本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒1型(Herpes simplex virus，HSV-1)和單純皰疹病毒2型(Herpes simplex virus，HSV-2)屬于皰疹科病毒，HSV-1和HSV-2不僅引起口唇或生殖粘膜皰疹，同時也是引起腦炎、肝炎、全身嚴(yán)重感染甚至宮內(nèi)感染的重要病原。
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus，RSV)主要引起呼吸系統(tǒng)感染，在嬰幼兒、老年以及免疫缺陷人群引起嚴(yán)重肺炎，是人類上呼吸道感染的重要病原之一。
甲型流感病毒(Influenza A virus，F(xiàn)lu-A)屬于正粘科病毒，在人類和其他生物每年都有小范圍的流行，引起上呼吸系統(tǒng)感染。大流行時，可引起嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)感染，甚者引起肺炎、腦炎甚至死亡。
上述三種病毒的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的化合物，我們對化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物，并對該組合物抗病毒活性進(jìn)行了評價，其具有抗病毒活性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45％和55％。
本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
藥效學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗病毒作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的鹽具有同樣的藥效。
組合物的體外實驗表明，組合物具有很強(qiáng)的抗HSV-1、HSV-2、RSV和flu A的活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗病毒藥物。
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具 體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
具體實施方式
實施例1化合物Schiglautone A的制備
化合物Schiglautone A(I)的制備方法參照Fan-Yu Meng等人發(fā)表的文獻(xiàn)(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011)1502–1505)的方法。
實施例2Schiglautone A的O-溴乙基衍生物(II)的合成
將化合物I(502mg，1.00mmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(7.520g，40.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?5攝氏度攪拌8h。8h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然后對有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(508mg，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.40(s,1H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.53(s,1H),3.85(d,J＝11.2Hz,4H),3.52(d,J＝10.8Hz,4H),2.96(s,1H),2.20(s,1H),2.16(s,2H),2.00(s,1H),1.84(d,J＝13.9Hz,4H),1.69(s,1H),1.58(dd,J＝22.2,8.5Hz,4H),1.51(s,1H),1.47(s,1H),1.26(dd,J＝9.1,4.4Hz,4H),1.21(s,1H),1.08–0.98(m,4H),0.96-0.94(m,9H),0.94-0.85(m,6H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.46(s),209.14(s),170.06(s),161.12(s),143.51(s),132.01(s),127.77(s),85.96(s),82.40(s),70.19(s),69.10(s),57.14(s),52.73(s),51.90(s),45.77(s),40.67(s),38.57(s),38.32(s),35.04(s),33.55(s), 33.27(s),29.85(s),28.98(s),26.71(s),25.50(s),24.05(s),22.31(s),21.06(s),20.56(s),20.00(s),18.69(s),18.11(s),15.07(s).
HRMS(ESI)m/z[M-H]-calcd for C34H51Br2O6:715.2032；found 715.2027.
