專利名稱：：用于瘧疾的疫苗的制作方法用于癡疾的疫苗本發(fā)明涉及新的雜合/融合蛋白，用于制備和純化其的方法，它在藥物中的用途，特別是在預(yù)防癡疾感染，例如由間日癡原蟲(尸/cwwo^wwVZVOX)(尸WVOX))引起的那些感染中的用途，包含該蛋白或抗該蛋白的抗體例如單克隆或多克隆抗體的組合物/疫苗和其用途，特別是在治療中的用途。本發(fā)明還涉及所述雜合/融合蛋白的脂蛋白顆粒和包含其的制劑/疫苗及其用途。瘧疾是一種世界主要健康問題，每年超過2到4百萬的人死于該疾病。這種疾病最流行的形式之一是由原生動物寄生蟲間日瘧原蟲(尸.Wvax)引起的，其在熱帶和亞熱帶區(qū)域發(fā)現(xiàn)。令人感興趣的是該寄生蟲可在15。C的溫度下完成它的蚊子周期，這允許疾病在溫和的氣候中傳播。間日癡原蟲的生活周期是復(fù)雜的，為完成需要兩種宿主，人和蚊子。人的感染起始于子孢子引入被感染的蚊子的唾液。子孢子遷移到肝并且在那里感染肝細(xì)胞，在那里它們通過紅細(xì)胞外細(xì)胞內(nèi)階段分化為裂殖子階段，其感染紅血細(xì)胞(RBC)以起始在無性血階段的循環(huán)復(fù)制。這一循環(huán)通過RBC中的大量裂殖子分化為有性階段配子母細(xì)胞而完成，其被蚊子攝取，在那里它們發(fā)育經(jīng)過中腸中的一系列階段以產(chǎn)生遷移入唾液腺的子孢子。由于由間日疾原蟲引起的疾病很少是致命的的事實，預(yù)防和治療疾疾的努力集中于由惡性疾原蟲(尸/aymoJ/wm/a/c/parwm)(尸./a/c^7"rwm))引起的更致命形式的疾病。盡管由間日癡原蟲引起的疾病通常不導(dǎo)致患者的死亡，由于病例的數(shù)量，其看起來是逐漸增長的，對于患者生命質(zhì)量的顯著影響，導(dǎo)致貧血癥和死亡的疾病的嚴(yán)重發(fā)生的漸增的報道，和經(jīng)濟影響，仍然需要用于該疾病的有效的接種。間日瘧原蟲的特征是一些抹能夠通過在進入外周循環(huán)顯示出臨床癥狀之前保持潛伏在肝中導(dǎo)致延遲的感染。因此個體，例如當(dāng)旅游經(jīng)過受感染區(qū)域，可能被感染并且?guī)讉€月內(nèi)不顯示出癥狀。這具有導(dǎo)致疾病的擴散的潛能，并且由于此原因旅行到受感染區(qū)域的人在旅行到7當(dāng)寄生蟲經(jīng)歷pre-erthrocyticshizogony時，間日疾原蟲疾疾感染保持潛伏在肝中。如果該寄生蟲控制在此階段，在它逃離肝之前，在患者中沒有觀察到疾病的臨床癥狀。間日疾原蟲的子孢子階段已被鑒定為癡疾疫苗的潛在靶標(biāo)。用失活的(照射的)子孢子接種已經(jīng)顯示出誘導(dǎo)針對試驗的人癥疾的保護(Am.J,Trop.Med.Hyg24:297-402,1975)。然而，利用照射的子孢可能的r、、^、。、子孢子的主要表面蛋白稱作環(huán)子孢子蛋白(CS蛋白)。它被認(rèn)為在它從蚊子接種的起始位點傳代到循環(huán)的過程中涉及子孢子的運動和侵入，在那里它遷移到肝。瘧原蟲種的CS蛋白特征為中央重復(fù)域(重復(fù)區(qū)域)，側(cè)翼連接非重復(fù)氨基片段(N-末端)和羧基片段(C-末端)。間日瘧原蟲的中央?yún)^(qū)域由幾段通常為9個串聯(lián)氨基酸的重復(fù)單位組成。在某些亞洲林中，在中央重復(fù)區(qū)域之后，存在大約12個氨基酸的另外的序列(見SEQIDNo:11)。后者的功能是未知的。然而，一些人假定所述氨基酸可能與疾病臨床癥狀的延遲出現(xiàn)有關(guān)，盡管這還沒有被研究。據(jù)認(rèn)為N-末端特征為稱作區(qū)域I的5個氨基酸的序列(見SEQIDNo:1)。還認(rèn)為C-末端特征為包含稱作區(qū)域II的18個氨基酸的序列。后者包含細(xì)胞粘附基序，其在所有瘧疾CS蛋白中是高度保守的(見SEQIDNo:2)。幾個組已經(jīng)建議了基于環(huán)子孢子蛋白的亞單位疫苗。兩種這些疫苗已經(jīng)經(jīng)歷了臨床測試一個是合成肽，另一是重組蛋白(Ballou等，Lancet:i1277(1987)和Hemngton等,Nature328:257(1987))。這些疫苗在刺激抗-子孢子響應(yīng)中是成功的。但是，響應(yīng)的大小是令人失望的，一些疫苗根本不產(chǎn)生響應(yīng)。而且，缺少對接下來的感染的抗體水平的"加強"和體外淋巴細(xì)胞增殖測定的結(jié)果顯示了大多數(shù)這些自愿者的T-細(xì)胞不識別免疫顯性重復(fù)區(qū)域。然而，每個研究中一個接種的自愿者沒有發(fā)展出寄生蟲血癥。WO93/10152和WO98/05355描述了源自惡性癡原蟲的CS蛋白的疫苗，并且看起來利用本文所述方法對于抗惡性瘧原蟲的疫苗取得了一些進展，還可見Heppner等，2005,Vaccine23，2243-50。惡性瘧原蟲中的CS蛋白具有保守的中央重復(fù)區(qū)域。對比之下，對于間日瘧原蟲已知至少兩種形式的CS蛋白(稱作VK210或I型和VK247或II型)。這使得鑒定具有所有期望性質(zhì)例如免疫原性的CS蛋白的構(gòu)建體是更困難的，所述構(gòu)建體提供針對間日癡原蟲的一般保護而不論CS蛋白的特定類型，因為針對I型的中央重復(fù)區(qū)域的抗體不必然識別II型的對應(yīng)區(qū)域的表位，反之亦然。重組間日癡原蟲CS蛋白在1980-1990's有限成功地作為疫苗被表達和測試(Collins等，1989.Am.J.Trop.Med.Hyg.40，455-64)。已經(jīng)進行了利用交聯(lián)的一種或多種表位發(fā)展基于多抗原肽(MAP)的疫苗的一些工作(Nardelli和Tarn,1995,Pharm.Biotechnol.6,803-19)。本發(fā)明提供了用于癡疾疫苗的新的，改進的抗原，其據(jù)信產(chǎn)生體液應(yīng)答并且還有細(xì)胞免疫應(yīng)答?？乖?顆粒據(jù)信誘導(dǎo)抗I型和II型CS蛋白的抗體的產(chǎn)生?？乖?顆粒還可誘導(dǎo)T輔助細(xì)胞，例如Thl和/或Th2細(xì)胞。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了免疫原性雜合融合蛋白，其包含a.源自間日疾原蟲I型環(huán)子孢子蛋白的中央重復(fù)部分的至少一個重復(fù)單位，b.源自間日瘧原蟲II型環(huán)子孢子蛋白的中央重復(fù)部分的至少一個重復(fù)單位，和c.源自乙型肝炎病毒的表面抗原S。序列表SEQIDNo1N-末端中的I區(qū)(上述)SEQIDNo2來自C-末端中的II區(qū)的基序(上述)SEQIDNo3-9I型CS蛋白的不同單體SEQIDNo10來自II型CS蛋白的主要單體SEQIDNo11發(fā)現(xiàn)于亞洲株的另外的氨基酸SEGIDNo12雜合蛋白的核苷酸序列(為在大腸桿菌(E.Coli)中表達而最優(yōu)化)SEQIDNo13雜合蛋白CSV的氨基酸序列SEQIDNo14SEQIDNo:15SEQIDNo:SEQIDNo:SEQIDNo:酸序列SEQIDNo:SEGIDNo:SEQIDNo:161718192021雜合蛋白CSV的核苷酸序列(為在酵母中表達而最優(yōu)化)雜合融合蛋白CSV-S的核苷酸序列雜合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列RTS表達盒和預(yù)測的RTS,S蛋白的核苷雜合融合基因CSV-S的核苷酸序列(克隆入pHIL-D2整合性巴斯德畢赤酵母(尸ZC/2Z'(3/(XStO/^S)表達載體內(nèi))在巴斯德畢赤酵母中表達的雜合融合蛋白CSV-S的氨基酸序列圖12所示的是全長重組CSV-S蛋白和截短蛋白的序列比較附圖圖1顯示了在酵母抹釀酒酵母(S.cerevisiae)(具有組成型啟動子)中產(chǎn)生的本發(fā)明的雜合蛋白的多聚體脂蛋白顆粒的電子顯微照片。圖2本發(fā)明雜合蛋白和比較蛋白(凝膠的部分)的western印跡。圖2a本發(fā)明雜合蛋白和比較蛋白(圖2全部凝膠，其中圖2中的1,2和3道是圖2a中的1，2和8道)的western印跡。圖3用于將編碼CSV-S融合蛋白的序列導(dǎo)入酵母宿主細(xì)胞的pRIT15546重組載體的質(zhì)粒圖譜(游離型載體)。圖4用于形成期望的抗原與來自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白的GSK制備的pGFl-S2質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。在Smal位點之間克隆異源DNA序列(在切除12bpSmalDNA片段之后)產(chǎn)生與S基因的符合讀框的融合。圖5用于形成期望的抗原與來自乙型肝炎的S抗原的融合蛋白的Prit15607的質(zhì)粒圖譜。用Notl消化釋放了攜帶附加了HIS4選擇標(biāo)記的CSV-S表達盒的6.8kb的線性DNA片段，其用于插入酵母染色體。圖6顯示了在Y1840中表達的重組蛋白的western印跡。圖7顯示了在巴斯德畢赤酵母(一種"非常規(guī)"酵母，甲基營養(yǎng)酵母，其中重組表達被甲醇可誘導(dǎo)啟動子驅(qū)動)中產(chǎn)生的本發(fā)明的雜合蛋白的多聚體脂蛋白顆粒的電子顯微照片。CSV-S顆粒從可溶提取物(基于RTS,S純化方法)中純化并且進行電子顯微鏡法分析。用磷鴒酸陰性染色之后，顆粒顯現(xiàn)。大小為100nm。圖8pRIT15582的質(zhì)粒圖語。用Xhol消化釋放了攜帶附加了LEU2選擇標(biāo)記的CSV-S表達盒的8.5kb線性DNA片段，其用于插入酵母染色體。圖9用于整合CSV-S盒的線性XhoI片段的限制性圖譜。圖10在Yl835株中表達的重組蛋白的western印跡。A組用抗-S抗體顯示的WB裝載的樣品(100貼總蛋白/孔)1:Y1631(RTS,S生產(chǎn)抹，作為對比)2:Y18353:Y18354:Y1834B組用抗-CSV抗體顯示的WB裝載的樣品(100ng總蛋白/孔):1:Y1631(RTS，S生產(chǎn)株,作為對比)2:Y12953:Y18354:Y18345:nr(另一構(gòu)建體CSVS)6:nr(另一構(gòu)建體-僅僅S抗原)圖11在Y1835林中產(chǎn)生的CSV-S,S混合顆粒的電子顯微照片。