本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種改變TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中表達的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

疼痛是伴隨實際或潛在組織損傷的不愉快的感覺和情緒體驗，可分為急性痛(acute pain)和慢性痛(chronic pain)。急性痛警示機體遠離傷害性刺激，有利生存。但長期存在的慢性痛，或持續(xù)性痛(persistent pain)，如炎性痛(關(guān)節(jié)炎)、神經(jīng)壓迫性疼痛(椎間盤突出/椎間孔狹窄)、癌性痛(癌癥本身或治療引發(fā)的疼痛)，不僅不利于生存，反而嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，甚至引發(fā)失眠、焦慮、抑郁和自殺。目前，急性痛的臨床治療效果很好，但病程反復(fù)、遷延不愈的慢性痛卻連現(xiàn)代醫(yī)學(xué)最強的鎮(zhèn)痛藥物——嗎啡類物質(zhì)都未必能取得長期理想的鎮(zhèn)痛效果，反而會帶來成癮、耐受、及自身痛敏等復(fù)雜的副作用。因此，探尋新的鎮(zhèn)痛機制和發(fā)現(xiàn)新的鎮(zhèn)痛策略對于攻克慢性痛，提高人類生活水平具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

催產(chǎn)素(oxytocin，OT)是生物體重要的內(nèi)源鎮(zhèn)痛激素。該物質(zhì)主要由下丘腦視上核(supraoptic nucleus，SON)和室旁核(paraventricular nucleus，PVN)內(nèi)的催產(chǎn)素神經(jīng)元合成和分泌。PVN和SON內(nèi)大細胞生成的催產(chǎn)素經(jīng)下丘腦垂體束到達垂體后葉釋放入血，在外周發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用；而PVN小細胞部的催產(chǎn)素神經(jīng)元軸突向中樞廣泛區(qū)域，如腦干和脊髓投射，激活內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)或抑制脊髓傷害性信息的上行傳遞而發(fā)揮中樞鎮(zhèn)痛作用。催產(chǎn)素系統(tǒng)的另一大特點是對焦慮、抑郁、社交障礙等與慢性痛伴隨的負性情緒和認知障礙具有抑制作用，因此被譽為一種多潛力、多功能的綜合性疼痛治療物質(zhì)。疼痛刺激會誘發(fā)催產(chǎn)素合成和分泌增多，通過機體可塑性變化調(diào)節(jié)來抗衡痛信號。催產(chǎn)素的臨床應(yīng)用研究目前已通過美國食品和藥品管理局許可進入I期試驗，且對身體主要系統(tǒng)沒有明顯的副作用，顯示出該物質(zhì)在痛與鎮(zhèn)痛應(yīng)用領(lǐng)域的強大生命力。但催產(chǎn)素是一種短肽，不能越過血腦屏障，必須鞘內(nèi)或經(jīng)鼻給藥，而這兩種給藥方式都會帶來潛在的副作用。鞘內(nèi)置管，因要手術(shù)插管，患者不易接受，且為后續(xù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染埋下隱患。經(jīng)鼻吸入給藥則會引發(fā)患者鼻腔不適，造成效果不穩(wěn)定。我們揭示了疼痛狀態(tài)下內(nèi)源性催產(chǎn)素神經(jīng)元表達TRPC6的特點，揭示其合成和釋放催產(chǎn)素的分子機制，不但是神經(jīng)內(nèi)分泌領(lǐng)域懸而未決的核心科學(xué)問題，也是新的鎮(zhèn)痛分子靶標(biāo)，有望獲益臨床應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種改變TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中表達的方法及其應(yīng)用。

其技術(shù)方案如下：

TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中的表達。

①慢性痛狀態(tài)下TRPC6的表達趨勢

a)RT-PCR法檢測TRPC6mRNA隨慢性痛時程的表達變化

組織的準(zhǔn)備：CFA炎性痛大鼠造模后12h、24h、48h、72h、96h、SNL模型大鼠造模后1d、3d、7d、14d、28d，吸入麻醉，冰上快速斷頭取腦，在視交叉前緣和灰結(jié)節(jié)之間(Bregma點后0.4-2.0間)做冠狀切片，緊鄰第三腦室上側(cè)和視束外側(cè)行“門”行修片，將修好的包含有全部視上核和室旁核的組織置于液氮中保存

RT-PCR檢測：取不同組的組織約1g，勻漿，提取總RNA，oligo(dT)做引物反轉(zhuǎn)錄總mRNA，TRPC6特異性引物擴增，分析TRPC6mRNA隨疼痛進程的表達趨勢，找出變化最明顯的時間點

b)Western blot法檢測TRPC6蛋白質(zhì)水平的表達變化

如上取視上核和室旁核組織，高速勻漿或超聲破碎，含2-巰基乙醇的載樣緩沖液中煮沸3-5min，離心取上清，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，TRPC6一抗，二抗孵育，ECL顯色，與PCR結(jié)果進行比對，找出蛋白質(zhì)變化最明顯的時間點

c)免疫組織化學(xué)法檢測TRPC6蛋白的表達變化

正常、假手術(shù)組和根據(jù)上述PCR和WB檢測后選擇出來的TRPC6表達變化最明顯的時間點疼痛大鼠，烏拉坦麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，浸糖過夜，取下丘腦和垂體行冰凍切片，切片分3套保存，一套行TRPC6免疫組化染色；一套行Nissl染色；一套行抗原吸收對照染色，比較視上核、室旁核及垂體內(nèi)TRPC6免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物的組間差別

