專利名稱：重組瘧疾疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組瘧疾疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
瘧原蟲(瘧原蟲屬(尸/"，o&畫))的裂殖子表面蛋白(MSP-l)存在于裂殖子 表面上，其為瘧原蟲的紅細(xì)胞侵入形式。MSP-1以分子量約為190kDa的前 體蛋白的形式被生產(chǎn)出來，其在裂殖子成熟過程中被蛋白酶解加工成稱為 p83、 p30、 p38和p42的四種片段，這四種片段以非共價連接的形式保留在 寄生蟲的表面。在侵入紅細(xì)胞時，發(fā)生進(jìn)一步的蛋白酶剪切。
MSP-1蛋白由幾個高度保守區(qū)、二形區(qū)(dimorphic region)組成，該二形 區(qū)與在N末端區(qū)域中的兩個等位形式之一和兩個相對較小的少數(shù)發(fā)育型區(qū)組 (oligomorphic block)之一有關(guān)(Tanabe等人，J. Mol. Biol. 195 (1987) 273-287; Miller等人,Mol. Biochem. Parasitol. 59 (1993), 1-14;在此通過引用方式將其 并入本申請)。
已證實MSP-1蛋白是可能的疫苗候選(Holder禾P Freeman, Nature 294 (1981), 361-364; Majarian等人，J. Immunol" 132 (1984)， 3131-3137)。此外，已 經(jīng)在靈長類動物(特別是夜猴(Aotus)和松鼠猴(Saimid monkey))上使用來自惡 性瘧原蟲(尸/fl/cz》aram)的MSP-1材料進(jìn)行了一些疫苗接種研究(例如Perrin 等人，J. Exp. Med. 160 (1984), 441-451 ; Hall等人，Nature 311 (1984) 379-382; Siddiqui等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 3014-3018; Ettlinger等人, Inf. Imm. 59 (1991), 3498-3503; Holder等人，Parasite Immunol. 10 (1988)， 607-617; Herrera等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 4017-4021; Herrera等人，Inf. Imm. 60 (1992), 154-158以及Patarroyo等人，Nature 328 (1987)， 629-632,在此通過引用方式將其并入本申請)。
使用來自大腸桿菌(￡."http://)的MSP-1蛋白的重疊重組片段進(jìn)行的疫苗接 種研究表明具有保護(hù)效果(Tolle等人，Infect. Immun. 61 (1993)， 40-47)。在施用 p19或p42多肽形式的MSP-1蛋白的C末端區(qū)域之后，也發(fā)現(xiàn)了保護(hù)效果 (Chang等人，Inf. Imm. 64 (1996), 253-261)。
WO 98/14583描述了 一種通過與天然產(chǎn)生的序列相比減少所表達(dá)的 DNA序列中的AT含量來制備重組的完整MSP-1多肽的方法。但是，WO 98/14583中所述的方法存在一些缺點。首先，該制備方法僅在N和/或C末 端序列標(biāo)志存在下才能有效純化。其次，純化方法僅在小規(guī)模時有效。適應(yīng) 于疫苗制備的工業(yè)過程中所需的大規(guī)模純化方法是不容易得到的。
Kauth等人描述了來自異源產(chǎn)生的亞單位的惡性瘧原蟲株系3D7 /a/c/parwm strain 3D7)的MSP-1多肽的體外重建(J. Biol. Chem. 278 (2003)， 22257-22264)。但是，其中僅描述了與異源序列標(biāo)簽(如GST、鏈球菌或六 組氨酸標(biāo)簽)融合的多肽的純化。但是，在疫苗中，這種異源序列的存在是 不合需要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供一種組合物克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點，該組合物包含
(a) 沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋白的純化片段 p83/30，和
(b) 沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋白的純化片段 p38/42。
優(yōu)選地，純化的p83/30片段為F-片段，即源自瘧原蟲屬F株的片段，尤 其是源自惡性瘧原蟲株系FCB-1(也稱為FC或F)的片段。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)， 與D-片段(即源自瘧原蟲屬D株的片段，尤其是源自惡性瘧原蟲株系3D7(也