實施例3Schiglautone A的O-(三唑基)乙基衍生物(III)的合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于10mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和1,2,3-三氮唑(2760mg，40mmol)，混合物加熱回流3h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶即得到化合物III的黃色膠狀固體(245.7mg,71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ18.00(s,1H),7.96(d,J＝15.5Hz,2H),7.67(d,J＝20.5Hz,2H),6.10(s,1H),5.63(s,1H),5.33(s,1H),4.29(d,J＝19.8Hz,2H),4.08(d,J＝4.0Hz,2H),3.83(d,J＝4.8Hz,4H),3.47(s,1H),2.39(d,J＝2.9Hz,3H),2.16(s,1H),1.84(d,J＝0.5Hz,4H),1.68–1.61(m,3H),1.61–1.50(m,3H),1.46(s,1H),1.39(d,J＝11.0Hz,2H),1.30–1.21(m,2H),1.21(s,1H),1.05–0.70(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.62(s),209.42(s),170.24(s),161.39(s),143.68(s),137.15(s),132.19(s),128.04(s),120.80(s),86.24(s),82.58(s),66.14(s),65.60(s),57.43(s),52.89(s),52.18(s),46.47(s),46.06(s),40.83(s),38.85(s),38.50(s),35.31(s),33.72(s),30.12(s),29.15(s),27.00(s),25.66(s),24.33(s),22.49(s),21.33(s),20.73(s),20.29(s),18.85(s),18.39(s),15.25(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C38H57N6O6:693.4340；found:693.4338。
實施例4Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物的合成
1、Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的合成
將化合物II(358mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈，加入無水碳酸鉀(0.345g，2.5mmol)，碘化鉀(0.084g，0.5mmol)和二乙醇胺(1.0514g，10mmol)，混合物加熱回流9h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冷水中，用二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑。產(chǎn)物用硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物的淡黃色固體(0.199g,52％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ17.77(s,1H),6.00(s,1H),5.40(s,1H),5.20(s,1H),3.37(d,J＝17.8Hz,4H),3.28(s,8H),2.87(s,1H),2.51(d,J＝6.5Hz,4H),2.43(s,8H),2.24(s,2H),2.06(d,J＝12.7Hz,2H),1.76–1.68(m,5H),1.57(s,1H),1.53–1.39(m,8H),1.36(s,1H),1.24(s,1H),1.20–1.14(m,3H),1.11(s,1H),0.94–0.82(m,10H),0.80(s,3H),0.76(s,3H),0.72(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.39(s),208.98(s),169.80(s),160.73(s),143.02(s),131.42(s),127.05(s),85.91(s),82.25(s),66.70(s),65.63(s),58.62(s),56.55(s),56.61(s),53.30(s),52.45(s),51.52(s),45.29(s),40.06(s),38.52(s),38.17(s),34.73(s),33.17(s),29.35(s),28.38(s),26.34(s),25.00(s),23.45(s),22.05(s),20.67(s),20.07(s),19.31(s),18.41(s),17.73(s),14.59(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H73N2O10:765.5265；found:765.5261。
Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物
2、Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的合成
按照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物，取Schiglautone A的O-(二羥乙胺基)乙基衍生物(382mg，0.5mmol)溶于8mL氯仿，逐滴加入氯化亞砜(0.238g，2mmol)，反應(yīng)物加熱回流2h。將反應(yīng)物冷卻至室溫，滴加甲醇分解過量的氯化亞砜，減壓濃縮除去溶劑。產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化(石油醚/丙酮100:1，v/v)，得到Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物的淡黃色膠狀固體(0.297g，71％)。
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.87(s,1H),6.01(s,1H),5.50(d,J＝8.4Hz,2H),3.61(s,4H),3.55(s,4H),3.45(s,2H),3.40(s,2H),2.98(s,1H),2.73(d,J＝17.4Hz,4H),2.67–2.57(m,6H),2.54(s,2H),2.40(s,1H),2.10(s,1H),1.99(s,2H),1.78(s,1H),1.73(d,J＝16.9Hz,4H),1.58(d,J＝3.0Hz,2H),1.46(d,J＝3.0Hz,2H),1.43(s,1H),1.37(s,1H),1.22(s,1H),1.17(dd,J＝18.9,11.1Hz,4H),0.95–0.83(m,10H),0.80(d,J＝20.0Hz,3H),0.78(d,J＝20.0Hz,3H),0.73(d,J＝20.0Hz,3H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.19(s),208.87(s),169.79(s),160.85(s),143.24(s),131.74(s),127.50(s),85.69(s),82.13(s),66.71(s),65.84(s),56.87(s),55.80(s),53.19(s),52.44(s),51.64(s),45.51(s),40.38(s),39.22(s),38.30(s),38.05(s),34.77(s),33.28(s),29.56(s),28.72(s),26.45(s),25.21(s),23.79(s),22.05(s),20.77(s),20.30(s),19.76(s),18.41(s),17.85(s),14.81(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C42H69Cl4N2O6:839.3880；found:839.3881。
Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物
3、Schiglautone A的O-(二(2-甲硫基乙基)胺基)乙基衍生物(IV)的合成
按照上述步驟制備1g的Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物，將Schiglautone A的O-(二氯乙胺基)乙基衍生物(0.419g，0.5mmol)溶于15mL乙醇，室溫下加入甲硫醇鈉(0.21g，3mmol)，反應(yīng)物加熱回流3h。減壓濃縮除去溶劑，所得產(chǎn)物用硅膠柱層析進(jìn)行純化(石油醚/丙酮100:0.2，v/v)，得到黃色固體物，即化合物IV(0.296g，67％)。
1H NMR(500MHz,Chloroform-d1)δ13.21(s,1H),6.02(s,1H),5.48(s,1H),5.44(s,1H),3.45(s,2H),3.38(s,2H),3.00(s,1H),2.57–2.48(m,20H),2.16–2.09(m,4H),1.96(s,12H),1.73(d,J＝15.4Hz,4H),1.55(s,1H),1.44(dd,J＝7.8,2.8Hz,4H),1.35(s,1H),1.29–1.14(m,6H),0.97–0.49(m,19H).