CSV-S,S顆粒從可溶細(xì)胞提取物中純化(基于RTS,S純化方法)并且進行電子顯微鏡法分析。在用磷鎢酸陰性染色之后，顆粒顯現(xiàn)。大小為100nm。圖12顯示了重組全長CS蛋白和CS蛋白截短形式(CSVtr-S)的對比。本文的雜合蛋白指源自間日瘧原蟲I型和II型的蛋白。本文的雜合融合蛋白指融合于另一蛋白的源自間日癡原蟲I型和II型的蛋白或其片段。在一個方面，本發(fā)明的雜合融合蛋白包含源自間日瘧原蟲的CS蛋白(CSV)的雜合蛋白和來自乙型肝炎的表面抗原，通常是稱為S抗原的主要表面蛋白，例如源自adw血清型的S抗原。本發(fā)明的CSV源的抗原成分(即，雜合蛋白)通常融合于S蛋白的氨基末端。更特別地，CSV片段的C末端與所述S抗原的N末端融合。據(jù)信來自乙型肝炎的表面抗原的存在加強了雜合蛋白的cs蛋白部分的免疫原性，酸穩(wěn)定性，和/或輔助蛋白的可復(fù)制的生產(chǎn)。通常雜合蛋白還包含來自瘧原蟲例如間日瘧原蟲(I型或II型)的CS蛋白的N末端片段，例如包含I區(qū)如SEQIDNo.l所示氨基酸的片段。替代地，雜合蛋白可包含來自惡性疾原蟲CS蛋白的N-末端片段。在一個方面，雜合蛋白可包含來自惡性疾原蟲中央?yún)^(qū)域的一個或多個重復(fù)單位。例如，1，2,3,4,5,6，7,8,9或更多個重復(fù)單位。通常，雜合蛋白還將包含來自瘧原蟲例如間日疾原蟲(I或II型)的CS蛋白的C-末端片段，例如包含II區(qū)例如SEQIDNo:2所示的片段。替代地，雜合蛋白可包含來自惡性瘧原蟲cs蛋白的c-末端片段。雖然不希望被理論所束縛，據(jù)認(rèn)為N和C末端片段包括幾種T和B細(xì)力包表位。在重組蛋白中，通常非天然氨基酸在克隆程序中引入并且在最后的表達蛋白中觀察到。例如幾個如l,2,3,4或5個氨基酸可在蛋白的起始(N-末端)插入。如果4個氨基酸在蛋白的起始插入，它們可以例如是MMAP。另外地，或者替代地，1,2或3例如1個氨基酸可在大約氨基酸259，260，261或262插入蛋白體/中間。氨基酸插入可以是具有標(biāo)記符號P的氨基酸。在一個方面，利用的蛋白不包括通過克隆方法在蛋白體/中間插入的任何氨基酸。本發(fā)明還延伸到所謂的雜合蛋白的"截短"形式，例如圖2所示并且標(biāo)記為CSVtr-S。因此本發(fā)明提供了截短的雜合蛋白，其中至少發(fā)現(xiàn)于CS蛋白N-末端的精氨酸富集區(qū)(大約氨基酸60)被去除/刪除。在一個方面，本發(fā)明提供了截短的雜合蛋白，其中至少氨基酸1至i55(5戈15'j56，57,58，59，60,61,62，63,64,65,66,67,68,69或70)被刪除。截短的雜合蛋白可包括在蛋白的起始的多至4個氨基酸的插入例如MMAP。在一個方面，本發(fā)明涉及雜合蛋白，其排除了全長重組蛋白的氨基5到64(包含端點)。這種/這些截短的雜合蛋白可用于下述本發(fā)明的其他方面。任何適當(dāng)?shù)拈g日癡原蟲抹可用于本發(fā)明，包括拉丁間日瘧原蟲株，美洲/南美(即Sa11，Belem)間日瘧原蟲抹，韓國間日瘧原蟲抹，中國間日癡原蟲株，泰國間日瘧原蟲抹，印尼間日瘧原蟲林，印度間日疾原蟲林和越南間日疾原蟲才朱。SEQIDNo13中的構(gòu)建體基于韓國林(更特別地南韓抹)。具有I型CS蛋白的間日瘧原蟲比具有II型CS蛋白的間日瘧原蟲更流行。因此在本發(fā)明的一個方面，比II型重復(fù)單位更多的來自I型的重復(fù)單位被包括在雜合體中。更特別地，本發(fā)明的雜合蛋白可包括來自I型的1到15個重復(fù)單位例如9個重復(fù)單位。來自I型CS蛋白的適當(dāng)?shù)膯误w的例子在SEQIDNoS:3到9中給出。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了包含不同的I型重復(fù)單位，例如SEQIDNoS3到9所列每種中的一種的混合體的雜合蛋白SEQIDNo。一個或多個重復(fù)單位可在雜合體中復(fù)制，例如SEQIDNo3和/或4的兩種單體可并入構(gòu)建體中。a)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo3的單位。b)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo4的單位，任選與上述a)段所述的單位組合。c)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo5的單位，任選與上述a)或b)段所述的單位組合。13d)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo6的單位，任選與上述a)到c)段所述的一個或多個單位組合。f)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo7的單位，任選與上述a)到d)段所述的一個或多個單位組合。g)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo8的單位，任選與上述a)到f)段所述的一個或多個單位組合。h)在一個方面，CS蛋白包含SEQIDNo9的單位，任選與上述a)到g)段所述的一個或多個單位組合。來自II型CS蛋白的適當(dāng)?shù)慕M成的重復(fù)單位的例子在SEQIDNo.s10和14,例如SEQIDNo.lO，中給出。在本發(fā)明的一個方面，提供了具有源自1I型的5個或更少種重復(fù)單位，例如一種單體，例如如SEQIDNo.10所示，的雜合蛋白。雜合蛋白還可包括發(fā)現(xiàn)于間日癡原蟲的某些亞洲抹中的重復(fù)區(qū)域的末端的12個氨基酸插入，例如如SEQIDNo.ll所示。在一個實施方式中，雜合蛋白包含源自間日瘧原蟲CS蛋白的257個氨基酸。在一個實施方式中，雜合融合蛋白包含494個氨基酸，例如其的257個源自間日疾原蟲CS蛋白。在一個方面，CS蛋白包含全長蛋白。在一個方面，應(yīng)用的CS蛋白是截短形式，例如如圖12所示或?qū)?yīng)的截短的，其中氨基酸大約1到大約67被刪除。在一個實施方式中，作為克隆方法的結(jié)果，1到5個另外的氨基酸插入序列的起始，例如MMAP或MMAPG被插入。雜合蛋白和/或融合蛋白還可進一步包括源自惡性瘧原蟲和/或間曰疾原蟲的抗原，例如其中抗原選自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMAl和RBP或其片段。在一個實施方式中，雜合融合蛋白(CSV-S)基本上具有SEQIDNo.17所示的氨基酸序列。在該序列中氨基酸6到262源自CSV并且269到494源自S。通過基因構(gòu)建引入剩下的氨基酸(其，特別地如果期望時可改變)。SEQIDNo.17的CSV-S融合蛋白的性質(zhì)在下表中提供<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>完整蛋白組成分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>SEQIDNo.20的CSV-S融合蛋白的性質(zhì)在下表中提供:Nishikawa&Ooi1987<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>完整蛋白組成分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>雜合融合蛋白CSV-S可例如利用質(zhì)粒pGFl-S2(見圖4并且為獲得進一步的細(xì)節(jié)見實施例)制備，其當(dāng)對應(yīng)于CSV的適當(dāng)序列插入Smal克隆位點時，加工插入序列以產(chǎn)生融合蛋白CSV-S。SEQIDNo17的雜合蛋白的核苷酸序列在SEQIDNo16中給出。該序列的CSV部分被密碼子最優(yōu)化以最優(yōu)化在酵母中的表達。替代地，雜合融合蛋白CSV-S可例如如實施例2所述那樣制備。本發(fā)明的雜合融合蛋白的一種替代核苷酸序列在SEQIDNo19中給出并且其氨基酸序列在SEQIDNo20中給出。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列，例如DNA。在一個實施方式中，編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列側(cè)翼連接轉(zhuǎn)錄控制元件，優(yōu)選源自酵母基因并且并入表達載體中。本發(fā)明雜合蛋白的表達盒可例如構(gòu)建為包含下列特征-啟動子序列，源自例如釀酒酵母(S.cerevisiae)TDH3基因。-編碼適當(dāng)?shù)腃SV-S雜合融合蛋白的序列。-包含在序列中的轉(zhuǎn)錄終止序列，源自例如，釀酒酵母ARG3基因。特定啟動子的例子是來自釀酒酵母TDH3基因的啟動子(Musti等)。本發(fā)明還涉及雜合融合蛋白的制備中利用的載體。然后可應(yīng)用適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒以將編碼雜合融合蛋白的序列引入到適當(dāng)?shù)乃拗髦泻铣?。適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒的例子是pRIT15546，一種用于攜帶適當(dāng)?shù)谋磉_盒的基于2微米的載體，見圖3中其質(zhì)粒圖譜。替代的質(zhì)粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和/或在實施例中進行了描述。質(zhì)粒通常將包含輔助篩選的內(nèi)在標(biāo)記，例如編碼抗生素抗性或LEU和/或HIS營養(yǎng)缺陷型的基因。在一個方面，質(zhì)粒是游離型的，即蛋白的基因不整合入宿主的DNA中。本發(fā)明還涉及用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核或真核的，但優(yōu)選是酵母，例如酵母屬(Sacc/wromyc")(例如，酉良酒酵母(S(2cc/wramyc^cerev,wae)如ATCC數(shù)據(jù)庫中的DC5(登錄號20820)，名稱為RITDC5cir(o),保藏者SmithKline-RIT)和非酵母屬酵母。