本發(fā)明涉及抗癌藥物靶向傳遞技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子及其制備方法。

背景技術(shù)：

當(dāng)今社會由于環(huán)境污染、食品安全問題以及不健康生活方式等因素的影響，使得癌癥的發(fā)病率正在逐年上升，而治療方法的不完善使得癌癥的死亡率居高不下。雖然近幾年來免疫療法、基因療法等新興治療方法被科學(xué)家開發(fā)出來，有的已經(jīng)進(jìn)入到了臨床試驗(yàn)，但是這些方法真正進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用還有很長的路要走，目前對于癌癥的治療手段還僅限于手術(shù)、放療和化療這些傳統(tǒng)療法。其中化療方法是術(shù)后最常用的腫瘤抑制方法，但是其強(qiáng)烈的毒副作用帶給患者很大的痛苦。因此若干新型靶向藥物傳遞體系被開發(fā)出來并投入臨床應(yīng)用，展現(xiàn)出了良好的靶向治療效果和更低的毒副作用，而臨床上對于這類新型靶向傳遞不同藥物的傳遞體系的需求還是十分強(qiáng)烈的。喜樹堿是一類十分常見的廣譜臨床化療藥物，對于治療結(jié)腸癌、胃癌、頭頸部癌有很好的療效，但是其毒副作用也是十分強(qiáng)烈的，包括神經(jīng)毒性、肝腎毒性和骨髓抑制等。此外，其不良的溶解性能也大大限制了它的應(yīng)用范圍，喜樹堿不光不溶于水，也不溶于絕大部分的有機(jī)溶劑。故而一系列喜樹堿衍生物包括10-羥基喜樹堿、伊立替康、拓?fù)涮婵当缓铣沙鰜碛靡蕴岣咚幬锘钚院驮黾铀幬锏挠袡C(jī)溶劑溶解度。除此之外，喜樹堿及其衍生物在堿性水溶液條件下會水解開環(huán)繼而失活，這也是讓醫(yī)藥工作者十分頭疼的問題。因此，設(shè)計和構(gòu)筑這樣一種既有靶向功能、溶于水環(huán)境而又不會被水解，同時能夠在病灶內(nèi)進(jìn)行酶促藥物釋放的喜樹堿藥物傳遞體系就變的意義重大了。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)分析和存在問題，提供一種靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子及其制備方法，該納米粒子能夠大大增加喜樹堿在水中的溶解性、對于癌細(xì)胞的選擇性和殺傷作用強(qiáng)，不易失活，對正常細(xì)胞毒副作用低；其制備方法簡單且產(chǎn)率較高，適于放大合成和實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子，為基于環(huán)糊精修飾喜樹堿和金剛烷修飾透明質(zhì)酸合成的二元超分子組裝體，其中金剛烷修飾透明質(zhì)酸分子式為(C₁₄H₂₁NO₁₁)₂₃₉(C₂₇H₄₁N₃O₁₁)₃₆，平均一條高分子鏈上修飾36個金剛烷單元，環(huán)糊精修飾喜樹堿化學(xué)分子式為C₇₃H₁₀₁N₅O₃₉；該二元超分子組裝體以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價相互作用和分子間的兩親作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外殼、疏水的喜樹堿為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑為70-90nm。

一種所述靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子的制備方法，步驟如下：

1)將分子量為110000的透明質(zhì)酸溶于二甲基亞砜中，加熱至60℃，待透明質(zhì)酸完全溶解后，將溶液冷卻至室溫。加入三乙胺，攪拌10分鐘后加入氯甲酸乙酯并在室溫下攪拌1小時，然后加入N-(2-氨乙基)-1-金剛烷甲酰胺，室溫下攪拌反應(yīng)24小時，然后向反應(yīng)液中加入蒸餾水進(jìn)行稀釋，將所得溶液裝入截留范圍為8000-14000的透析袋中連續(xù)透析7天，將所得溶液凍干制得金剛烷修飾的透明質(zhì)酸；

