本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
背景技術(shù)：
：骨質(zhì)疏松是一種全身性的、代謝性的骨疾病，其特征是骨量減少和丟失，骨脆性和骨折危險性增加。隨著人口的老齡化，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也隨著迅速增加，已經(jīng)成為危害人類健康的重要疾病，并給全球帶來了巨大的社會和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。盡管國內(nèi)外相關(guān)專家學(xué)者對此病的防治十分重視，但該病尚缺乏有效的治療藥物。目前臨床上常用的防治骨質(zhì)疏松的藥物包括雌激素替代藥物，雙膦酸鹽類，選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，維生素D，甲狀旁腺素和人重組甲狀旁腺激素(1-34)等。雙磷酸鹽類藥物雖然效果不錯，但可導(dǎo)致頜骨壞死、肌肉骨骼痛和腎功能衰竭等嚴(yán)重不良反應(yīng)；激素替代療法雖然是防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要方法，但長期使用有導(dǎo)致乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的潛在危險且發(fā)生血栓的風(fēng)險也增加；而選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可以使血栓性事件明顯增加。其他藥物或價格昂貴，或遠期療效不確切，均不夠理想。由于骨質(zhì)疏松是一種慢性病，需要長期服藥，因此價格便宜，毒副作用小的中草藥已成為研究治療骨質(zhì)疏松的熱點之一。骨質(zhì)疏松的治療目前已有的藥物存在毒性大、安全性低的問題，從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到高效低毒的潛在藥物有重要價值。本發(fā)明涉及的化合物I是一個2009年發(fā)表(PeiTangetal.,2009.Atropurpuran,anovelditerpenewithanunprecedentedpentacycliccageskeleton,fromAconitumhemsleyanumvar.atropurpureum.TetrahedronLetters50(2009)460–462)的化合物，我們對化合物I進行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗骨質(zhì)疏松活性進行了評價，其具有抗骨質(zhì)疏松活性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45％和55％。本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明提供組合物的抗骨質(zhì)疏松新用途。本發(fā)明通過體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)組合物在制備抗骨質(zhì)疏松藥物中的應(yīng)用。進一步，所述的骨質(zhì)疏松是由于雌激素缺乏導(dǎo)致。本發(fā)明通過體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)組合物有顯著的預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用。組合物能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強和骨質(zhì)破壞，同時可以提高血鈣濃度，有利于骨的沉積。是一種理想的防治骨質(zhì)疏松的藥物。以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。具體實施方式實施例1化合物Atropurpuran的制備化合物Atropurpuran(I)的制備方法參照PeiTang等人發(fā)表的文獻(PeiTangetal.,2009.Atropurpuran,anovelditerpenewithanunprecedentedpentacycliccageskeleton,fromAconitumhemsleyanumvar.atropurpureum.TetrahedronLetters50(2009)460–462)的方法。實施例2Atropurpuran的O-溴乙基衍生物(II)的合成將化合物I(312mg，1.00mmol)溶于10mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨(TBAB)(0.08g)，1,2-二溴乙烷(3.760g，20.00mmol)和6mL的50％氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏度攪拌6h。6h之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的黃色粉末(309mg，74％)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.86(s,1H),5.23(s,1H),4.87(s,1H),4.83(s,1H),4.39(s,1H),4.00(s,2H),3.91(s,1H),3.58(s,2H),3.01(s,1H),2.27(s,1H),2.15(d,J＝6.3Hz,2H),2.09–2.00(m,5H),1.78(dd,J＝35.2,19.2Hz,2H),1.71–1.65(m,1H),1.41(s,2H),0.99(s,3H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.55(s),203.16(s),150.94(s),125.16(s),111.66(s),78.63(s),71.39(s),57.77(s),47.73(s),40.79(s),34.58(s),33.01(s),32.69(s),29.25(s),29.34(s),26.52(s),24.23(s),22.30(s),20.64(s).HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcdforC22H28BrO3:419.1222；found419.1226.實施例3Atropurpuran的O-(四氫吡咯基)乙基衍生物(III)的合成將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于18mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和吡咯烷(1420mg，20mmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:1.0，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮即得到化合物III的棕色固體(125mg,61％)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.78(s,1H),5.15(s,1H),4.61(d,J＝10.5Hz,2H),4.45(s,1H),3.83(s,1H),3.53(s,2H),2.94(s,1H),2.62(s,2H),2.46(s,4H),2.20(s,1H),2.08(d,J＝6.0Hz,2H),2.00–1.91(m,3H),1.75(d,J＝2.1Hz,2H),1.69(s,2H),1.62(d,J＝5.5Hz,5H),1.30(s,2H),0.91(s,3H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.65(s),203.36(s),151.04(s),125.36(s),111.76(s),78.83(s),67.20(s),57.97(s),54.33(d,J＝17.1Hz),47.82(s),41.00(s),34.67(s),32.79(s),29.45(s),29.22(s),26.61(s),25.14(s),24.43(s),22.40(s),20.84(s).HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcdforC26H36NO3:410.2695；found:410.2699。