這包括裂殖酵母屬(Sc/nzavacc/^ram少cM)(例如，粟酒裂殖酵母(Sc'/nro皿'c'/zarom戸s/謹(jǐn)6e))克魯維酵母屬(尺/wyvera^yces)(例^口，專'L酸克魯維酵母(A7w_yveraw_yces)),17畢赤酵母屬(尸,c/7,")(例如，巴斯德畢赤酵母(尸/c/zmpw/W^)),漢遜酵母屬(//araeww/a)(例^口，多開j;又遜酵母(//(2w化ww/a/o(ymor//^)),耶氏酵母(y"mw/")(例如，解脂耶氏酵母(y"mw,"/z>o/_y"ca))和許旺酵母屬(Sc/而wm'謂少cw)(例如,西方許旺酵母(Sc/z而wm'omycesocc/cfe/f/&))。在一個方面，本發(fā)明涉及用于表達SCV-S雜合融合蛋白和/或其免疫原性顆粒的重組酵母林Y1834(及其用途)，其制備見實施例。在一個方面，本發(fā)明涉及重組酵母抹Y1835(及其用途)，其表達CSV-S雜合融合蛋白和/或其免疫原性顆粒，其制備見實施例。在一個替代的方面，本發(fā)明涉及重組酵母林Y1840(及其用途)，其表達CSV-S雜合融合蛋白和/或其免疫原性顆粒。更特別地，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明融合蛋白的核苷酸序列的所述酵母(或另一酵母)，該酵母用于制備所述融合蛋白的用途，和涉及所述融合蛋白的制備的方法。核苷酸序列(或其部分，例如編碼雜合蛋白的部分但任選不為編碼蛋白s的部分)可以為在相關(guān)宿主例如酵母中的表達而密碼子最優(yōu)化。上下文中的密碼子最優(yōu)化表示密碼子被修飾以使得它們適合在相關(guān)宿主中表達。這可以是或可以不是最佳的密碼子選擇，例如可選擇次最佳優(yōu)化形式，如果其表達比最佳形式更好的話。在酵母細(xì)胞中，一旦表達，雜合融合蛋白(包含s抗原)能夠自發(fā)地裝配為由所述蛋白的多種單體組成的脂蛋白結(jié)構(gòu)/顆粒。這些顆粒還可涉及病毒樣顆粒(VLP)。顆粒還可描述為多聚體(mult騰ric)脂蛋白顆粒。這些顆?？梢远喾N方式制備，例如通過將每種疸原蟲源抗原與另一融合伴侶(例如乙型肝炎病毒抗原或病毒結(jié)構(gòu)蛋白)融合并在適當(dāng)?shù)乃拗骼缃湍富蚣?xì)菌中表達其。當(dāng)選擇的受體酵母林在其基因組中還攜帶了一種或多種乙型肝炎S表達盒的整合拷貝時，產(chǎn)生的林合成作為融合蛋白的雜合蛋白，以及非融合s抗原。這些可自發(fā)地裝配為包含雜合融合蛋白單體和s抗原單體的脂蛋白顆粒。盡管不希望被理論束縛，例如當(dāng)在Y1834中表達時，顆粒;波認(rèn)為基本上由雜合融合蛋白的單位/單體組成，雖然可能顆粒組分根據(jù)利用的特定酵母而改變。因此在一些例子中，脂蛋白顆粒還可包含未融合的S抗原的單體，例如如在酵母Y1835中制備產(chǎn)生的顆粒中那樣。因此在一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明雜合融合蛋白的免疫原性顆粒。因此，在一個方面，顆粒是"所謂"筒單顆粒，其中它基本上由雜合融合蛋白的單位組成。在本發(fā)明的一個替代方面，免疫原性脂蛋白顆粒在所謂雙或混合顆粒中包含一個或多個雜合融合蛋白和一個或多個未融合的蛋白S單位。圖1和7是根據(jù)本發(fā)明的這一方面的脂蛋白顆粒的電子顯微照片，雖然在不同酵母中制備。顯微照片中顯示的顆粒利用氯化銫和蔗糖梯度通過經(jīng)典技術(shù)純化，特別是利用連續(xù)的氯化銫和蔗糖梯度，更特別地1蔗糖梯度，然后是3個連續(xù)CsCl梯度。本發(fā)明包括純化所述顆粒的方法，例如利用氯化銫和蔗糖梯度。另外，假定用于從細(xì)胞釋放蛋白的表面活性劑可輔助脂蛋白顆粒的穩(wěn)定化。在一個進一步的方面，脂蛋白顆粒包含表面活性劑。表面活性劑可例如選自Tween(例如Tween20)、briji、聚乙二醇。顆?？衫绨?%或更少，例如0.5%或0.1%重量的表面活性劑。假定本發(fā)明的脂蛋白顆?？纱俪稍隗w內(nèi)進一步刺激對雜合融合蛋白的免疫應(yīng)答。本發(fā)明還涉及疫苗，其包含與適當(dāng)稀釋劑或載體混合的免疫保護量的根據(jù)本發(fā)明的蛋白或顆粒。本發(fā)明還涉及組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的雜合/融合蛋白或顆粒，以及涉及病毒載體，所述病毒載體包含疾疾抗原，特別是與所述顆粒共同的疾疾抗原，和任選佐劑。在本說明書的上下文中，賦形劑指藥物制劑中的組分，其自身沒有治療效果。稀釋劑或載體落入賦形劑的定義。在一個方面，本發(fā)明的組合物包含如本文所述的雜合融合蛋白和/或顆粒和佐劑。在一個實施方式中，病毒載體構(gòu)建體如WO2004/055187所述。19在一個實施方式中，所述融合蛋白在混合物中，并且因此可作為單個制劑而獲得。在另一實施方式中，融合蛋白制備為復(fù)數(shù)個單獨的制劑并且分別給予患者。在一個進一步的方面，本發(fā)明涉及對惡性疾原蟲和間日癡原蟲的組合治療，包含包含源自間日瘧原蟲CS蛋白的抗原的免疫原性融合蛋白，和包含源自惡性瘧原蟲CS蛋白的抗原的免疫原性融合蛋白。在本發(fā)明的這一方面，融合蛋白的源自間日癡原蟲CS蛋白的抗原成分可以是天然存在的(天然的)CS蛋白例如I型和/或II型或其片段?；蛘?，抗原可以是雜合(嵌合)蛋白，如上所述，例如SEQIDNol3和/或15所示蛋白。源自惡性瘧原蟲的融合蛋白抗原成分可根據(jù)WO93/10152制備，例如作為RTS,S(其中"S"代表未融合單體)或作為RTS,兩者都適于用于本發(fā)明的這一方面。在一個實施方式中，源自惡性瘧原蟲的抗原包含至少4重復(fù)單位的中央重復(fù)區(qū)域。更特別地，該抗原包含了含有至少160個氨基酸的序列，所述序列與CS蛋白C-末端部分基本上同源。CS蛋白可缺乏C-末端最后12到14個氨基酸。更特別地，包含惡性癡原蟲CS蛋白的部分的相關(guān)融合蛋白可基本上對應(yīng)于通過線性連接體符合讀框地融合于S抗原N-末端的惡性瘧原蟲7G8氨基酸207-395。該連接體可包含來自S抗原的preS2的部分。更特別地，利用的源自惡性瘧原蟲的融合蛋白是被如SEQIDNo18提供的RTS表達盒的核普酸序列所編碼的蛋白。適當(dāng)?shù)腟抗原可包含preS2。適當(dāng)?shù)难逍偷睦邮莂dw(Nature280:815-819,1979)。在一個方面，本發(fā)明的雜合融合蛋白包含源自突變S蛋白的部分，例如如公開的美國申請?zhí)?006/194196(也公開為WO2004/113369)中所述。該文獻描述了標(biāo)記為HDB05的突變體。特別是，它在圖1和6中描述了突變體和野生型蛋白的對比，并且在圖4和5中描述了突變體的基因。其序列12到22描述了突變S蛋白的特定多肽。上述的每種引入本文作為參考。本發(fā)明還涉及所迷治療組合的用途，更特別地用作用于預(yù)防瘧疾20的疫苗，和治療易感染癡原蟲感染的患者的方法，包括同時或序貫給予有效量的每種成分，由此治療或預(yù)防痗疾。在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了治療組合，其包括免疫原性雜合抗原，其包含a.源自間日瘧原蟲I型子孢子蛋白的中央重復(fù)部分的至少一個重復(fù)單位，b.源自間日瘧原蟲II型子孢子蛋白的中央重復(fù)部分的至少一個重復(fù)單位，和免疫原性融合蛋白，其包含源自惡性疾原蟲CS蛋白的抗原。例如，其中所述雜合抗原和所述融合蛋白伴隨給予，例如它們可為同時給予而混合，或替代地為序貫給予而配制。在一個進一步的方面，提供了治療組合，其包含免疫原性雜合抗原，其包含a源自間日瘧原蟲I型子孢子蛋白的中央重復(fù)部分的至少一個重復(fù)單位，b.源自間日瘧原蟲II型子孢子蛋白的中央重復(fù)部分的至少一個重復(fù)單位，和編碼癡疾抗原例如所述雜合抗原的病毒載體。例如，其中所述雜合抗原和所述病毒載體伴隨給予，例如它們可為同時給予而混合，或替代地可為序貫給予而配制。如本文使用的，術(shù)語"伴隨"表示其中所述成分組合在不超過12小時例如在不超過1小時的時期內(nèi)給予，典型地在一種時刻，例如在其到健康專業(yè)人員處就診時，例如其中它們序貫或同時給予。本發(fā)明還包括包含這些實施方式中每種的所述成分的疫苗組合物。本發(fā)明還涉及包含所述成分的初免-力口強(primeboost)計劃，例如用來自惡性疰原蟲的^元原和/或顆沖立初始免疫(priming)并且用來自間日癡原蟲的抗原和/或顆粒加強，并且反之亦然。初免-加強方案可例如包含唯一或僅4又源自間日瘧原蟲的成分。在另一實施方式中，可用質(zhì)粒/棵DNA實現(xiàn)初始免疫，并且用根據(jù)本發(fā)明的抗原加強，或反之亦然。一般的初免-加強計劃如下所述。移'J^口可用包含來自間日疾原蟲CS蛋白的至少一個I型重復(fù)單位和來自間日瘧原蟲CS蛋白的至少一個II型重復(fù)單位的抗原(例如佐劑抗原(adjuvantedantigen))初始免疫(priming),并且可用編碼其/相應(yīng)抗原的病毒載體加強，*可用包含來自間日瘧原蟲的至少一個重復(fù)單位或表位和來自惡性瘧原蟲CS蛋白的至少一個重復(fù)單位或表位的抗原(例如佐劑抗原)初始免疫(priming),并且可用編碼其/相應(yīng)抗原的病毒蛋白加強，.可用編碼抗原的病毒載體初始免疫，所述抗原包含來自間日疾原蟲CS蛋白的至少一個I型重復(fù)單位和來自間日瘧原蟲CS蛋白的至少一個II型重復(fù)單位或包含來自間日瘧原蟲的至少一個重復(fù)單位或表位和來自惡性瘧原蟲CS蛋白的至少一個重復(fù)單位或表位，并且可用蛋白和/或免疫原性顆粒形式的其/相應(yīng)佐劑抗原加強。上下文中的抗原包括本發(fā)明的雜合融合蛋白和/或免疫原性顆粒。在這些初免-加強計劃中，抗原通常是帶佐劑的(adjuvanted)。在本發(fā)明的這一/這些方面，上述對源自間日痊原蟲的雜合蛋白描述的優(yōu)選也是適用的。因此在一個方面，雜合蛋白具有SEQIDNo13的序列。來自惡性瘧原蟲的RTS,S和抗原(以免疫原性顆粒的形式)可如WO93/10152所述制備。