細(xì)胞用于最后的斑點(diǎn)顯色(spotdevelopment)。
使用的培養(yǎng)基自RPMI-1640(Bio Whittaker，Walkersvile，MD)新鮮制備完全培養(yǎng)基(cRPMI)，加入了1∶100青霉素/鏈霉素、1∶100L-谷氨酰胺、1∶200NaHCO3(Sigma，St.Louis，MO)、1∶100非必需氨基酸、1∶100丙酮酸鹽、和1∶300 2-ME(Gibco)。使用的該批次的胎牛血清(FCS，HyClone，Logan，UT)以前已經(jīng)通過(guò)非特異性增殖測(cè)定進(jìn)行分析，可對(duì)猴的細(xì)胞的生長(zhǎng)提供良好的支持但幾乎不產(chǎn)生刺激背景，cRPMI-10為加入了10％，cRPMI-20為加入了20％，等等。培養(yǎng)基+(M+)額外補(bǔ)充了1∶500的抗猴CD28和抗猴CD49D抗體(BD Pharmingen，San Jose，CA)。
新鮮制備以下刺激物，其濃度為在未添加血清的M+中所欲使用的終濃度的2倍Con A伴刀豆球蛋白A(Sigma)，2.5μg/ml(終濃度1.25μg/ml)，作為所有病毒的陽(yáng)性對(duì)照。
CS-C混合15-聚體多肽，具有11個(gè)氨基酸的重疊，覆蓋PfCS分子的C端部分(由GSK，Rixensart，Belgium提供)，各種肽的濃度2.5μg/ml(終濃度1.35μg/ml)。
CS-N類似的混合15聚體肽，具有11個(gè)氨基酸的重疊，覆蓋PfCS分子的N末端。
RTS，S純化的全蛋白復(fù)合物RTS，S抗原，適合于細(xì)胞培養(yǎng)(GSK)，濃度為2μg/ml(終濃度1μg/ml)。
HEF純化的乙型肝炎表面抗原(HbS)全蛋白(RTS，S的“S”組分)，同樣適合細(xì)胞培養(yǎng)(GSK)，濃度23.2μg/ml(終濃度11.6μg/ml)。
HbS-P混合HbS 15聚體肽(GSK)，各種肽的濃度為2.5μg/ml(終濃度1.25μg/ml)。
陰性對(duì)照為無(wú)進(jìn)一步補(bǔ)充的M+。
如下制備板。以每孔50μl的1∶100稀釋于無(wú)菌dPBS的初級(jí)抗猴IFN-γ單克隆抗體(UcyTech#21-43-09，Utrecht，the Netherlands)包被板，并在塑料袋中于4℃溫育5-6小時(shí)。使用前1小時(shí)去除包被抗體，并在37℃，5％CO2濕度控制型細(xì)胞培養(yǎng)箱中以cRPMI-10對(duì)板進(jìn)行封閉。臨用前去除封閉培養(yǎng)基。
解凍凍存的PBMC將冷凍的小瓶在溫水(37-40℃)中旋轉(zhuǎn)直至幾乎不再融化，將0.55ml內(nèi)容物立即轉(zhuǎn)移至8ml RPMI-20中。將細(xì)胞在350g洗滌13分鐘，將沉淀物仔細(xì)地重懸于2.0ml cRPMI-20。取無(wú)菌的40μl樣品以活細(xì)胞數(shù)量，必要時(shí)調(diào)整體積以產(chǎn)生2×106細(xì)胞/ml的單細(xì)胞懸液。
預(yù)刺激將等體積的cRPMI-20的細(xì)胞懸液與M+中的刺激物混合于聚丙烯細(xì)胞培養(yǎng)管中產(chǎn)生具有所需終濃度的各種試劑。將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中放置至少5小時(shí)，蓋子擰松并保持傾斜狀態(tài)依賴于氣體交換。
終刺激溫育5-6小時(shí)后，將細(xì)胞在400g離心10分鐘，棄上清。然后將細(xì)胞立即重懸于半量的cRPMI-20和半量的刺激物中。再將它們放回培養(yǎng)箱放置10-20分鐘以使得pH達(dá)到穩(wěn)定。然后輕柔地混合細(xì)胞并小心地200μl(200,000個(gè)細(xì)胞)移至已經(jīng)封閉的空板的合適的孔中。所有步驟都需要小心以保證孔不會(huì)干燥。將板靜置溫育過(guò)夜(＞16小時(shí))。
斑點(diǎn)顯色(Spot development)將1∶100稀釋于dPBS(含2％FCS)中的多克隆抗猴IFN-γ抗體(UCyTech)作為第二抗體。將細(xì)胞和培養(yǎng)基自板中輕輕移去；用dPBS-0.5％Tween 20(Sigma)將孔洗滌8次，加入50μl稀釋的第二抗體。將板置于塑料袋中在搖床上室溫溫育3小時(shí)。再次以dPBS-0.5％Tween 20洗滌板8次，并加入50μl/孔1∶1000稀釋的鏈霉抗生物素堿性磷酸酶綴合物(Southern Biotech#7100-04，Birmingham，AL)。然后將板置于塑料袋中在搖床上再室溫溫育2小時(shí)。最后，如前面一樣將板洗滌8次，隨后以蒸餾水洗滌1次，加入100μl/孔的發(fā)色NBT-BCIP底物(Pierce Biotech，Rockford，IL)。顯色10-20分鐘，直至背景變?yōu)楹谏?。然后將板?00μl蒸餾水沖洗至少兩次，空氣中干燥過(guò)夜后讀取數(shù)值。
讀板使用AID ELISpot Reader v3.1.1，在AID ELHR01 Elispot讀取儀上讀板。對(duì)所有孔進(jìn)行肉眼檢查，手工排除不合適的點(diǎn)(有細(xì)纖維或者其他雜質(zhì))。數(shù)據(jù)保存于Excel表中。取雙份或者三份孔進(jìn)行平均，將該數(shù)值乘以5以得到最后的原始數(shù)據(jù)，單位是點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
質(zhì)量控制凍融后的活細(xì)胞回收率平均值超過(guò)95％。如果培養(yǎng)基對(duì)照孔的平均值大于20點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，或者如果ConA孔小于500點(diǎn)/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，則重復(fù)進(jìn)行操作。此外，CD4+和CD8+細(xì)胞的總體活力經(jīng)流式細(xì)胞儀以7-AAD染料排斥法和表面染色法評(píng)估，均超過(guò)90％，否則重復(fù)進(jìn)行操作(數(shù)據(jù)未顯示)。
表1A.在恒河猴中進(jìn)行的初始/加強(qiáng)免疫療法的實(shí)驗(yàn)性療法，使用基于血清型5和35的重組腺病毒載體(其包含編碼惡性瘧原蟲(chóng)CS蛋白的基因)和作為蛋白質(zhì)抗原組分的佐劑化的RTS，S。