實施例4Atropurpuran的O-(1H-四氮唑基)乙基衍生物的合成將化合物II(209mg，0.5mmol)溶于15mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg，2.5mmol)，碘化鉀(84mg，0.5mmol)和1H-四氮唑(1401mg，20mmol)，混合物加熱回流4h。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。因為互變異構(gòu)作用，在反應(yīng)條件下會生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產(chǎn)物。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.8，v/v)，收集黃色集中洗脫帶，再將洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化(流動相為：石油醚/丙酮＝100:0.4，v/v)，依次收集兩個淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個洗脫帶即得到化合物IV的黃色粉末(83.6mg,41％)。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.51(s,1H),9.74(s,1H),5.05(s,1H),4.61–4.48(m,3H),4.19(s,1H),4.12(s,1H),3.80(s,2H),3.75(s,1H),2.86(s,1H),2.08(s,1H),1.97(d,J＝2.9Hz,2H),1.90–1.81(m,3H),1.69–1.57(m,4H),1.54(s,1H),1.25(s,2H),0.80(s,3H).13CNMR(125MHz,DMSO-d6)δ208.46(s),203.17(s),150.83(s),144.83(s),125.18(s),111.56(s),78.65(s),66.57(s),57.79(s),47.63(s),46.37(s),40.80(s),34.49(s),32.59(s),29.27(s),29.02(s),26.43(s),24.24(s),22.21(s),20.67(s).HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcdforC23H29N4O3:409.2240；found:409.2244。實施例5組合物抗骨質(zhì)疏松作用的檢測1、材料與方法組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的45mg化合物III的粉末和研磨之后過200目網(wǎng)的55mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物，使用時用水溶解這100mg的組合物即得到組合物的溶液。將十周齡健康SD雌鼠(30只，江蘇省動物中心)隨機分成5組，每組6只：假手術(shù)組(Sham)、卵巢切除模型組(OVX)、組合物組、化合物III組和化合物IV組。飼養(yǎng)條件：溫度為(23±2)℃，光照:黑暗為12∶12。讓各組大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后開始骨質(zhì)疏松造模手術(shù)：各組大鼠均經(jīng)腹腔注射20％烏拉坦麻醉(6ml/kg體重)，Sham組開腹后關(guān)腹，其余兩組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。術(shù)后第4周起，Sham組和OVX組每天進食標(biāo)準(zhǔn)飼料和去離子水，組合物組、化合物III組和化合物IV組每天進食標(biāo)準(zhǔn)飼料和去離子水，同時分別灌胃給與組合物、化合物III和化合物IV10mg/kg，連續(xù)3個月，每周稱一次體重。實驗結(jié)束后，用烏拉坦麻醉，摘取眼球采血，2000r/min離心，吸取上清(即血清)。摘除大鼠子宮，迅速稱重。取出大鼠雙側(cè)股骨和雙側(cè)脛骨，剔除軟組織。兩脛骨經(jīng)800℃高溫爐(由南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供)中灰化8h，冷卻后稱灰重。用研缽碾碎成灰狀，取0.1g骨灰溶于1ml,6mol/l鹽酸中，測骨鈣和骨磷時取0.2ml用超純水稀釋至1ml，用全自動生化分析儀檢測骨鈣和骨磷含量。左股骨用骨密度儀測量骨密度(BMD)。血清生化指標(biāo)測定：取血清0.5ml，用全自動生化分析儀檢測血清堿性磷酸酶(ALP)、鈣(Ca)和磷(P)。2、結(jié)果(1)組合物對雙側(cè)卵巢切除大鼠血清ALP，血清Ca和血清P的的影響表1可以看出去卵巢后，模型組大鼠血清堿性磷酸酶活性增加。去卵巢后，體內(nèi)雌激素缺乏，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)化率增加，與絕經(jīng)后婦女的高轉(zhuǎn)化型骨質(zhì)疏松癥一致。給予組合物3個月后，堿性磷酸酶活性顯著下降，可見組合物可以抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率的增加，減少骨質(zhì)的破壞。表中還顯示與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清鈣明顯下降，而組合物可顯著提升血清鈣濃度。血清鈣是骨形成的重要標(biāo)記物，說明組合物可以有效逆轉(zhuǎn)由于卵巢切除導(dǎo)致的血清鈣的降低，有利于骨的形成。而化合物III和化合物IV沒有組合物的作用。表1組合物對雙側(cè)卵巢切除大鼠血清ALP，血清Ca和血清P的影響*P<0.05vsOVX組(2)組合物對雙側(cè)卵巢切除大鼠左股骨BMD的的影響表2可以看出去卵巢后模型組大鼠左股骨骨密度較假手術(shù)組顯著下降，給予組合物3個月后，骨密度顯著增加。而化合物III和化合物IV沒有此作用。表2組合物對雙側(cè)卵巢切除大鼠左股骨BMD的的影響實驗組別左股骨BMD(g/cm2)sham0.335OVX0.214組合物0.301*化合物III0.247化合物IV0.236*P<0.05vsOVX組(3)組合物對雙側(cè)卵巢切除大鼠雙側(cè)脛骨參數(shù)的影響表3可以看出與假手術(shù)組相比，模型組大鼠雙脛骨灰重顯著降低，而組合物組較模型組顯著升高。組合物也能顯著升高骨鈣和骨磷含量。而化合物III和化合物IV沒有此作用。表3組合物對雙側(cè)卵巢切除大鼠雙側(cè)脛骨參數(shù)的影響實驗組別雙脛骨骨鈣(g/g)雙脛骨骨磷(g/g)雙脛骨灰重(g)Sham0.2580.2930.83OVX0.2010.2180.42組合物0.247*0.264*0.88*化合物III0.2150.2270.69化合物IV0.2120.2110.61*P<0.05vsOVX組結(jié)論：組合物能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強和骨質(zhì)破壞，同時可以提高血鈣濃度，有利于骨的沉積。對于由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松具有防治作用，并且無雌激素樣副作用。組合物可以用于骨質(zhì)疏松的防治?；衔颕II和化合物IV不能夠抑制去卵巢引起的骨轉(zhuǎn)化率增強和骨質(zhì)破壞，不可以提高血鈣濃度，不利于骨的沉積，對于由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松不具有防治作用，不可以用于骨質(zhì)疏松的防治。實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。當(dāng)前第1頁1 2 3