13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ211.72(s),209.42(s),170.36(s),161.38(s),143.79(s),132.31(s),128.03(s),86.24(s),82.70(s),67.24(s),66.39(s),57.44(s),53.73(s),53.00(s),52.69(s),52.17(s),46.06(s),40.95(s),38.84(s),38.61(s),35.32(s),33.82(s),32.41(s),30.13(s),29.25(s),27.00(s),25.77(s),24.34(s),22.59(s),21.33(s),20.85(s),20.28(s),18.96(s),18.40(s),15.35(s),15.03(s).
HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C46H81N2O6S4+:885.4977；found:885.4979。
實施例5組合物抗病毒活性
(一)實驗例：組合物對皰疹病毒的作用研究：
(1)細(xì)胞株與病毒株：
人胚腎細(xì)胞(HEK293，為HSV-1、HSV-2病毒敏感細(xì)胞)購自美國Clontech公司；單純皰疹病毒1型(HSV-1)Sm44株、單純皰癥病毒2型(HSV-2)333株引自中國CDC病毒病研究所。
(2)細(xì)胞毒性測定：
組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的45mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的55mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。
參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008；24(1)：25～27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋(20～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔(A、B、C行)，平行設(shè)微孔板D的1～6孔為細(xì)胞對照，7～12孔不接種細(xì)胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細(xì)胞對照組OD值 相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度(TD50)。
(4)抑毒試驗：
參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序(2-3～-14)橫向接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1～12作為細(xì)胞對照。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
(5)結(jié)果：
①樣品TD50的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化合物III和化合物IV的TD50在HEK293分別為2-2.79、2-2.13、2-2.68。
②抑毒實驗：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HSV-1、HSV-2病毒對照組分別在第3d、3d出現(xiàn)90％以上的CPE，HSV 1和HSV 2在HEK293CPE則以腫脹、多細(xì)胞融合(HSV 1致多個細(xì)胞融和成大泡，而HSV 2致融合為小泡)、變圓、脫落為主要特征。
而組合物抑毒試驗各組細(xì)胞，按照組合物樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE：HSV 1-HEK293在第10稀釋度之前、HSV 2-HEK293組在第9稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-4～-6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得組合物的TI：抑制HSV-1、HSV-2在HEK293細(xì)胞發(fā)生CPE，IC50分別為2-12.14、2-12.23，TI分別為652.6、694.6。化合物III的TI：對應(yīng)的IC50分別為2-4.91、2-4.85，TI分別為6.9、6.6。化合物IV的TI：對應(yīng)的IC50分別為2-5.12、 2-4.36，TI分別為5.4、3.2。
結(jié)論：組合物具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-1、HEV-2)的作用，而且安全性高，因此組合物在治療皰疹病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景。化合物III和化合物IV不具有顯著的抗皰疹科病毒(包括HSV-1、HEV-2)的作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療皰疹病毒感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
(二)實驗例：組合物對呼吸道合胞病毒(RSV)的作用研究
(1)組合物、化合物III和化合物IV的配置：將藥物溶于細(xì)胞維持液(含2％新生牛血清的MEM，GIBICO公司產(chǎn)品)中備用。
(2)細(xì)胞株與病毒株：
人胚腎細(xì)胞(HEK293，RSV病毒敏感細(xì)胞)購自美國Clontech公司；呼吸道合胞病毒(RSV)Long株引自中國CDC病毒病研究所。
(3)細(xì)胞毒性測定：
參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品以2倍比做系列稀釋(20～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的HEK293上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔(A、B、C行)，平行設(shè)微孔板D的1～6孔為細(xì)胞對照，7～12孔不接種細(xì)胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細(xì)胞對照組OD值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度(TD50)。
(4)抑毒試驗：