表1B.采血時(shí)間表。采集CBC和細(xì)胞需要全血；化學(xué)分析和ELISA需要血清。估計(jì)1ml血清代表2ml全血。僅給出了全血的量。范圍表示可能需要自猴子采集更多的樣品。CBC/化學(xué)分析欄中的“0.5”表示在那些天中僅進(jìn)行CBC。*表示不是所有的猴子都在該時(shí)間點(diǎn)取血。


在下文的表中，將RTS，S簡(jiǎn)稱為″RTS″。
表2.加強(qiáng)后2周的PfCS C端特異性T細(xì)胞免疫IFN-γELISpot(SFU/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)的中位數(shù)和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了不同的初始/加強(qiáng)免疫療法(左側(cè))。

表3.Student T-檢驗(yàn)。如表2所示的加強(qiáng)(末次疫苗接種)后2周的PfCS C端特異性IFN-γELIspot比較的p值。

表4.加強(qiáng)后3個(gè)月的C端特異性IFN-γT細(xì)胞免疫ELISpot(SFU/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)的中位數(shù)和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了初始/加強(qiáng)免疫療法(左側(cè))。

表5.Student T-檢驗(yàn)。如表4所示的加強(qiáng)(末次疫苗接種)后3個(gè)月ELIspot比較的p值。

表6.末次加強(qiáng)后2周的B細(xì)胞免疫(抗重復(fù)片段的抗體滴度)ELISA的中位數(shù)和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了不同的初始/加強(qiáng)免疫療法(左側(cè))。