2)將喜樹堿懸浮于N,N-二甲基甲酰胺中制成懸濁液，然后依次加入N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶和10-炔基十一酸，避光常溫下攪拌24小時。抽濾后將濾液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑后加入三氯甲烷，用水洗滌三次后收集有機(jī)相并用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑得到十一炔修飾的喜樹堿粗品，然后以石油醚和乙酸乙酯混合液為展開劑，該混合液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為1:3，用200-300目硅膠柱進(jìn)行分離，制得十一炔修飾的喜樹堿純品；

3)將十一炔修飾的喜樹堿和6-脫氧-6-疊氮-β-環(huán)糊精溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入五水合硫酸銅，將溶液持續(xù)攪拌并升溫到65℃，然后加入抗壞血酸鈉的水溶液，然后在65℃、氬氣保護(hù)條件下避光反應(yīng)24小時，抽濾后將濾液加入到丙酮中攪拌，析出沉淀，然后再進(jìn)行抽濾得到濾餅，得到環(huán)糊精修飾喜樹堿的粗品；再以正丙醇、水和25wt％的氨水混合液為展開劑，該混合液中正丙醇、水和25wt％氨水的體積比為6:3:1，用200-300目硅膠柱進(jìn)行分離，制得環(huán)糊精修飾的喜樹堿純品；

4)將步驟1)制得的金剛烷修飾透明質(zhì)酸溶于水中得到溶液a，將步驟3)制得的環(huán)糊精修飾喜樹堿溶于二甲基亞砜中得到溶液b，然后將溶液a和溶液b均勻混合，制得靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子。

所述步驟1)中透明質(zhì)酸與二甲基亞砜的用量比為0.091mmol/L，三乙胺、氯甲酸乙酯和二甲基亞砜的體積比為0.92:0.377:50，透明質(zhì)酸與N-(2-氨乙基)-1-金剛烷甲酰胺的摩爾比為0.0069:1，處理反應(yīng)所加的蒸餾水與溶劑二甲基亞砜的體積比為1:1。

所述步驟2)中喜樹堿與N,N-二甲基甲酰胺的用量比為40mmol/L，喜樹堿、N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶與10-炔基十一酸的摩爾比為1:1.2:0.2:3。

所述步驟3)中十一炔修飾的喜樹堿與N,N-二甲基甲酰胺的用量比為6.5mmol/L，抗壞血酸鈉與水的用量比為0.2mol/L，十一炔修飾的喜樹堿、6-脫氧-6-疊氮-β-環(huán)糊精、五水合硫酸銅與抗壞血酸鈉的摩爾比為0.195:0.4:0.8:2，溶劑N,N-二甲基甲酰胺與丙酮的體積比為3:40。

所述步驟4)中溶液a中金剛烷修飾透明質(zhì)酸與水的用量比為14.5μmol/L，溶液b中環(huán)糊精修飾喜樹堿與二甲基亞砜的用量比為16.7mmol/L，溶液a和溶液b的體積比為100:3。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：該靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子，利用透明質(zhì)酸與癌細(xì)胞表面過量表達(dá)的透明質(zhì)酸受體間強(qiáng)的抗原-抗體作用，將載有喜樹堿的超分子納米粒子通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用特異性地帶入到癌細(xì)胞當(dāng)中，從而實(shí)現(xiàn)對癌細(xì)胞的選擇性殺傷而不損傷正常細(xì)胞；該靶向藥物傳遞體系在保持了喜樹堿抗癌活性的前提下大大降低了對正常細(xì)胞的毒副作用；該超分子納米粒子的制備工藝簡單、易于實(shí)施且材料成本低，在癌癥的靶向治療領(lǐng)域有較大的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為該超分子納米粒子HACPTPs的合成路線示意圖。

圖2為超分子納米粒子HACPTPs的透射電子顯微鏡圖。

圖3為HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4為NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明：