參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序(2-2～-13)橫向接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL 作為試驗組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1～12作為細(xì)胞對照。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
(5)結(jié)果：
①樣品TD50的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化合物III和化合物IV對HEK293的TD50分別為2-2.33、2-2.17、2-2.82。
②抑毒實驗：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在第2d出現(xiàn)90％以上的CPE，RSV在HEK293CPE以折光性增強(qiáng)、變圓、脫落、破碎為主要特征。
而組合物抑毒試驗各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE：
RSV-HEK293試驗組細(xì)胞在第9稀釋度之前，細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-4～-6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得TI：組合物抑制RSV在HEK293細(xì)胞發(fā)生CPE，IC50為2-12.61，TI為1243.3；化合物III的IC50為2-4.54，TI為5.2；化合物IV的IC50為2-4.28，TI為2.8。
結(jié)論：組合物具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，可以用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。化合物III和化合物IV無顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，不可以用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物。
(三)實驗例：組合物對甲型流感病毒的作用研究：
(1)細(xì)胞株與病毒株：狗腎細(xì)胞(MDCK，流感病毒敏感細(xì)胞)引自中國CDC病毒病研究所；流感病毒甲型(Flu A)1995.AII：32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。
(2)細(xì)胞毒性測定：
參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008；24(1)：25～27)的方法，將各樣品以2倍比做系列稀釋(2-1～-5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)3孔(A、B、C行)，平行設(shè)微孔板D的1～6孔為細(xì)胞對照，7～12孔不接種細(xì)胞為空白對照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7d，中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組與細(xì)胞對照組OD值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度(TD50)。
(3)抑毒試驗：
參照文獻(xiàn)(汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008；24(1)：25～27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔100uL，每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個TCID50的病毒100uL作為試驗組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1～12作為細(xì)胞對照。37℃、5％CO2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90％以上CPE時，加1％中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540nm波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度(IC50)，最終將TD50和IC50相比獲得抑毒指數(shù)(TI)。
(4)結(jié)果：
①樣品TD50的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物、化合物III和化合物IV對的TD50在MDCK分別為2-1.16、2-2.25、2-2.78。
②抑毒實驗：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lu A在MDCK CPE以折光性增強(qiáng)、壞死、破碎為主要特征。
而組合物抑毒試驗各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE：FluA-MDCK組細(xì)胞在第8稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度減少逐漸加重。
而化合物III和化合物IV處理組在2-4～-6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
將上述實驗板用1％中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對照組A值后，各實驗組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得IC50，IC50與TD50相比獲得TI：組合物抑制Flu A在MDCK細(xì)胞發(fā)生CPE，IC50為2-12.46，TI為2521.4；化合物III的IC50為2-5.37，TI為8.7；化合物IV的IC50為2-5.18，TI為5.3。
結(jié)論：組合物對甲型流感病毒具有很強(qiáng)的抑制作用，而且安全，因此組合物在治療甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景?；衔颕II和化合物IV對甲型流感病毒沒有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III和化合物IV在治療甲型流感病毒感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。