在一個方面，本發(fā)明提供了編碼根據(jù)本發(fā)明的雜合蛋白(或替代地雜合融合蛋白)的復(fù)制缺陷病毒載體。適當(dāng)?shù)牟《据d體可源自腺病毒載體，腺伴隨病毒載體(AAVs)，麻滲(measles),慢病毒(lentivimses),甲病毒(alphaviruses),baclovimses,單純皰滲病毒(herpessimplexvirus),和痘病毒(poxviruses)例如牛痘(cowpox),鳥痘(fowlpox)，鵒痘(pigeo叩ox),金絲雀痘(canarypox)，豬痘(suipox),纟帛羊痘(sheeppox)/山羊痘(goatpox)。制備編碼疾疾抗原的腺病毒載體的方法例如描述于WO2004/055187。載體編碼的蛋白可例如被修飾以預(yù)防在表達過程中的蛋白的糖基化，例如某些絲氨酸可被丙氨酸殘基取代以降低糖基化。腺病毒本發(fā)明的腺病毒載體包含一種或多種異源多核苷酸(DNA)，其編碼一種或多種免疫原性多肽。用于本發(fā)明的腺病毒載體可以是源自一系列的哺乳動物宿主。腺病毒(本文表示為"Ad"或"Adv")具有特有的形態(tài)學(xué)，所述特有的形態(tài)學(xué)具有由三種主要蛋白，六鄰體(II)(hexon(II))，五鄰體基(III)(pentonbase(III))和突出的纖維(IV)(knobbedfibre(IV)),與許多其他次要蛋白，VI，VIII,IX，Ilia和IVa2—起組成的二十面的(icosohedral)衣殼(RussellW.C.2000,GenViriol,81:2573-2604)。病毒基因組是線性，雙鏈DNA,末端蛋白共價附著于5，末端，其具有反向的末端重復(fù)序列(ITRs)。病毒DNA與高度堿性蛋白VII和名稱為mu的小肽密切相關(guān)。另一蛋白，V，與這種DNA-蛋白復(fù)合體包裝并且提供了通過蛋白VI與衣殼的結(jié)構(gòu)性連接。病毒還包含病毒-編碼蛋白酶，其對于加工一些結(jié)構(gòu)蛋白以產(chǎn)生成熟感染病毒是必要的。超過100種獨特血清型的腺病毒已被分離，其感染不同哺乳動物種，其的51種是人源的。因此一種或多種腺病毒載體可源自人腺病毒。所述人源腺病毒的例子是Adl、Ad2、Ad4、Ad5、Ad6、Adll、Ad24、Ad34、Ad35、Ad50/51，特別是Ad5、Adll和Ad35?；诖罅可铮瘜W(xué)，免疫和結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)人血清型已被分類為六種亞屬(A-F)。盡管基于Ad5的載體已被廣泛使用于大量基因治療試驗中，對于Ad5和其他C組腺病毒載體的使用可能有限制，因為由于天然感染在一般群體中的預(yù)存的免疫性。Ad5和其他C組成員傾向于為最大血清陽性率的血清型。對于現(xiàn)存載體的免疫性可作為在治療過程中暴露于載體的結(jié)果而發(fā)展。這些類型的預(yù)存的或已發(fā)展的對于血清陽性載體的免疫性可限制基因治療或接種工作的有效性。替代的腺病毒血清型，因此在能夠規(guī)避宿主免疫應(yīng)答的基因遞送系統(tǒng)的研究中成為非常重要的革￡標(biāo)。替代血清型的一種所述領(lǐng)域是源自非人靈長類的那些，特別是黑猩猩腺病毒。見美國專利6,083,716,其描述了兩種黑猩猩腺病毒基因組。已經(jīng)顯示黑猩猩("Pan"或"C")腺病毒載體如人腺病毒載體一樣有效地誘導(dǎo)對于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的強的免疫應(yīng)答(Fitzgerald等，J.Immunol.23170:1416)。非人靈長類腺病毒可從黑猩猩的腸系膜淋巴結(jié)中分離。黑猩猩腺病毒與人腺病毒C亞型充分類似足以允許El缺失的病毒在HEK293細(xì)胞中的復(fù)制。然而黑猩猩腺病毒在系統(tǒng)發(fā)育上與更普通的人血清型(Ad2和Ad5)不同。Pan6與Pans5、7和9更不密切相關(guān)并且血清學(xué)上不同于Pans5、7和9。因此一種或多種腺病毒載體可源自非人靈長類腺病毒，例如黑猩猩腺病毒，如選自血清型Pan5、Pan6、Pan7和Pan9中的一種。腺病毒載體還可源自多于一種的腺病毒血清型，并且每種血清型可來自相同或不同來源。例如，它們可源自多于一種的人血清型和/或多于一種的非人靈長類血清型。構(gòu)建嵌合腺病毒載體的方法公開于WO2005細(xì)103。存在與將異源DNA插入腺病毒相關(guān)的某些大小限制。人腺病毒具有包裝多至105。/。野生型基因組長度的能力(Bett等，1993,JVirol67(10),5911-21)。對于人腺病毒更低的包裝限制已經(jīng)顯示為75%的野生型基因組長度(Parks等，1995，JVirol71(4)，3293-8)。本發(fā)明中有用的腺病毒的一個例子是不同于在人群中流行的天然存在的血清型例如Ad2和Ad5的腺病毒。這避免了誘導(dǎo)針對載體的有效免疫應(yīng)答，所述針對載體的有效免疫應(yīng)答通過中和抗體和影響毒性因此，腺病毒可以是不為流行的天然存在的人病毒血清型的腺病毒。分離自動物的腺病毒具有免疫學(xué)不同的衣殼，六鄰體，五鄰體和纖維組分，但是是系統(tǒng)發(fā)育上緊密相關(guān)的。特別地，病毒可以是非人腺病毒例如猿腺病毒，并且特別是黑猩猩腺病毒例如Pan5、6、7或9。所述林的例子描述于WO03/000283并且可獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas，Virginia20110-2209及其他來源。期望的黑猩猩腺病毒林是Pan5[ATCCVR-591],Pan6[ATCCVR-592],和Pan7[ATCCVR-593]。黑猩猩腺病毒的利用被認(rèn)為比人腺病毒血清型有利，因為缺少對于輩巴群體中的腺病毒預(yù)存的免疫性，特別是缺少交叉中和抗體。黑猩猩腺病毒與預(yù)存的中和抗體應(yīng)答的交叉反應(yīng)僅僅存在于2%的靶群體中，與之相比，在某些候選人腺病毒載體的例子中為35%。黑猩猩腺病毒與更普通的人亞型Ad2和Ad5不同，但更緊密相關(guān)于E亞組的人Ad4,其不是流行的亞型。Pan6與Pan5、7和9不緊密相關(guān)。本發(fā)明的腺病毒可以是復(fù)制缺陷的。這意味著它具有與野生型病毒相比降低的在非補足細(xì)胞(non-complementingcell)中復(fù)制的能力。這可通過將病毒突變而獲得，例如通過刪除復(fù)制中涉及的基因，例如刪除Ela、Elb、E3或E4基因。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可源自包含功能性El缺失的復(fù)制缺陷腺病毒。因此根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體可以是復(fù)制缺陷的，由于沒有表達腺病毒Ela和Elb的能力，即，是Ela和Elb功能缺失的。重組腺病毒還可具有其他基因的功能缺失(見WO03/000283),例如，E3或E4基因的缺失。腺病毒延遲早期基因E3可從組成重組病毒的部分的腺病毒序列中排除。E3的功能對于產(chǎn)生重組腺病毒顆粒是不必要的。因此，取代這種基因產(chǎn)物的功能以包裝本發(fā)明中有用的重組腺病毒是不必要的。在一個特定實施方式中，重組腺病毒具有功能缺失的El和E3基因。所述載體的構(gòu)建描述于Roy等，HumanGeneTherapy15:519-530,2004。重組腺病毒還可構(gòu)建為具有E4基因的功能缺失，盡管保持E4ORF6功能是期望的。根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體還可包含延遲早期基因E2a的缺失。還可產(chǎn)生腺病毒基因組晚期基因Ll到L5中任何的缺失。類似地，中期基因IX和IVa的缺失可以是有用的。可在其他結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)腺病毒基因中產(chǎn)生其他的缺失。上述缺失可單獨使用，即，用于本發(fā)明的腺病毒序列可僅僅包含E1缺失?；蛘?，對于破壞其生物活性有效的整個基因或其部分的缺失可以任何組合利用。例如，在一個示例性載體中，腺病毒序列可具有El基因和E4基因的缺失，或El、E2a和E3基因的缺失，或El和E3基因的缺失(例如Ela和Elb中的功能缺失，和E3的至少部分的缺失)，或具有或不具有E3缺失的E1、E2a和E4基因的缺失等等。所述缺失可以是這些基因的部分或全部的缺失，并且可與其他突變組合，例如溫度敏感突變，以獲得期望的效果。腺病毒載體可在任何適當(dāng)?shù)募?xì)胞系上產(chǎn)生，在其中病毒能夠復(fù)制。特別地，提供在病毒載體中缺少的導(dǎo)致其受損害的復(fù)制特性的因素(例如E1和/或E4)的補足細(xì)胞系可被利用。不受限制，所述細(xì)胞系可以是HeLa[ATCC登錄號CCL2],A549[ATCC登錄號CCL185],HEK293,KB[CCL17]，Detroit[例如,Detroit510,CCL72]和WI-38[CCL75]細(xì)胞，等等。這些細(xì)胞系都獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209。其4也適當(dāng)?shù)挠H本細(xì)胞系可獲自其他來源，例如PER.C60細(xì)胞，如應(yīng)用微生物和研究中心(CAMR,UK)的歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(ECACC)的ECACCno.96022940保藏的細(xì)胞所代表的，或Her96細(xì)胞(Crucell)。本發(fā)明涉及用于制備編碼本發(fā)明蛋白的病毒載體的已知細(xì)胞系的用途。編碼免疫原性多肽的多核苷酸序列可為哺乳動物細(xì)胞進行密碼子最優(yōu)化。所述密碼子最優(yōu)化在WO05/025614中詳細(xì)描述，例如^v第37頁開始。在本發(fā)明的一個實施方式中，其中病毒載體包含多核苷酸構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含N-末端前導(dǎo)序列。