表7.Student T-檢驗(yàn)。如表6所示的末次加強(qiáng)(末次疫苗接種)后2周抗體比較的p值。

表8.加強(qiáng)后3個(gè)月的與惡性瘧原蟲(chóng)CS有關(guān)的B細(xì)胞免疫(抗體滴度)ELISA(SFU)的中位數(shù)和幾何平均值和ANOVA比較。給出了不同的初始/加強(qiáng)免疫療法(左側(cè))。

表9.Student T-檢驗(yàn)。如表8所示的加強(qiáng)(末次疫苗接種)后3個(gè)月抗體比較的p值。

表10.幾何平均值的比率*。T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答。Ad35用作初始疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照表11.幾何平均值的比率*。T細(xì)胞應(yīng)答和B細(xì)胞應(yīng)答。Ad35用作加強(qiáng)疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照表12.末次疫苗接種后2周的PfCS N端特異性IFN-γT細(xì)胞免疫ELISpot(SFU/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)的中位數(shù)和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了初始/加強(qiáng)免疫療法(左側(cè))。

表13.Student T-檢驗(yàn)。如表12所示的末次加強(qiáng)(末次疫苗接種)后2周的ELISpot比較的p值。

表14.加強(qiáng)后3個(gè)月的PfCS N端特異性IFN-γT細(xì)胞免疫ELISpot(SFU/百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)的中位數(shù)和幾何平均值以及ANOVA比較。給出了不同初始/加強(qiáng)免疫療法(左側(cè))。

表15.Student T-檢驗(yàn)。如表14所示的加強(qiáng)(末次疫苗接種)后3個(gè)月的ELISpot比較的p值。

表16.抗PfCS的N末端的T細(xì)胞應(yīng)答的幾何平均值的比率*。Ad35CS用作初始疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照表17.抗CS的N末端的T細(xì)胞應(yīng)答的幾何平均值的比率*。Ad35CS用作加強(qiáng)疫苗。

