專利名稱：水楊酸甲酯三糖苷、水楊酸酯糖苷類化合物、制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及水楊酸酯糖苷類化合物，以及制備該化合物的方法。
背景技術：
滇白珠Gaultheria yunnanensis Rehd．為杜鵑花科，白珠樹屬植物云南白珠樹的根或枝葉，為白族、侗族、傈傈族、苗族、納西族、水族、瑤族、壯族、布依族等9個民族習用藥，始載于明初的《滇南本草》(1459年)，《中國民族藥志》和《中藥大辭典》均有記載。其質(zhì)量標準收錄于《貴州中藥材質(zhì)量標準》(1988版)。滇白珠具有清熱解毒、活血化淤、祛風除濕、順氣平喘的功能。民間主要用于治療風濕性關節(jié)炎，此外還可以用于眩暈、閉經(jīng)、風寒感冒、咳嗽、哮喘等疾病的治療。我國對滇白珠的研究始于50年代，目前的研究涉及化學、藥理、毒性以及產(chǎn)品的開發(fā)等方面。
解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥(antipyretic-analgesic and anti-inflammatory drugs)是一類具有解熱、鎮(zhèn)痛，而且大多數(shù)還有抗炎、抗風濕作用的藥物。它們在化學結構上雖屬不同類別，但都可抑制體內(nèi)前列腺素(prostaglandin，PG)的生物合成，目前認為這是它們共同作用的基礎。由于其特殊的抗炎作用，故本類藥物又稱為非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAID)。乙酰水楊酸是這類藥物的代表，因此有人將這類藥物稱為乙酰水楊酸類藥物。水楊酸類(salicylates)藥物包括乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid)和水楊酸鈉(sodiumsalicylate)。短期服用副作用少；長期大量服用抗風濕則有不良反應。胃腸道反應最為常見?？诜芍苯哟碳の刚衬?，引起上腹不適、惡心、嘔吐。血濃度高則刺激延腦催吐化學感應區(qū)(CTZ)，也可致惡心及嘔吐。較大劑量口服(抗風濕治療)可引起胃潰瘍及不易察覺的胃出血(無痛性出血)；原有潰瘍病者，癥狀加重。
關于水楊酸酯糖苷，現(xiàn)有技術中數(shù)據(jù)庫Chemical Dictionaries (NaturalProducts inc．Berdy Bioactive Nat．Prod．And DEREP database)已經(jīng)報道過的有水楊酸甲酯2-O-β-D-葡萄吡喃糖苷[C14H18O8，M＝314]，水楊酸甲酯2-O-α-L-阿拉伯吡喃糖基(1-6)-β-D-葡萄吡喃糖苷[C19H26O12，M＝446]，水楊酸甲酯2-O-α-L-鼠李吡喃糖基(1-6)-β-D-葡萄吡喃糖苷[C20H28O12，M＝460]，水楊酸甲酯2-O-β-D-木吡喃糖基(1-6)-β-D-葡萄吡喃糖苷[C19H26O12，M＝446]。沒有關于此類化合物用途的現(xiàn)有技術。

發(fā)明內(nèi)容
本申請人在研究滇白珠Gaultheria yunnanensis Rehd時，提取得到一種新化合物--水楊酸甲酯三糖苷。
其結構式為 系統(tǒng)命名為苯甲酸甲酯-2-O-β-D-木吡喃糖基(1-2)[O-β-D-木吡喃糖基(1-6)]-O-β-D-葡萄吡喃糖苷。
該化合物從植物滇白珠Gaultheria yunnanensis Rehd中提取方法是(1)滇白珠用水、甲醇或乙醇加熱或回流提取，得到提取液；(2)將提取液過濾，濾液濃縮，離心或再過濾，取上清液；(3)將上清液加入到大孔吸附樹脂柱上，先用水洗脫至Molish反應為陰性，然后用梯度的乙醇洗脫。收集不同濃度的乙醇洗脫液，濃縮至干，得到滇白珠枝葉的不同極性部分提取物；(4)含有水楊酸酯糖苷類化合物的部分，用乙醇溶解，拌入硅膠，干燥后用硅膠色譜柱分離，用氯仿甲醇水進行干柱層析后切割；(5)經(jīng)薄層層析檢查，合并含有水楊酸甲酯三糖苷化合物的相同部分，再進行硅膠柱色譜柱純化即制得化合物水楊酸甲酯三糖苷。