信號序列，跨膜域和胞質(zhì)域都分別任選存在或刪除。在本發(fā)明的一個實施方式中，所有這些區(qū)域都存在j^f皮修飾。用于根據(jù)本發(fā)明的腺病毒載體的啟動子可以是來自HCMEIE基因的啟動子，例如如WO02/36792所述，其中包含外顯子1的HCMVIE基因的5'未翻譯區(qū)域被包括并且內(nèi)含子A完全或部分被排除。當(dāng)幾種抗原融合入融合蛋白時，所述蛋白將在單個啟動子的控制下被多核苦酸編碼。在本發(fā)明的另一實施方式中，幾種抗原可通過獨立的啟動子分別表達，每種所述啟動子可以是相同或不同的。在本發(fā)明的另一實施方式中，一些抗原可形成融合體，與第一啟動子相連并且其他抗原可與第二啟動子相連，其可以與第一啟動子相同或不同。因此，腺病毒載體可包含一種或多種表達盒，其每種在啟動子的控制之下編碼抗原。替代地或另外地，它可包含一種或多種表達盒，其每種在啟動子之下編碼多于一種的抗原，所述抗原由此作為融合體表達。每種表達盒可存在于腺病毒載體的多于一種的位點中。編碼待表達的免疫原性多肽的單個多核苷酸或復(fù)數(shù)個多核苷酸可插入任何腺病毒缺失區(qū)域，例如插入E1缺失區(qū)域。盡管編碼免疫原性多肽的兩種或更多種多核苷酸可連接為融合26體，產(chǎn)生的蛋白可表達為融合蛋白，或者它可表達為獨立的蛋白產(chǎn)物，或者它可表達為融合蛋白并且然后接著分解為更小的亞單位。在本說明書的上下文中免疫原性意指引發(fā)(illicit)免疫應(yīng)答的能力。這種應(yīng)答可以是當(dāng)脂蛋白顆粒以可包括/需要適當(dāng)?shù)淖魟┑倪m當(dāng)制劑給予時的。可需要包含類似于或少于原始劑量的劑量的加強劑量(booster)以獲得需要的免疫原性應(yīng)答(包括用不同的實體加強即異源加強)。根據(jù)本發(fā)明的組合物/藥物制劑還可在混合物中包括一種或多種另外的抗原例如源自惡性癡原蟲和/或間日癡原蟲的那些，例如其中抗原選自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMAl和RBP或其片段。其他的例子，源自惡性癡原蟲的抗原包括PffiMP-l、Pfsl6抗原、MSP-1、MSP-3、LSA-1、LSA-3、AMA-1和TRAP。其他的癡原蟲抗原包括惡性疾原蟲EBA、GLURP、RAP1、RAP2、S叫uestrin、Pf332、STARP、SALSA、PffiXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs德5、Pfs230和它們在其他瘧原蟲種中的類似物。在本發(fā)明的疫苗中，雜合抗原的水溶液可直接使用?；蛘撸M行或不進行先前的凍千化的蛋白可與佐劑混合或吸收，所述已知的佐劑包括但不限于明礬，胞壁酰二肽，皂苷例如QuilA。特定的佐劑選自金屬鹽，水包油乳劑，Toll樣受體激動劑(特別是，Toll樣受體2激動劑，Toll樣受體3激動劑，Toll樣受體4激動劑，Toll樣受體7激動劑，Toll樣受體8激動劑和Toll樣受體9激動劑)，皂普，或其組合，條件是金屬鹽僅僅與另一佐劑組合使用并且不單獨使用除非它們制劑為使得不超過大約60%的抗原吸附到金屬鹽上。更特別地，不超過大約50%,例如40%的抗原吸附到金屬鹽上，并且在一個實施方式中，不超過大約30%的抗原吸附到金屬鹽上。吸附到金屬鹽上的抗體的水平可通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)確定?？赏ㄟ^例如在磷酸鹽離子如磷酸鹽緩沖鹽存在下制劑組合物，或通過增加抗原與金屬鹽的比例而增加游離抗原的水平。在一個實施方式中，佐劑不包括作為唯一佐劑的金屬鹽。在一個實施方式中，佐劑不包括金屬鹽。在一個實施方式中，佐劑是Toll樣受體(TLR)4配體，例如激動劑例如脂質(zhì)A(lipidA)衍生物特別是單磷?；|(zhì)A或更特別是327脫酰單磷?；|(zhì)A(3D-MPL)。3脫酰單磷?；|(zhì)A已知于美國專利No.4,912,094和英國專利申請No.2,220,211(Ribi),并且可獲自RibiImmunochem,Montana,USA。3D-MPL為Conxacorporation以商標(biāo)MPL⑧出售，并且主要以IFN-g(Thl)表型促進CD4+T細(xì)胞應(yīng)答?？筛鶕?jù)GB2220211A中公開的方法產(chǎn)生它?；瘜W(xué)上，它是3-脫酰單磷酰基脂質(zhì)A與3、4、5或6個酖化鏈的混合物。通常在本發(fā)明的組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有使得它可通過0.22pm濾器無菌過濾的顆粒大小。所述制劑在國際專利申請No.WO94/21292中進行了描述。脂質(zhì)A的合成衍生物是已知的并且被認(rèn)為是TLR4激動劑，包括但不限于OM174(2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]_4_0_膦?；鵢3_0-。比喃葡糖基]-2-[(11)-3-羥基十四烷?；被鵠-01-0-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四烷?；被鵠癸烷-l，10-二醇，l,10-二(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四烷?；被鵠癸烷-l,10-二醇,l-二氬磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)。典型地,當(dāng)使用3D-MPL時，抗原和3D-MPL與明礬一起遞送或以一種水包油乳劑或多種水包油乳劑呈遞。3D-MPL的？I入是有利的，因為它是效應(yīng)T-細(xì)胞應(yīng)答的刺激劑?；蛘?D-MPL可以配制為脂質(zhì)體。其他的可使用的TLR4配體是烷基氨基葡糖普磷酸酯(AGPs)，例如在WO9850399或US6303347中公開的那些(制備AGPs的方法也被公開)，或US6764840中公開的藥學(xué)上可接受的AGPs鹽。一些AGPs是TLR4激動劑，并且一些是TLR4拮抗劑。兩者都被認(rèn)為作為佐劑是有用的。另一用于本發(fā)明的免疫刺激劑是QmlA及其衍生物。QuilA是分離自南美扭于2w,7^/"S"/6i"(2n"A^/z""的鬼苦制劑并且首先#皮Dalsgaard爭在1974年("Saponinadjuvants",Archiv.fiirdiegesamteVirusforschung,Vol.44,SpringerVerlag,Berlin,p243-254)描述為具有佐劑活性。QuilA的純化片段已通過HPLC分離，其保持佐劑活性而沒有與QuilA(EP0362278),例如QS7和QS21(也稱作QA7和QA21),有關(guān)的毒性。QS-21是源自^w/〃"7"AY^owan"Molina的才對皮的天然皂苷，其誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs),Thl細(xì)胞和主要的IgG2a抗體應(yīng)答。QS21的特定制劑已被描述，其進一步包含甾醇(WO96/33739)。QS21:甾醇的比例典型地為大約重量比1:100到1:1。通常存在過量的甾醇，QS21:甾醇的比例為至少l:2w/w。典型地對于人，QS21和甾醇的給藥以每劑大約1pg到大約100pg范圍例如大約lOpg到大約50pg的范圍的疫苗存在。脂質(zhì)體通常包含中性脂質(zhì)，例如磷脂酰膽堿，其在室溫下通常是非結(jié)晶的，例如卵黃磷脂酰膽堿，二油酰磷脂酰膽堿或二月桂基磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體還可包含帶電荷脂質(zhì)，其對于由飽和脂質(zhì)組成的脂質(zhì)體增加脂質(zhì)體-QS21結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。在這些例子中，帶電荷脂質(zhì)的量通常是1-20%w/w,例如5-10%。甾醇比磷脂的比例是1-50%(mol/mol)，例如20-25%。這些組合物可包含MPL(3-脫酰單磷?；|(zhì)A,也稱作3D-MPL)。3D-MPL在GB2220211(Ribi)中已知為3種類型的脫-O-酰化單磷?；|(zhì)A與4、5或6個?；湹幕旌衔?，并且其被RibiImmunochem,Montana生產(chǎn)。通常在本發(fā)明的組合物中，利用了小顆粒3D-MPL，其具有一定的顆粒大小使得它可無菌過濾通過0.22pm的濾器。所述制劑描述于WO94/21292。急苷可以膠束，混合膠束(通常，但不排他地具有膽汁鹽)的形式分離，或當(dāng)與膽固醇和脂質(zhì)一起制劑時，可以是下列形式ISCOM基質(zhì)(EP0109942B1),脂質(zhì)體或相關(guān)膠質(zhì)結(jié)構(gòu)例如蠕蟲樣或環(huán)樣多聚體復(fù)合體或脂質(zhì)/分層的結(jié)構(gòu)和薄片，或者為水包油乳劑的形式(例如，如WO95/17210中所述)。皂苷經(jīng)?？膳c金屬鹽聯(lián)合，例如氫氧化鋁或A,酸鋁(WO98/15287)。通常皂苷以脂質(zhì)體，ISCOM或水包油乳劑的形式存在。免疫刺激寡核苷酸也可使用。用于本發(fā)明的佐劑或疫苗的寡核苷29酸的例子包括CpG,其包含寡核普酸，通常包含通過至少三種，更通常至少六種或更多種核苷酸分離的兩種或更多種二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸，接著鳥嘌呤核苷酸。CpG寡核苷酸典型地是脫氧核苷酸。在一個實施方式中，在寡核苷酸中的核普酸間(internucleotide)是二硫代磷酸酯，或更優(yōu)選地是硫代磷酸酯鍵，然而磷酸二酯和其他核普酸間鍵在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸。產(chǎn)生硫代磷酸酯寡核普酸或二硫代磷酸酯的方法描迷于US5,666，153、US5,278,302和WO95/26204。