6稱為NF54)的片段)相比，F(xiàn)-片段在對抗蛋白酶解上更穩(wěn)定。此外，令人驚訝 地發(fā)現(xiàn)，p38/30 F-片段可以與異源和/或同源p38/42片段組合，例如與異源 p38/42 D-片段和/或p38/42 F-片段組合。
在本發(fā)明的組合物中，成分(a)和(b)優(yōu)選以大約等摩爾的量存在，例如， 成分(a)與成分(b)的摩爾比為1.5:1 1:1.5，更優(yōu)選L2:l l:1.2且最優(yōu)選大約 1:1。
優(yōu)選地，在組合物中的至少70%、更優(yōu)選至少80%且最優(yōu)選至少90%片 段以非共價連接的二聚體的形式存在。
成分(a)和(b)優(yōu)選為重組多肽，即在如真核宿主細(xì)胞(如酵母細(xì)胞，例如 S. ce v/s/ae或/3 paeon's)或者如原核細(xì)胞(如革蘭氏陰性菌細(xì)胞，例如大 腸桿菌)的重組宿主細(xì)胞中己制備的多肽。優(yōu)選地，重組宿主細(xì)胞為大腸桿 菌細(xì)胞。更優(yōu)選地，宿主細(xì)胞為大腸桿菌W3110Z2。
在--個優(yōu)選的實施方式中，如通過SDS凝膠電泳和銀染色所測定，本發(fā) 明的組合物的純度為至少95%和95%以上，優(yōu)選至少97.5°/。。在本文中，術(shù) 語"純度"指沒有異源多肽(即非MSP-1多肽)。
在另一個進(jìn)一步的優(yōu)選實施方式中，如通過SDS凝膠電泳和免疫染色所 測量，所述組合物的降解產(chǎn)物的含量小于30%，更優(yōu)選小于20%,且最優(yōu)選 小于10%。在本文中，術(shù)語"降解產(chǎn)物"指由如上所述的p83/30片段或p38/42 片段降解產(chǎn)生的多肽分子。
本發(fā)明的組合物包含來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋白的純化片段 p83/30和來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋白的純化片段p38/42。術(shù)語"p83/30 片段"指包含瘧原蟲屬的MSP-1蛋白的p83片段和p30片段的單個多肽。優(yōu) 選地，所述組合物包含來自瘧原蟲屬F株的p83/30片段。p38/42片段為包含 來自瘧原蟲屬的MSP-1蛋白的p38片段和p42片段的單個多肽。p38/42片段 可源自任何瘧原蟲屬株系，例如惡性瘧原蟲的D株或F株。
7p83/30片段優(yōu)選包含如SEQ ID NO:l中所示的惡性瘧原蟲F株的氨基酸 序列和非必需的N-末端信號肽序列或源自F株序列的修飾的F-片段。在較不 優(yōu)選的實施方式中，p83/30片段包含惡性瘧原蟲D株的氨基酸序列和非必需 的N-末端信號肽序列或修飾的D株序列。SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列 源自D株的氨基酸序列并且包含在第611位(E — K)和第866位(Q — H)的2 個氨基酸置換。
p38/42片段可源自惡性瘧原蟲F株，如SEQ ID NO:3中所示，和/或源 自惡性瘧原蟲D株，如SEQ IDNO:4中所示。令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)株的p83/30 片段既可與來自F株的同源p38/42片段組合，又可與來自不同惡性瘧原蟲株 系(例如D株)的異源p38/42片段組合。
術(shù)語"p83/30片段"和"p38/42片段"也指在多肽的全長范圍內(nèi)與天然 p83/30或p38/42片段具有至少90%、優(yōu)選至少95%且最優(yōu)選至少98%的氨 基酸序列同一性的修飾片段。該術(shù)語也包括與野生型多肽相比可以包含單氨 基酸缺失和/或最高至10個、更優(yōu)選最高至5個氨基酸的氨基酸段缺失的截 短片段。優(yōu)選地，p83/30片段的長度為至少800個氨基酸，更優(yōu)選至少850 個氨基酸。此外，p83/30片段與SEQ IDNO:l中的惡性瘧原蟲F變體的p83/30 片段具有至少90%、更優(yōu)選至少95%且最優(yōu)選至少98%的序列同一性。
優(yōu)選地，p38/42片段的長度為至少700個氨基酸且更優(yōu)選至少750個M 基酸。此外，優(yōu)選地，與源自惡性瘧原蟲F株的p38/42片段(SEQ ID NO:3) 和/或源自D株的p38/42片段(SEQ ID NO:4)相比，p38/42片段具有至少90%、 更優(yōu)選至少95%且最優(yōu)選至少98%的序列同一性。
p83/30和p38/42的特別優(yōu)選的實施方式的氨基酸序列示于SEQ ID NO:l、 2、 3和4中。