*以RTS，RTS，RTS作為參照參考文獻(xiàn) O et al.(2001)Complete，long-lasting protection againstmalaria of mice primed and boosted with two distinct viral vectors expressingthe same plasmodial antigen.Proc Natl Acad Sci USA 9811491-11496Caspers P et al.(1989)The circumsporozoite protein gene from NF54，aPlasmodium falciparum isolate used in malaria vaccine trials.Mol BiochemParasitol 35185-189Clyde DF et al.(1973)Immunization of men against sporozoite-inducedfalciparum malaria.Am J Med Sci 266169-177De Jong JC et al.(1999)Adenoviruses from human immunodeficiency virus-infected individuals，including two strains that represent new candidateserotypes Ad50 and Ad51 of species B1 and D，respectively.J Clin Microbiol373940-3945Doolan DL et al.(1998)DNA vaccination as an approach to malaria controlcurrent status and strategies.Curr Topic Microbiol Immunol 22637-56Estcourt MJ et al.(2002)Prime-boost immunization generates a highfrequency，high-avidity CD8+cytotoxic T lymphocyte population.IntImmunol 1431-37Gandon S et al.(2001)Imperfect vaccines and the evolution of pathogenvirulence.Nature 414751-756Gordon DM et al.(1995)Safety，immunogenicity，and efficacy of arecombinantly produced Plasmodinm falciparum circumsporozoite protein-hepatitis B surface antigen subunit vaccine.J Infect Dis 1711576-1585Hoffmann SL and Doolan DL.(2000)Malaria vaccines-targeting infectedhepatocytes.Nature Med 61218-1219Horn NA et al.(1995)Cancer Gene Therapy using plasmid DNApurificationofDNA for human clinical trials.Human Gene Therapy 6565-573
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權(quán)利要求
1.一種試劑盒，其包含-存在于藥用可接受的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，所述腺病毒包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的環(huán)子孢子(CS)抗原的異源核酸；和-佐劑化的蛋白質(zhì)抗原；其中所述重組腺病毒選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50。
2.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述重組腺病毒是人類腺病毒血清型。
3.權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS蛋白或其免疫原性片段。
4.權(quán)利要求3的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含形式為與乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。
5.權(quán)利要求4的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含RTS，S。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)抗原以包含QS21和3D-MPL的佐劑進(jìn)行佐劑化。
7.權(quán)利要求6的試劑盒，其中所述佐劑還包含含有膽固醇的脂質(zhì)體。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述引起瘧疾的寄生蟲(chóng)是惡性瘧原蟲(chóng)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述異源核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以提高所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人類中的產(chǎn)生。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述重組腺病毒與佐劑存在于一混合物中。
11.一種試劑盒，其包含-存在于藥用可接受的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒，所述腺病毒包含編碼經(jīng)密碼子優(yōu)化的來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)的環(huán)子孢子(CS)抗原的異源核酸；和-包含RTS，S的佐劑化的蛋白質(zhì)抗原。
12.權(quán)利要求11的試劑盒，其中所述蛋白質(zhì)抗原以包含QS21和3D-MPL的佐劑進(jìn)行佐劑化。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述佐劑還包含含有膽固醇的脂質(zhì)體。
14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述復(fù)制缺陷型重組腺病毒是初始免疫組合物，且所述佐劑化的蛋白質(zhì)抗原是加強(qiáng)免疫組合物。
15.包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS抗原的異源核酸的復(fù)制缺陷型重組腺病毒以及佐劑化的蛋白質(zhì)抗原在制備用于治療或預(yù)防瘧疾的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒或人類腺病毒血清型11，24，26，34，35，48，49或50。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述復(fù)制缺陷型重組腺病毒用作初始免疫組合物，且所述佐劑化的蛋白質(zhì)抗原用作加強(qiáng)免疫組合物。
17.權(quán)利要求15或16的用途，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS蛋白或其免疫原性片段。
18.權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)的用途，其中所述引起瘧疾的寄生蟲(chóng)是惡性瘧原蟲(chóng)。
19.權(quán)利要求15-18中任一項(xiàng)的用途，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含形式為與乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述佐劑化的蛋白質(zhì)抗原包含RTS，S。
21.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的用途，其中所述蛋白質(zhì)抗原以QS21和3D-MPL進(jìn)行佐劑化。
22.權(quán)利要求15-21中任一項(xiàng)的用途，其中所述異源核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以提高所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人類中的產(chǎn)生。
23.對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種的方法，包括以下步驟-以存在于藥用可接受的賦形劑中的復(fù)制缺陷型重組腺病毒對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行初始免疫，所述腺病毒包含編碼來(lái)自引起瘧疾的寄生蟲(chóng)的CS抗原的異源核酸；和-以佐劑化的蛋白質(zhì)抗原對(duì)所述哺乳動(dòng)物進(jìn)行加強(qiáng)免疫，所述蛋白質(zhì)抗原包含形式為與乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)形成脂蛋白顆粒的、與HBsAg融合的CS蛋白或其免疫原性片段的雜合蛋白。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述蛋白質(zhì)抗原包含RTS，S。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所述重組腺病毒是人類腺病毒、猴腺病毒、犬腺病毒或牛腺病毒。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述重組腺病毒是選自人類腺病毒血清型11、24、26、34、35、48、49和50中的人類腺病毒。
27.權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)的方法，其中所述蛋白質(zhì)抗原以QS21和3D-MPL進(jìn)行佐劑化。
28.權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述引起瘧疾的寄生蟲(chóng)是惡性瘧原蟲(chóng)。
29.權(quán)利要求23-28中任一項(xiàng)的方法，其中所述異源核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以提高所編碼的蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物中、優(yōu)選地在人類中的產(chǎn)生。
30.使用權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的試劑盒對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種的方法。
31.使用權(quán)利要求14的試劑盒對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行抗瘧疾感染免疫接種的方法，其中所述加強(qiáng)免疫之后再進(jìn)行一或多次后續(xù)加強(qiáng)免疫。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的疫苗療法，其中實(shí)施的特異性初始/加強(qiáng)免疫療法使用了攜帶編碼惡性瘧原蟲(chóng)抗原的核酸的中和程度低的重組腺病毒載體和純化的重組蛋白質(zhì)疫苗例如RTS，S，以及合適的佐劑。
文檔編號(hào)A61K39/015GK101068568SQ200580034802
公開(kāi)日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月14日
發(fā)明者馬里亞·格拉西亞·帕烏, 杰普·古德斯米特, 約瑟夫·D·科恩, 帕特里斯·M·杜波依斯, V·安·斯圖爾特, 唐納德·海普納爾 申請(qǐng)人:克魯塞爾荷蘭公司, 葛蘭素史克生物制品股份公司, 以沃爾特里德軍事研究所的名義，由陸軍部部長(zhǎng)代表的美國(guó)政府