寡核苷酸的例子如下TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456),序列可包含^5克代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵。替代的CpG寡核苷酸可包含具有無關(guān)緊要的缺失或添加的上述一種或多種序列。CpG寡核苷酸可通過本領(lǐng)域任何已知的方法合成(例如見EP468520)。便利地，所述寡核苷酸可利用自動合成儀合成。TLR2激動劑的例子包括肽聚糖或脂蛋白。咪唑并喹啉，例如Imiquimod和Resiquimod是已知的TLR7激動劑。單鏈RNA也是已知的TLR激動劑(人中的TLR8和小鼠中的TLR7),然而雙鏈RNA和聚IC(聚肌苷-聚胞苷酸-一種商業(yè)上合成的病毒RNA模擬物)是示例性的TLR3激動劑。3D-MPL是TLR4激動劑的例子，同時CpG是TLR9激動劑的例子。免疫刺激劑可替代地或另外地包括。在一個實施方式中，這種免疫刺激劑將是3脫?；瘑戊Ⅴ；|(zhì)A(3D-MPL)。佐劑組合包括3D-MPL和QS21(EP0671948Bl),包含3D-MPL和QS21的水包油乳劑(WO95/17210,W〇98/56414),或用包括脂質(zhì)體的其他載體配制的3D-MPL(EP0689454Bl)。其他優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)包含如US6558670和US6544518中描述的3D-MPL、QS21和CpG寡核苷酸的組合。在一個方面，佐劑包含3D-MPL。在一個方面，佐劑包含QS21。在一個方面，佐劑包含CpG。在一個方面，佐劑包含QS21和3D-MPL。在一個方面，佐劑包含QS21,3D-MPL和CpG。在一個方面，佐劑配制為水包油乳劑。在一個方面，佐劑配制為脂質(zhì)體。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了包含與3D-MPL和載體組合的本文所述雜合蛋白的疫苗，如CSV-S。典型地載體將是水包油乳劑或明礬。更特別地，雜合蛋白呈現(xiàn)為本文所述的顆?；蚧旌项w粒。本發(fā)明的蛋白還可包封為微顆粒例如脂質(zhì)體。疫苗制劑——4殳》也描述于NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,Voller等編輯，UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.,1978。在脂質(zhì)體中的包封被Fullerton描述于例如，美國專利4,235,877。存在于每個疫苗劑量的本發(fā)明蛋白的量選自在典型疫苗中誘導(dǎo)免疫保護性應(yīng)答而沒有顯著的不利副作用的量。所述量將根據(jù)利用的特定免疫原和疫苗是否具有佐劑而改變。通常，預(yù)期每個劑量將包含l陽1000pg的蛋白，例如1-200(ig,如10-lOOjxg,更特別地10-40pg。對于特定疫苗的最佳量可通過涉及觀察受試者中的抗體滴度和其他應(yīng)答的標(biāo)準(zhǔn)研究而確定。在初次疫苗接種之后，受試者優(yōu)選在大約4周內(nèi)接受加強(boost),然后只要存在感染風(fēng)險每六個月重復(fù)加強。對本發(fā)明蛋白的免疫應(yīng)答通過利用佐劑和/或免疫刺激劑而增強。使用的3D-MPL的量通常是小的，但依賴于疫苗制劑可以在每劑l-1000|ng的范圍，通常每劑1-500貼，并且更例如在每劑1到100ing之間(每劑10、20、30、40、50、60、70、80或90(ig)。在本發(fā)明的佐劑或疫苗中的CpG或免疫刺激性寡核苷酸的量通常是小的，但依賴于疫苗制劑可以在每劑l-lOOO(ig的范圍內(nèi)，通常每劑l國500pg,并且更例如在每劑1到100pg之間(每劑10、20、30、40、50、60、70、80或90|iig)。用于本發(fā)明的佐劑中的皂苷的量可以在每劑l-1000|ig的范圍內(nèi)，通常每劑l-500|ig,更例如每劑l-250pg,并且更特別地在每劑1到100|iig之間(每劑10、20、30、40、50、60、70、80或90pg)。在一個進一步的方面，本發(fā)明提供了疫苗組合，其提供針對由惡性疰原蟲和/或間日癡原蟲引起的疾疾的免疫保護，其包含源自間曰疾原蟲CS蛋白的雜合蛋白例如本文所述的。在一個方面，提供了包含如本文所述的免疫原性顆粒，和任選進一步包含混合的TRS,S的免疫原性顆粒(如WO93/10152所述)和適當(dāng)?shù)拿庖叽碳ぷ魟┑囊呙?。本發(fā)明的制劑可用于預(yù)防和治療目的。用途，特別是用于藥物的如本文所述的疫苗組合物。本發(fā)明的進一步方面是提供用于制備本發(fā)明的雜合蛋白的方法，所述方法包含在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_編碼所述蛋白的核苷酸序列，優(yōu)選在酵母中，并且回收產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及利用本文所述一種或多種方面制備藥物組合物例如疫苗的方法。本發(fā)明的進一步的方面是治療易感染瘧原蟲感染的患者的方法，通過纟會予如本文前述的有效量的疫苗。疫苗包括腸胃外用疫苗。因此本發(fā)明涉及抗原，例如本發(fā)明的雜合融合蛋白和/或脂蛋白顆粒和包含其的組合物用于治療的用途，特別是用于制備治療/預(yù)防瘧疾例如由間日疾原蟲和/或惡性疾原蟲引起的瘧疾的藥物中的用途。編碼其的蛋白和/或病毒載體可在初免-加強計劃中給予，例如特別地如WO2004/037189中所述。在本說明書的上下文中，"包含"解釋為"包括"。包含某些成分的本發(fā)明的方面也意圖涉及由或基本上由相關(guān)成分組成的所述方面。實施例實施例1Y1834抹的描述酵母重組株Y1834表達CSV-S融合蛋白。它由用重組表達載體32pRIT15546轉(zhuǎn)化的釀酒酵母宿主抹DC5組成。DC5是具有下列基因型的實驗室酵母抹(ATCCNo:20820):leu2-3、leu2-112、his3、canl-U。雙leu-2突變允許選擇pRIT15546載體的吸收和保持，所述pRIT15546載體攜帶功能性LEU-2基因拷貝。僅僅攜帶了具有LEU-2基因的那些細(xì)胞當(dāng)亮氨酸不存在于生長培養(yǎng)基時能夠生長。載體pRIT15546是攜帶CSV-S表達盒的酵母游離表達載體(基于2p的載體)。重組表達被源自酵母TDH3基因(組成型表達)的啟動子驅(qū)動。pRIT15546載體的構(gòu)建在下面詳細(xì)描述。pRIT15546載體的構(gòu)建。具有用于酵母表達的適當(dāng)密碼子的CSV合成基因被構(gòu)建，并且亞克隆入pUC57載體(GenBank/EMBL登錄號Y14837)。產(chǎn)生的質(zhì)粒pUC57/CSV和酵母表達載體pGfl-S2都被適當(dāng)?shù)拿赶拗菩悦盖?。通過多步驟的克隆程序構(gòu)建了載體pGfl-S2(在GSK中)。這種載體，其已經(jīng)攜帶了S表達盒，允許融合基因的構(gòu)建，N-末端符合讀框地與乙型肝炎病毒S基因融合。最后的表達載體，在序列驗證之后，命名為pRIT15546(圖3)。DC5抹的轉(zhuǎn)化leu-和his-營養(yǎng)缺陷型DC5抹用重組質(zhì)粒pRIT15546轉(zhuǎn)化，通過利用酵母標(biāo)準(zhǔn)方案。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平板接種于瓊脂選擇性平板。一種轉(zhuǎn)化體被選一奪并接受正式命名Y1834。重組蛋白的表達Y1834在30。C在補充到終濃度8(ig/ml的組氨酸到大約0.5(此處0.770)的0.D.(620nm)的YNB(可獲自KrackerScientificInc的酵母氮基)基本培養(yǎng)基上生長。然后收獲細(xì)胞并且制備細(xì)胞提取物。提取物制備細(xì)胞重懸浮在破裂(Breaking)緩沖液中并且機械破裂(玻璃珠)。提取物在5000rpm下離心5-10分鐘。上清液部分進行SDS-PAGE4-20%。破裂緩沖液50mM磷酸鈉緩沖液(PH:7.5)4mMEDTATween-200.5%+蛋白酶抑制劑混合物(Complete/ROCHE)細(xì)胞濃度在5ml破裂緩沖液中的100ml培養(yǎng)物(OD:0.5)=10OD單位/ml的濃度。粗提取物澄清提取物離心5-10分鐘/5000rpm重組蛋白的檢測澄清的提取物進行SDS-PAGE4-20%,蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜并且進行免疫染色。見圖2。western印跡分析試劑=小鼠單克隆抗體抗-S(GSKBiologicals制備)-(稀釋1/500)商業(yè)上可獲得的抗-S抗體可替代本方法使用的那些。或者可使用抗-CSV抗體，例如可獲自NIH稱為MR4的那些。CSV-S融合蛋白理i侖MW:51794道爾頓表觀MW:55kDa實施例2Y1840林的描述巴斯德畢赤酵母株Y1840表達CSV-S融合蛋白。Y1840抹包含整合入基因組的四拷貝的CSV-S融合基因。為獲得表達CSV-S融合蛋白的林，用攜帶了CSV-S盒和功能性HIS4基因的整合性線性DNA片段轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母林GSU5。GS115是具有下列基因型的實驗室酵母林(ATCCNo:20864):his4。his4突變允許選擇攜帶CSV-S盒和功能性mS4基因的pRIT15607源的線性DNA片段的吸收。載體pRm5607是攜帶CSV-S表達盒的巴斯德畢赤酵母整合性表達載體。重組表達被強的緊密調(diào)節(jié)的甲醇可誘導(dǎo)A0X1啟動子驅(qū)動。pRIT15607載體的構(gòu)建在下面詳細(xì)描述。pRIT15607載體的構(gòu)建CSV-S融合基因，存在于pRIT15546上，用PCR擴增并且克隆入pGEM-TEasy中間載體(Promega,catN°:#A1360)。序列驗證之后，重組質(zhì)粒被用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶⑶铱寺∪雙HIL-D2巴斯德畢赤酵母整合性載體中。