本發(fā)明還涉及一種藥物制劑，其包含如上所述的組合物和可藥用載體、 稀釋劑和/或佐劑。優(yōu)選地，該制劑為疫苗。疫苗可以以可復(fù)水的冷凍干燥物形式、如溶液或懸液的液體形式或者以
如油包水乳狀液的乳狀液形式存在。疫苗可以包含佐劑，如明礬、MF59或 BCG， 包括女口在名為"Combination of a bacterial cell and a biologically active agent"的PCT/EP2005/011127中披露的重組BCG，該文獻(xiàn)在此通過引用方式 并入本申請。優(yōu)選通過注射(例如皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)注射)施用疫苗。
對于在人用藥物中的應(yīng)用，疫苗的優(yōu)選劑量包括1 500 pg，更優(yōu)選20 lOOng蛋白?？梢詥未蝿┝糠绞交蛘咭远啻蝿┝糠绞绞┯靡呙纭?yōu)選以多次 劑量方式施用。
本發(fā)明的組合物可以通過包括以下步驟的方法制備
(a) 在宿主細(xì)胞中表達(dá)沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋 白的片段p83/30，
(b) 在宿主細(xì)胞中表達(dá)沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gpl術(shù)MSP-1蛋 白的片段p38/42，
(c) 從宿主細(xì)胞中回收片段p83/30和片段p38/42，
(d) 非必需地組合片段p83/30和p38/42，和
(e) 純化該組合的片段。
片段p83/30和p38/42的表達(dá)可以在單一宿主細(xì)胞中進(jìn)行或者分別在第 一宿主細(xì)胞中和第二宿主細(xì)胞中進(jìn)行。優(yōu)選利用分開的第一和第二宿主細(xì)胞。 可以通過使用編碼各自的MSP-1片段的核酸轉(zhuǎn)染提供宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，編 碼p83/30片段的核酸與編碼p38/42片段的核酸可以位于適合各自宿主細(xì)胞 (例如，如大腸桿菌細(xì)胞的革蘭氏陰性菌細(xì)胞)的表達(dá)載體上。表達(dá)載體可為 如質(zhì)粒的附加型載體或者染色體整合型載體。表達(dá)載體包含與適合的表達(dá)控 制序列操作連接的核酸，例如，表達(dá)載體可以包含組成型或誘導(dǎo)型啟動子。 表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含例如復(fù)制起點、選擇標(biāo)記等的遺傳成分。在 Sambrook等人的《Molecular Cloning, A Laboratory Ma腿l》((1989), Cold
9Spring Harbor Laboratory Press)和其它標(biāo)準(zhǔn)教科書中披露了適合表達(dá)載4本的 實例。
當(dāng)宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)時，優(yōu)選將所述片段表達(dá)成 不溶的形式，例如作為包函體。優(yōu)選地，以包函體的形式分別回收所述片段， 可以將這些包函體分別溶解(例如在如鹽酸胍的離液序列高的鹽的存在下)而 后重折疊(例如在精氨酸和如谷胱甘肽的巰基試劑的存在下)。或者，P83/30 和p38/42片段可以在溶解之前、溶解之后或者重折疊之后以適當(dāng)摩爾比進(jìn)行 組合。在重折疊之后，將所述片段轉(zhuǎn)移到適合的緩沖液中，該緩沖液可以包 含如吐溫80、吐溫20或Triton X-100的非離子表面活性劑。如需要，可以 通過后續(xù)的處理步驟分別純化所述片段，所述處理步驟包括下列步驟的至少 一個過濾、陰離子和/或陽離子交換層析(例如Q-瓊脂糖凝膠HP-層析或SP-瓊脂糖凝膠HP-層析)、調(diào)節(jié)和濃縮(例如通過超濾)。
根據(jù)步驟(d)，組合所述片段。優(yōu)選地，以如上所述的大約等摩爾的量組 合所述片段。各個片段的量可以通過蛋白分光測量而測定，例如，通過在280 nm測定UV吸收。特別優(yōu)選的是，在沒有如白蛋白的異源多肽存在的情況下 組合所述片段。
在組合之后，例如，通過尺寸排阻色譜法(例如使用Sephacryl (聚丙烯酰 胺葡聚糖)S 300-HR/GE)，可以進(jìn)一步純化所述片段。進(jìn)一步的處理可包括 過濾、濃縮和滅菌(例如通過無菌過濾)。
與如在WO 98/14583 (該篇文獻(xiàn)在此通過引用方式并入本申請)中所述 的野生型序列相比，編碼片段p83/30和片段p38/42的核酸可以具有減少的 AT含量。