實(shí)施例：

一種靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子，為基于環(huán)糊精修飾喜樹堿和金剛烷修飾透明質(zhì)酸合成的二元超分子組裝體，其中金剛烷修飾透明質(zhì)酸分子式為(C₁₄H₂₁NO₁₁)₂₃₉(C₂₇H₄₁N₃O₁₁)₃₆，平均一條高分子鏈上修飾36個金剛烷單元，環(huán)糊精修飾喜樹堿化學(xué)分子式為C₇₃H₁₀₁N₅O₃₉；該二元超分子組裝體以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價相互作用和分子間的兩親作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外殼、疏水的喜樹堿為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑為70-90nm。

所述靶向傳遞喜樹堿超分子納米粒子的制備方法，步驟如下：

1)將500mg(4.5μmol)分子量為110000的透明質(zhì)酸溶于50mL二甲基亞砜中，加熱至60℃，待透明質(zhì)酸完全溶解后，將溶液冷卻至室溫。加入0.92mL三乙胺，攪拌10分鐘后加入0.377mL氯甲酸乙酯，室溫下攪拌1小時。然后加入146.6mg(0.66mmol)N-(2-氨乙基)-1-金剛烷甲酰胺，室溫下攪拌反應(yīng)24小時。向反應(yīng)液中加入50mL蒸餾水進(jìn)行稀釋，將所得溶液裝入截留范圍為8000-14000的透析袋中連續(xù)透析7天，將所得溶液凍干，制得金剛烷修飾的透明質(zhì)酸；

檢測顯示制備的金剛烷修飾透明質(zhì)酸的核磁表征如下：¹H NMR(400MHz,D₂O,TMS,ppm):δ＝1.51-1.75(m,1.61H),1.90(s,3.3H),3.05-3.99(m,10.62H),4.24-4.63(m,2H)。通過對核磁譜圖積分計算可以得到金剛烷修飾透明質(zhì)酸的分子式為(C₁₄H₂₁NO₁₁)₂₃₉(C₂₇H₄₁N₃O₁₁)₃₆，平均一條高分子鏈上修飾36個金剛烷單元。

2)將348.4mg(1mmol)喜樹堿懸浮于25mL的N,N-二甲基甲酰胺中制成懸濁液，然后依次加入247.4mg(1.2mmol)N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺、25mg(0.2mmol)4-二甲氨基吡啶和546.9mg(3mmol)10-炔基十一酸，避光常溫下攪拌24小時，抽濾后將濾液經(jīng)減壓蒸餾除去溶劑后加入100mL三氯甲烷，用100mL水洗滌三次后收集有機(jī)相并用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑得到十一炔修飾的喜樹堿粗品，然后以石油醚和乙酸乙酯混合液為展開劑，該混合液中石油醚和乙酸乙酯的體積比為1:3，用200-300目硅膠柱進(jìn)行分離，制得十一炔修飾的喜樹堿純品；

檢測顯示制備的十一炔修飾喜樹堿的核磁表征如下：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,TMS):δ＝0.95-0.99(t,J＝7.5Hz,3H),1.25-1.44(m,10H),1.63-1.66(m,2H),1.90-1.92(t,J＝2.6Hz,1H),2.07-2.32(m,4H),2.46-2.51(m,2H),5.29(s,2H),5.39-5.44(ABq,J＝17.2Hz,1H),5.66-5.70(ABq,J＝17.2Hz,1H),7.22(s,1H),7.66-7.69(t,J＝7.4Hz,1H),7.82-7.86(t,J＝7.6Hz,1H),7.94-7.96(d,J＝8.3Hz,1H),8.20-8.23(d,J＝8.5Hz,1H),8.40ppm(s,1H)。ESI-MS:513.24[M+H]⁺。