d)表面生物素化反應(yīng)檢測TRPC6的上膜情況

假手術(shù)組和痛模型組大鼠吸入麻醉，斷頭取腦，下丘腦視交叉區(qū)震動切片(冠狀位，400μm)，通氧復(fù)蘇1h，輕柔修片摳出視上核和室旁核部位，膠原酶37℃恒溫消化20min，機械性吹打分離細胞，貼壁沉淀30min，換液后輕柔吹打成細胞懸液，加入sulfo-NHS-SS標(biāo)記的生物素4℃孵育45min，加入氨基乙酸去除多余的生物素，裂解液裂解細胞，蛋白定量，取1mg蛋白加入鏈酶親和素瓊脂糖制劑4℃過夜，洗提樣本，70℃30min處理樣本，SDS-PA6E，用TRPC6抗體行Western blot，比較TRPC6分子在疼痛狀態(tài)下的膜定位變化情況

e)免疫電鏡術(shù)檢測TRPC6在亞細胞水平的分布

正常和疼痛大鼠，灌注固定取腦，震動切片，冰凍保護液孵育后行液氮凍融，20％正常羊血清封閉，TRPC6、催產(chǎn)素一抗孵育，納米金標(biāo)記TRPC6，ABC-DAB法呈色催產(chǎn)素，鋨酸后固定，醋酸雙氧鈾染色，梯度酒精脫水，環(huán)氧丙烷脫脂后平板包埋，取下SON、PVN及垂體后葉，超薄切片，電鏡下尋找金標(biāo)顆粒和DAB呈色產(chǎn)物，分析TRPC6的亞細胞分布及其和催產(chǎn)素囊泡的定位關(guān)系

②α1受體與TRPC6的共存情況

a)免疫熒光多重染色

正常成年SD大鼠、痛模型動物(痛敏最明顯的時間點)，4％多聚甲醛常規(guī)灌注固定，下丘腦冰凍切片，免疫熒光雙標(biāo)或三標(biāo)染色(TRPC6、腎上腺素能α1受體和催產(chǎn)素)，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照，觀察α1受體與TRPC6和催產(chǎn)素的共存情況及共存率

b)Western blot驗證代謝型受體的動態(tài)變化情況

如①a)取上述大鼠的視上核和室旁核組織，高速勻漿或超聲破碎，含2-巰基乙醇的載樣緩沖液中煮沸3-5min，離心取上清，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，α1受體一抗、二抗孵育，ECL顯色，分析α1受體隨疼痛時程的表達情況，比對α1受體和TRPC6表達趨勢的異同。

進一步，所述下丘腦片厚為25μm，垂體片厚為15μm。

進一步，所述震動切片的片厚為50μm。

進一步，所述超薄切片的片厚為70nm。

進一步，所述下丘腦冰凍切片的片厚為30μm。

進一步，通過TRPC6的激動劑刺激其表達水平，進而提高催產(chǎn)素的表達而鎮(zhèn)痛。

進一步，所述的TRPC6的激動劑為貫葉金絲桃素，所述激動劑能刺激機體催產(chǎn)素神經(jīng)元高表達TRPC6。

所述的TRPC6的激動劑可以為類似貫葉金絲桃素功效的其它激動劑，可以刺激TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中的表達增高。

進一步，所采用基因表達調(diào)控的方法，促進TRPC6的表達升高。

進一步，所述刺激TRPC6的表達促進催產(chǎn)素水平升高能鎮(zhèn)痛，相應(yīng)降低TRPC6的表達抑制催產(chǎn)素水平升高能增加疼痛，使用TRPC6的抑制劑能抑制TRPC6的表達而增強疼痛。

進一步，所述抑制劑為ML-9。

本發(fā)明改變TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中表達的方法在鎮(zhèn)痛過程中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明利用激動劑貫葉金絲桃素通過調(diào)控TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中的表達而鎮(zhèn)痛的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為痛與鎮(zhèn)痛的研究提供新的分子靶標(biāo)，也為闡明神經(jīng)內(nèi)分泌神經(jīng)元體系的工作原理、進一步揭示TRPC6的在體生理病理功能提供理論支持。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

TRPC6通道功能對動物痛行為和催產(chǎn)素水平的影響

a)一次性給藥

預(yù)先腦區(qū)內(nèi)定位置管的痛模型動物(選取TRPC6表達變化幅度最為明顯的時間點)，檢測前或檢測中分別給予貫葉金絲桃素20μM、OAG 100μM、苯腎上腺素100μM、醋酸落葉松酯1μM、哌唑嗪1μM(均為既往研究有效濃度)或生理鹽水各1μl(可以嘗試不同的濃度劑量組合)，觀察對動物機械性痛敏和熱痛敏的影響，小腦延髓池收集腦脊液/并行尾靜脈取血，凍于-80℃冰箱待用(此部分實驗可以進行交叉配伍，如將α1受體的激動劑和TRPC6的抑制劑相配伍行共給藥，衡量α1受體和TRPC6之間的關(guān)系)。

b)多次給藥

在第一天給藥之后，連續(xù)7天同一時間同一劑量給藥，行為學(xué)檢測觀察藥物是否具有累加效應(yīng)，第7天后收集腦脊液及尾靜脈取血用作后續(xù)檢測。

c)放免檢測

取上述收集的人工腦脊液和外周血(經(jīng)離心取血清)，放免法檢測樣本中催產(chǎn)素的濃度，分析TRPC6激活與否對催產(chǎn)素中樞釋放和外周釋放的影響。(此部分行為藥理干預(yù)導(dǎo)致的對催產(chǎn)素神經(jīng)元功能的影響可以和第三、第四部分分子生物學(xué)手段干預(yù)的影響合起來分析)。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，本發(fā)明的保護范圍不限于此，TRPC6的激動劑可以為類似貫葉金絲桃素功效的其它激動劑，可以刺激TRPC6在催產(chǎn)素神經(jīng)元中的表達增高。任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見地得到的技術(shù)方案的簡單變化或等效替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。