此外，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含源自瘧原蟲屬F株的gpl90/MSP-l 蛋白的純化片段p83/30。 p83/30片段優(yōu)選包含如SEQIDNO:l中所示的序列 或者如上所述的修飾序列。這種組合物優(yōu)選用作藥物制劑，例如用作如上所
10述的疫苗。關(guān)于這種組合物的優(yōu)選特性(例如純度和/或降解產(chǎn)物含量)，參照 如上所述公開的內(nèi)容。
具體實施例方式
通過以下實施例詳細(xì)說明本發(fā)明 實施例l
p83/30片段的制備
p83/30片段的氨基酸序列示于SEQ ID N0:1 (F株)或SEQ ID NO:2 (D
株)。將編碼該片段的核酸序列克隆到

圖1中所示的表達(dá)載體pZE23D 83/30 中。將該片段編碼核酸與IPTG可誘導(dǎo)的pAllacOl啟動子操作連接。大腸桿 菌生產(chǎn)菌株為W3110Z2(例如Bacteriol. Ref. 36, (1972), 525-530; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 7069-7072)。
在LB培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。用Superbroth(超級肉湯)將預(yù)培養(yǎng) 物稀釋1:50并且在37。C于發(fā)酵罐中培養(yǎng)。在光密度(OD6oo)為1.5時，加入強(qiáng) 力霉素(200 ng/ml)。在OD麵=4.5時，加入IPTG (1 mM)。
在用IPTG誘導(dǎo)后2.5 h或者在OD6Q() = 7時，收集細(xì)胞。
通過在10 1/h的周轉(zhuǎn)率和1500巴最高壓力(Niro-Soavi， Type Panda)下連 續(xù)均化作用使收集的細(xì)菌破碎。在6000g離心勻漿30min，接著進(jìn)行兩個洗 滌/離心循環(huán)以得到包函體。
圖2比較了來自D株與F株的p83/30片段的包函體的穩(wěn)定性。圖中的
泳道如下
1+9:標(biāo)記物；
2: F-83/30的發(fā)酵樣品；
3:制備后的IBF-83/30;
4:牛血清白蛋白(BSA) 800ng;
5: BSA600 ng;6: BSA400ng;7: BSA200ng;8: BSA畫ng;
10: IBF-83/30 (在-18。C忙藏9個月之后)；11: IB D-83/30 (制備后)；12: F-83/30的發(fā)酵樣品；13: D-83/30的發(fā)酵樣品。
從圖2中明顯看出，惡性瘧原蟲F株的p83/30片段明顯比來自D株的相應(yīng)p83/30片段更加穩(wěn)定。實施例2
p38/42片段的制備
p38/42片段的氨基酸序列示于SEQ ID N0:3 (F株)或SEQ ID NO:4 (D株)。
以用于p83/30片段的實施例1中描述的基本相同的方式制備p38/42片段的包函體。實施例3
包含等摩爾量的p83/30和p38/42片段的組合物的制備通過向包函體(IB)中加入溶解緩沖液(6 M鹽酸胍，50 mM磷酸鈉，10 mM
二硫蘇糖醇，1 mMEDTA， pH 8.0)來分別溶解在實施例1和2中得到的包函體。
對于p83/30片段，使用三種不同的IB與溶解緩沖液比例，即1 g IB + 2.5ml緩沖液、1 g IB + 4.0 ml緩沖液和1 g IB + 8.0 ml緩沖液。對于p38Z40片段，向2.5ml緩沖液中加入lgIB。通過在室溫下在500 mM精氨酸、50mM磷酸鈉、lmM還原的L-谷胱甘肽、0.1 mM氧化的谷胱甘肽、1 mMEDTApH 8.0中培養(yǎng)過夜而對濾液進(jìn)行重折疊處理。
通過超濾將所得的蛋白溶液濃縮5倍。用20mM磷酸鈉、50mMNaCl、0.01%吐溫80 、pH8.0的緩沖液更換緩沖液。在用0.2nm過濾器過濾之后，使產(chǎn)物經(jīng)過Q-瓊脂糖凝膠HP層析。用緩沖液A (20 mM磷酸鈉，50 mM NaCl，0.01%吐溫80， pH8.0)和緩沖液B (20mM磷酸鈉，350 mMNaCl， 0.01%吐溫80， pH 8.0)的0 100%的梯度進(jìn)行洗脫。
通過在稀釋緩沖液(10mM磷酸鈉，0.01%吐溫80， pH5.8)中稀釋1:5調(diào)節(jié)洗脫物并且通過0.2 pm過濾器過濾。使生成的產(chǎn)物經(jīng)過SP瓊脂糖凝膠HP層析并且用緩沖液A(IO mM磷酸鈉，50 mMNaCl, 0.01%吐溫80, pH 5.8)和緩沖液B (10 mM磷酸鈉，600 mM NaCl， 0.01%吐溫80, pH 5.8)的0 100%的梯度進(jìn)行洗脫。隨后，將pH調(diào)節(jié)至7.4。