3)將100mg(0.195mmol)十一炔修飾的喜樹堿和464mg(0.4mmol)6-脫氧-6-疊氮-β-環(huán)糊精溶于30mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入200mg(0.8mmol)五水合硫酸銅，將溶液持續(xù)攪拌并升溫到65℃，然后加入400mg(2mmol)抗壞血酸鈉的10mL水溶液，然后在65℃、氬氣保護(hù)條件下避光反應(yīng)24小時。抽濾后將濾液加入到400mL丙酮中攪拌，析出沉淀，然后再進(jìn)行抽濾得到濾餅，得到環(huán)糊精修飾喜樹堿的粗品，再以正丙醇、水和25wt％的氨水混合液為展開劑，該混合液中正丙醇、水和25wt％氨水的體積比為6:3:1，用200-300目硅膠柱進(jìn)行分離，制得環(huán)糊精修飾的喜樹堿純品；

檢測顯示制備的環(huán)糊精修飾喜樹堿的核磁表征如下：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,TMS):δ＝0.90-1.57(m,19H),2.08-2.25(m,3H),3.56-4.01(m,42H,H of C3,C5,C6,C2,C4inβ-CD),4.46-4.51(m,6H,H of C6-OH inβ-CD),4.76-4.83(m,7H,H of C1inβ-CD),5.26-5.37(m,2H),5.43-5.49(m,2H),5.70-5.78(m,14H,H of C2-OH and C3-OH inβ-CD),7.06(s,1H),7.70-7.77(m,2H),7.84-7.88(t,J＝7.4Hz,1H),8.11-8.17(m,2H),8.70ppm(s,1H)。ESI-MS:1672.6129[M+H]⁺。通過核磁及質(zhì)譜表征可以得到制得的環(huán)糊精修飾喜樹堿化學(xué)分子式為C₇₃H₁₀₁N₅O₃₉。

4)將1.62mg(0.014μmol)金剛烷修飾透明質(zhì)酸(HA-ADA)溶于1mL水中得到溶液a，將0.84mg(0.5μmol)環(huán)糊精修飾喜樹堿(CPT-CD)溶于30μL二甲基亞砜中得到溶液b，然后將溶液a和溶液b均勻混合，制得靶向傳遞喜樹堿的超分子納米粒子(HACPTPs)。

圖1為該超分子納米粒子HACPTPs的合成路線示意圖。

圖2為超分子納米粒子HACPTPs的透射電子顯微鏡圖，通過透射電子顯微鏡表征可以得出該超分子納米粒子以環(huán)糊精與金剛烷間強(qiáng)的非共價相互作用和分子間的兩親性作用，形成以親水的透明質(zhì)酸為外殼，疏水的喜樹堿為內(nèi)核的超分子納米粒子，納米粒子粒徑大小為70-90nm。

本發(fā)明的具體應(yīng)用效果如下：

將HCT-116細(xì)胞(人類結(jié)腸癌細(xì)胞)鋪在含有10％胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)24小時，將NIH3T3細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)鋪在含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)24小時，然后分別加入喜樹堿(CPT)，環(huán)糊精修飾喜樹堿(CPT-CD)，超分子納米粒子(HACPTPs)，含有過量透明質(zhì)酸(HA)的HACPTPs，以及金剛烷修飾透明質(zhì)酸(HA-ADA)，連續(xù)培養(yǎng)24小時。用MTT法測量各個實(shí)驗(yàn)條件下的細(xì)胞生存率。

圖3為HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，圖中表明：在24小時范圍內(nèi)，HACPTPs展現(xiàn)出了與CPT和CPT-CD相近的對HCT-116腫瘤細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)加入過量的透明質(zhì)酸將細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體飽和后，超分子納米粒子HACPTPs對HCT-116細(xì)胞的殺傷作用大大降低，證明這種癌細(xì)胞殺傷抑制作用源于癌細(xì)胞表面HA受體為媒介的內(nèi)吞作用將該納米粒子帶入到癌細(xì)胞中。

圖4為NIH3T3細(xì)胞的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如圖4所示，CPT和CPT-CD對其有很大的殺傷作用，然而由于正常細(xì)胞表面透明質(zhì)酸受體的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于癌細(xì)胞，因此HACPTPs對于正常細(xì)胞的毒副作用很小，從而實(shí)現(xiàn)了在保護(hù)正常細(xì)胞的前提下對癌細(xì)胞的選擇性殺傷。