最終的表達載體，在序列驗證之后，命名為pRIT15607(圖5)。被pRIT15607質(zhì)粒編碼的CSV-S融合蛋白幾乎與SEQIDNo17所述的序列同一，除了曱碌b氨酸2被纈氨酸取代之外(見SEQIDNo19和SEQIDNo20)。用內(nèi)切酶消化pRIT15607釋放了6816bp的線性片段，其可通過在內(nèi)在的AOX1位點的同源重組被整合入酵母基因組。GS115抹的轉(zhuǎn)化用重組質(zhì)粒pRIT15607轉(zhuǎn)化GS115宿主株。轉(zhuǎn)化整合性質(zhì)粒之前用A^/限制性酶切，以釋放攜帶表達盒和HIS4選擇性標(biāo)記的線性DNA片段。限制性酶切將促成在A0X1位點的整合。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞平板接種于瓊脂選擇平板上。通過定量斑點印跡選擇多拷貝整合克隆。在已經(jīng)具有高拷貝數(shù)量的整合的CSV-S表達盒的選擇的克隆中，選擇其中對于CSV-S重組蛋白顯示出最高表達水平的一種，并且給予其正式命名Y1840。這種克隆攜帶四拷貝的CSV-S融合基因。重組蛋白的表達YY1840在30。C在補充1%甘油作為碳源到大約0.5(在此例子中為0.709)的O.D.(620匪)的YNB(可獲自KrackerScientificInc的酵母氮基)基本培養(yǎng)基中生長。然后細(xì)胞被收獲并重懸浮于補充了1%曱醇作為碳源(作為誘導(dǎo)劑)的相同體積的YNB培養(yǎng)基中，并且在30。C下培養(yǎng)大約16小時。提取物制備甲醇誘導(dǎo)的細(xì)胞被離心，細(xì)胞團重懸浮于破裂緩沖液中并機械裂解(玻璃珠或Frenchpress)。提取物以5000rpm離心5-10分鐘。上清液部分進行SDS-PAGE12.5%。破裂緩沖液60mMNa2HP0440mMNaH2P04ImMMgS04lOMmKC1Tween-200.5%2MmPMSF細(xì)胞濃度在2.5ml破裂緩沖液中的100ml培養(yǎng)物(OD:0.5)=20OD單位/ml的濃度。粗提取物澄清提取物離心5-10分鐘/5000rpm重組蛋白的檢測澄清的提取物進行SDS-PAGE12.5%,蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上并進行免疫染色。見圖6。western印跡分析試劑=小鼠單克隆抗體抗-S(GSKBiologicals制備)-(稀釋:1/250)商業(yè)上可獲得的抗-S抗體可替代本方法中利用的那些?；蛘呖衫每?CSV抗體，例如可獲自NIH稱為MR4的那些。CSV-S融合蛋白理論MW:51762道爾頓表觀MW:55kDa實施例3Y1835抹的描述酵母重組抹Y1835同時表達CSV-S融合蛋白和S抗原。為獲得共表達CSV-S和S蛋白的林，釀酒酵母Y1295抹，其已經(jīng)攜帶5整合拷貝的S表達盒，被用重組整合性表達載體pRIT15582轉(zhuǎn)化。Y1295抹在GSK中通過多步驟轉(zhuǎn)化程序構(gòu)建。Y1295的構(gòu)建描述于WO93/10152。Y1295株具有下列基因型:leu2-3、leu2國112、gall。leu-2突變允許選擇攜帶CSV-S盒和功能性LEU2基因的源自pRIT15582的線性DNA片段的吸收。36載體pRIT15582是酵母整合性表達載體(基于Ty的載體)，其攜帶CSV-S表達盒。重組表達被源自酵母TDH3基因的啟動子驅(qū)動(組成型表達)。pRIT15582載體的構(gòu)建在下面詳細(xì)描述。pRIT15582整合性載體的構(gòu)建用于構(gòu)建pRIT15582載體的起始材料是表達質(zhì)粒pRIT15546(圖3)。這種質(zhì)粒的構(gòu)建描述于實施例1。用T/z'^////內(nèi)切核酸酶的pRIT15546消化釋放了對應(yīng)于完整CSV-S表達盒(pTDH3+CSV-S+tARG3)的3706bp長DNA片段。///>^//〃DNA片段(用T4DNA聚合酶填充之后)在獨特的^7//克隆位點(Sa11限制性酶切/T4處理)插入基于丁y的整合性載體pRIT13144中。產(chǎn)生的質(zhì)粒pRIT15582包含，除了表達盒之外，作為選擇性標(biāo)記的酵母LEU2基因(圖8)。用X/w/內(nèi)切核酸酶的pRIT15582消化釋放了圖4所示的8500bp的線性片段，其可通過游離末端與內(nèi)在的Ty成分同源重組整合入酵母基因組。Y1295抹的轉(zhuǎn)化為獲得表達S和CSV-S蛋白的抹，用8500bp線性X/K/片段(圖9)轉(zhuǎn)化Y1295抹以選擇Leu+集落。獲得了包含以不同比例存在于基因組中的多組兩種表達盒的幾種整合體。選擇攜帶四拷貝CSV-S盒的一種轉(zhuǎn)化體并且給予正式命名Y1835。重組蛋白的表達Y1835在30。C在大約0,5(0.8)的OD.(620nm)的YNB(可獲自KrackerScientificInc的酵母氮基)基本培養(yǎng)基上生長。然后收獲細(xì)胞并且制備細(xì)胞提取物。通過免疫印跡的表達產(chǎn)物分析提取物制備細(xì)胞重懸浮于破裂緩沖液中并且機械破裂(玻璃珠)。提取物在5000rpm下離心5-10分鐘。上清液組分進行SDS-PAGE12.5%。破裂緩沖液50mM磷酸鈉緩沖液(PH:7.5)4mMEDTATween-200.5%37+蛋白酶抑制劑混合物(Complete/ROCHE)細(xì)胞濃度在2.5ml破裂緩沖液中的100ml培養(yǎng)物(OD:0.5)=20OD單4立/ml的濃度。粗提取物澄清提取物離心5-10分鐘/5000rpm重組蛋白的檢測澄清的提取物進行SDS-PAGE12.5%,蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜并進行免疫染色。western印跡分析(圖10):試劑1/小鼠單克隆抗體抗-S(GSKBiologicals制備)-(稀釋1/250)2/兔多克隆抗體抗-CSV(WRAIR惠贈)-稀釋1/20,000。商業(yè)上可獲得的抗-S抗體以及抗-間日瘧原蟲ZCSP抗體可替代本方法中使用的那些。38參考文獻(1)HarfordN,CabezonT,ColauB,等人，"表達乙型肝炎病毒表面抗原的釀酒酵母株(RIT4376)的構(gòu)建和表征"，PostgradMedJ63,Supp.2:65-70,1987.(2)JacobsE,RutgersT,VoetP,等人，"各種乙型肝炎病毒表面蛋白在釀酒酵母中的同時合成和裝配"，Gene80:279-291，1989.(3)VieiraJandMessingJ,"pUC質(zhì)粒，一種用于通過合成通用引物來插入誘變和測序的M13mp7-衍生系統(tǒng)"，*—Gene19:259-268,1982.(4)HinnenA,HicksJB,andFinkGR,"酵母的轉(zhuǎn)化"，ProcNatlAcadSciUSA75:1929-1933，1980.(5)BroachJR,StrathernJN,andHicksJB，"發(fā)育雜合克隆載體和CANl基因的酵母轉(zhuǎn)化"，Gene8:121-133,1979.(6)ZhangH,等人，"作為DNA測序選擇的雙鏈SDNA測序"，NucleicAcidsResearch16:1220,1988.(7)DameJB，WilliamsJL.McCutchanTF,等人，"編碼人癡疾寄生蟲惡性疾原蟲的子孢子上的優(yōu)勢免疫表面抗原的基因結(jié)構(gòu)"，Science225593-599，1984.(8)ValenzuelaP,GrayP,QuirogaM,等人，"編碼乙型肝炎病毒表面抗原的主要蛋白的基因的核苷酸序列"，Nature280:815-819,1979.(9)InSS,Kee-HoyungL，YoungRK,等人，"在韓國瘧疾患者中對于各種類型間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白的免疫反應(yīng)的比較"，Microbiol.Immunol.48(2):119-123，2004;Microbiol.Immunol.2004;48(2):119-123.(10)RathoreD,SaccUB,delaVegaP,等人，《通過惡性瘧原蟲的子孢子的肝細(xì)胞結(jié)合和侵入"，J.Biol.Chem.277(9):7092-7098，2002.Rathore等人，2002,J.Biol.Chem.277,7092-8權(quán)利要求1.免疫原性雜合融合蛋白，其包含a.源自間日瘧原蟲I型環(huán)子孢子蛋白重復(fù)區(qū)域的至少一個重復(fù)單位，b.源自間日瘧原蟲II型環(huán)子孢子蛋白的重復(fù)區(qū)域的至少一個重復(fù)單位，和c.源自乙型肝炎病毒的表面抗原S或其片段。2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白，其中該蛋白進一步包含來自間日瘧原蟲CS蛋白的N-末端片段。3.根據(jù)權(quán)利要求2的蛋白，其中該N-末端片段包含稱為(I)區(qū)的片段，例如SEQIDNo1所示的(I)區(qū)的片段。4.根據(jù)任何前述權(quán)利要求的蛋白，其中該蛋白進一步包含來自間日瘧原蟲CS蛋白的C-末端片段。5.根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白，其中C-末端片段包含稱為(II)區(qū)的部分，例如SEQIDNo2所示的基序。6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其中I型重復(fù)單位源自一種或多種下列間日疰原蟲林拉丁間日瘧原蟲抹、美洲(即Sall,Belem)間日癡原蟲抹、韓國間日瘧原蟲抹、中國間日瘧原蟲林、泰國間曰瘧原蟲林、印尼間日瘧原蟲抹、印度間日瘧原蟲株和越南間日瘧原蟲株。7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其中I型重復(fù)單位選自SEQIDNo3到9中所示的一種或多種單體。8.根據(jù)權(quán)利要求6或7的蛋白，其包含至少9個I型重復(fù)單位。