通過超濾將蛋白溶液濃縮至4mg/ml。然后，在沒有異源多肽的存在下，將兩種亞單位以1:1的比例(基于在280 nm用UV測量的蛋白總量)合并。在過濾之后，使組合物經(jīng)過尺寸排阻色譜，例如，在pH7.2 7.4的lxPBS緩沖液中采用Sephacryl-S-300HR/GE。為了提供高達(dá)1 mg蛋白/ml的濃度，非必需地通過超濾濃縮組合物。在無菌過濾之后，儲存該組合物。
權(quán)利要求
1、一種組合物，其包含(a)沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gp190/MSP-1蛋白的純化片段p83/30；和(b)沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gp190/MSP-1蛋白的純化片段p38/42。
2、 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，成分(a)為來自瘧原蟲屬F株的 p83/30片段。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，成分(b)為來自瘧原蟲屬F 株的p38/42片段。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中，成分(b)為來自例如D株的 瘧原蟲屬異株的p38/42片段。
5、 如權(quán)利要求1 4中任一項所述的組合物，其中，成分(a)和(b)以大約等摩爾的量存在。
6、 如權(quán)利要求1 5中任一項所述的組合物，其中，成分(a)和(b)為重組多肽。
7、 如權(quán)利要求1 6中任一項所述的組合物，該組合物的純度為至少 95%，優(yōu)選至少97.5%。
8、 如權(quán)利要求1 7中任一項所述的組合物，該組合物的降解產(chǎn)物的含 量小于30%，優(yōu)選小于20%。
9、 一種藥物制劑，其包含權(quán)利要求1 8中任一項所述的組合物和可藥 用載體、稀釋劑和/或佐劑。
10、 如權(quán)利要求6所述的藥物制劑，該藥物制劑為疫苗。
11、 一種制備權(quán)利要求1 9中任一項所述的組合物的方法，其包括如下 步驟(a) 在宿主細(xì)胞中表達(dá)沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋 白的片段p83/30，(b) 在宿主細(xì)胞中表達(dá)沒有異源序列的來自瘧原蟲屬的gpl90/MSP-l蛋 白的片段p38/42，(c) 從宿主細(xì)胞中回收片段p83/30和片段p38/42，(d) 非必需地組合片段p83/30和p38/42，和(e) 純化該組合的片段。
12、 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，使片段p83/30和p38/42在相同的宿主細(xì)胞中表達(dá)。
13、 如權(quán)利要求11所述的方法，其中，使片段p83/30和p38/42在不同的第一和第二宿主細(xì)胞中表達(dá)。
14、 如權(quán)利要求11 13中任一項所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞為細(xì) 菌細(xì)胞，優(yōu)選革蘭氏陰性菌細(xì)胞，更優(yōu)選大腸桿菌細(xì)胞。
15、 如權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌W3110Z2細(xì)胞。
16、 如權(quán)利要求11和13 15中任一項所述的方法，其中，所述片段以 包函體的形式被分別回收。
17、 如權(quán)利要求11和13 16中任一項所述的方法，其中，分別溶解所 述包函體。
18、 如權(quán)利要求11和13 17中任一項所述的方法，其中，分別重折疊 所述溶解片段。
19、 如權(quán)利要求11 18中任一項所述的方法，其中，以大約等摩爾的量 組合所述片段。
20、 如權(quán)利要求11 19中任一項所述的方法，其中，通過尺寸排阻色譜 法純化所述組合的片段。
21、 一種組合物，其包含來自瘧原蟲屬F株的gpl90/MSP-l蛋白的純化 片段p83/30。
22、 如權(quán)利要求21所述的組合物，其中，所述片段不包含異源序列。
23、 一種藥物制劑，其包含權(quán)利要求21或22中任一項所述的組合物和 可藥用載體、稀釋劑和/或佐劑。
24、 如權(quán)利要求23所述的制劑，該制劑為疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組瘧疾疫苗及其制備方法。
文檔編號C07K14/445GK101636409SQ200880002291
公開日2010年1月27日 申請日期2008年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月15日
發(fā)明者烏特·沃爾比爾, 克里斯琴·埃普, 克里斯琴·考思, 羅爾夫·盧茨, 赫爾曼·比雅爾 申請人:赫爾曼·比雅爾