9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其中II型單體選自SEQIDNo10或14中所示的一種或多種單體。10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其包含1個II型重復(fù)單位。11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其進一步包含位于在間日瘧原蟲的某些亞洲抹中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)區(qū)域末端的12個氨基酸插入。12.根據(jù)權(quán)利要求ll的蛋白，其中氨基酸是SEQIDNoll所示的那些。13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其中乙型肝炎S抗原源自adw血清型。14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項的蛋白，其進一步包含源自惡性瘧原蟲和/或間日疾原蟲的一種或多種另外的抗原。15.根據(jù)權(quán)利要求14的蛋白，其中抗原選自DBP、PvTRAP、PvMSP2、PvMSP4、PvMSP5、PvMSP6、PvMSP7、PvMSP8、PvMSP9、PvAMAl和RBP。16.根據(jù)權(quán)利要求1到15中任一項的蛋白，其包含SEQIDNo13所示的雜合環(huán)子孢子蛋白序列。17.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1到16中任一項的雜合融合蛋白和佐劑。18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中佐劑選自金屬鹽例如氫氧化鋁或磷酸鋁，，水包油乳劑，toll樣受體激動劑，(例如toll樣受體2激動劑、toll樣受體3激動劑、toll樣受體4激動劑、toll樣受體7激動劑、toll樣受體8激動劑和toll樣受體9激動劑)，*皂苷，例如QuilA及其衍生物如QS7和/或QS21,.包含寡核苷酸的CpG,'3D-MPL，.(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸酰基氨基]-4-o-膦?；?(3-D-口比喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四烷?；被鵠-a-D-吡喃葡糖基二氬磷酸酯)，DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(11)-[(11)-3-羥基十四烷?；被鵠癸烷-1,10-二醇，1,10-二(二氫磷酸酯)，和MP-AcDP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四烷酰基氨基]癸烷-l,10-二醇,1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)，或其組合。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的組合物，其中佐劑選自與金屬鹽例如氪氧化鋁或磷酸鋁締合的皂普，3DMPL、QS21和CpG寡核苷酸，例如作為水包油制劑，.脂質(zhì)體形式的皂苷，例如進一步包含甾醇如QS21和甾醇，和'ISCOM。20.根據(jù)權(quán)利要求17到19中任一項的組合物，其進一步包含混合的源自惡性瘧原蟲和/或間日疾原蟲的一種或多種另外的抗原。21.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任一項的組合物，其進一步包含表面活性劑。22.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中表面活性劑選自Tween(例如Tween20)、briji、聚乙二醇。23.根據(jù)權(quán)利要求17到20中任一項的組合物，其中組合物是疫苗例如腸胃外用疫苗。24.多聚體脂蛋白顆粒，其包含如權(quán)利要求1到16任一項中定義的雜合蛋白。25.組合物，其包含如權(quán)利要求24中定義的顆粒和至少一種賦形劑/載體。26.根據(jù)權(quán)利要求25的組合物，其進一步包含佐劑。27.根據(jù)權(quán)利要求26的組合物，其中佐劑選自.金屬鹽例如氫氧化鋁或磷酸鋁，*水包油乳劑，toll樣受體激動劑，(例如toll樣受體2激動劑、toll樣受體3激動劑、toll樣受體4激動劑、toll樣受體7激動劑、toll樣受體8激動劑和toll樣受體9激動劑)，*皂苷，例如QmlA及其衍生物如QS7和/或QS21,*包含寡核苷酸的CpG，3D—MPL,*(2-脫氧-6-0-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基癸?；被鵠-4-o-膦?；?(3-D-p比喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基十四烷酰基氨基]-a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四烷?；被鵠癸烷-l,10-二醇，l,10-二(二氫磷酸酯)，和MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四烷?；被鵠癸烷-l，10-二醇,1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)，或其組合。28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的組合物，其中佐劑選自.與金屬鹽例如氫氧化鋁或磷酸鋁締合的皂苷，3D-MPL、QS21和CpG寡核普酸，例如作為水包油制劑，*脂質(zhì)體形式的急苦，例如進一步包含甾醇如QS21和甾醇，和'ISCOM。29.根據(jù)權(quán)利要求25到28中任一項的組合物，其進一步包含混合的源自惡性疾原蟲和/或間日疾原蟲的一種或多種另外的抗原。30.根據(jù)權(quán)利要求25到29中任一項的組合物，其進一步包含表面活性劑。31.根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其中表面活性劑選自Tween(例如Tween20)、briji、聚乙二醇。32.根據(jù)權(quán)利要求25到31中任一項的組合物，其中組合物是疫苗例如腸胃外用疫苗。33.用于治療的如權(quán)利要求1到16任一項中定義的蛋白或如權(quán)利要求17到23任一項中定義的組合物或如權(quán)利要求25到32任一項中定義的組合物。34.如權(quán)利要求l到16任一項中定義的蛋白或如權(quán)利要求24中定義的顆粒在制備用于治療/預(yù)防疾疾的藥物中的用途。35.根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中瘧疾是由間日瘧原蟲引起的。36.治療易感染瘧原蟲感染的患者的方法，其包括給予有效量的如權(quán)利要求1到16任一項中定義的蛋白或如權(quán)利要求17到23或23到32任一項中定義的組合物，特別是作為疫苗，由此治療或預(yù)防癡疾。37.編碼權(quán)利要求1到6任一項中定義的蛋白的核苷酸序列。38.包含如權(quán)利要求37中定義的核苷酸序列的宿主。39.用于生產(chǎn)如權(quán)利要求1到16任一項中定義的蛋白的方法，所述方法包括在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_編碼所述蛋白的核苷酸序列并且回收產(chǎn)物。40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述宿主是酵母。41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述酵母選自酵母屬(Swc/7"r函少dV)，裂殖酵母屬(Sc/7/ZOTOCC'/7ar畫^yCeS)，克魯維酵母屬(A7Kyvera附，'&v),畢赤酵母屬(尸,c'/zz")(例如，巴斯德畢赤酵母(尸,c/n"p"wo〃:0),漢遜酵母屬(//"朋e"w/")(例如，多形漢遜酵母(//謹(jǐn)e肌/apo(y膨—耶氏酵母(旨r頻a),許旺酵母屬(wa"mow，w),裂殖酵母屬(Sc/z,zo^cc/^ramy^),結(jié)合酵母(Z少goacc/zaram少ceA、)，例^口酉良酒酵母(iS^cc/zaramycescerev/w'ae),卡爾斯伯酵母(s.匿/A匿腿)，乳酸克魯維酵母(《.丄acte),Y1834和DC5。42.根據(jù)權(quán)利要求40或41任一項的方法，其中通過用包含表面活性劑的適當(dāng)組合物裂解宿主細(xì)胞而回收產(chǎn)物。43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中表面活性劑選自Tween(例如Tween20)、briji、聚乙二醇。全文摘要本發(fā)明涉及源自間日瘧原蟲(P.vivax)CS蛋白的新的雜合/融合蛋白，制備和純化其的方法，其用于藥物中的用途，特別是在預(yù)防瘧疾感染，例如由間日瘧原蟲引起的那些感染中的用途，包含該蛋白或抗該蛋白的抗體例如單克隆或多克隆抗體的組合物/疫苗，及其用途，特別是在治療中的用途。本發(fā)明還涉及所述雜合蛋白的脂蛋白顆粒和包含其的制劑/疫苗和其用途。特別地，本發(fā)明涉及免疫原性雜合融合蛋白，其包含a.源自間日瘧原蟲I型環(huán)子孢子蛋白的重復(fù)區(qū)域的至少一個重復(fù)單位，b.源自間日瘧原蟲的II型環(huán)子孢子蛋白的重復(fù)區(qū)域的至少一個重復(fù)單位，和c.源自乙型肝炎病毒的表面抗原S或其片段。文檔編號A61K39/002GK101522212SQ200780034638公開日2009年9月2日申請日期2007年7月16日優(yōu)先權(quán)日2006年7月18日發(fā)明者A·亞達瓦,C·F·奧肯豪斯,J·D·科亨,M·馬尚申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司;美國陸軍部