對提取物進行結構分析證實為水楊酸甲酯三糖苷。
上述提取步驟(2)中，優(yōu)選在50-65℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml。
在上面的制備方法中，第4步所得到的是水楊酸酯糖苷類化合物有效部位，包括二糖苷和三糖苷。
可用同樣的方法分離獲得水楊酸酯二糖苷。
因此，本發(fā)明提供了一種藥物，含有式(II)結構的化合物。
其中Rt＝甲基、乙基、丙基、丁基、糖基R2＝一糖、二糖、三糖。
其中的糖可以是葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖。
除有效成分如式(II)所示的化合物外，可以添加藥學上可用的輔料，制成片劑、膠囊、顆粒劑或注射劑。
本申請人研究發(fā)現(xiàn)水楊酸甲酯糖苷可以作為藥物有效成分。實驗證明，從上述植物中提取的化合物水楊酸甲酯糖苷具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血小板凝集作用。
優(yōu)選水楊酸甲酯二糖苷。這主要是考慮到植物滇白珠Gaultheriayunnanensis Rehd中水楊酸甲酯二糖苷的含量較高，容易分離純化。
本發(fā)明是通過研究分析水楊酸甲酯二糖苷的結構特點，并研究了其在體外及在小鼠和大鼠體內(nèi)的藥物動力學特點，證實水楊酸酯糖苷類在體內(nèi)可以緩慢代謝產(chǎn)生水楊酸，從而發(fā)揮抗凝作用。同樣，水楊酸酯一糖苷、三糖苷也具有二糖苷同樣的藥物學上的作用。
藥代動力學實驗數(shù)據(jù)說明水楊酸酯糖苷類化合物在體內(nèi)代謝產(chǎn)生水楊酸，并且代謝的速度慢。
如實施例5中所示，本發(fā)明藥物在3小時后，還具有與乙酰水楊酸相似的鎮(zhèn)痛和抗血小板凝聚的效果。
本發(fā)明所提供的藥物的有益之處在于水楊酸酯糖苷類化合物能在體內(nèi)代謝產(chǎn)生水楊酸，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗凝作用，且其在體內(nèi)代謝產(chǎn)生水楊酸的速率較慢，可以長時間地發(fā)揮抗凝作用，該類化合物性質(zhì)穩(wěn)定，呈中性，對胃腸道的刺激性小，適用于慢性病患者長期使用，因此可用于制備水楊酸類鎮(zhèn)痛和抗血小板凝集藥物。


圖1水楊酸甲酯二糖苷的鎮(zhèn)痛作用；圖2水楊酸甲酯二糖苷抗ADP誘導的血小板聚集作用。
具體實施例制備實施例1首次從滇白珠提取分離水楊酸酯糖苷。
滇白珠枝葉9公斤，用95％乙醇回流提取3次，然后過濾，濾液濃縮至小體積，再過濾，濾液拌入1公斤大孔吸附樹脂(魯抗860021型樹脂)。干燥后加入到已處理好的1公斤同樣大孔樹脂柱上，先用水洗脫至Molish反應為陰性，然后換30％乙醇洗脫35升。收集30％乙醇洗脫液濃縮至干的粉末314克。
取其中100克粉末溶解拌入400克硅膠(140～180目)，干燥后加到用同樣硅膠2850克干法裝的層析柱上，用氯仿-甲醇-水(7∶3∶1下層)溶劑系統(tǒng)展開至溶劑流出，然后抽干溶劑，等分切割成5段，各段分別用95％乙醇洗脫至無色，蒸干溶劑。其中第三部分約有33克，第一部分約12克。
取第一部分10克拌入50克硅膠(200-300目)干燥后加入到600克同樣硅膠干法裝柱的層析柱上，用氯仿—甲醇—水(8∶2∶0.2)洗脫，分份收集，薄層層析檢查，合并相同部分。其中16至24份有相同斑點，合并濃縮的粉末3.5克。將粉末再進行硅膠柱層析，用同樣的溶劑系統(tǒng)洗脫，10至20份為相同斑點合并濃縮的白色粉末500毫克。鑒定為新化合物水楊酸甲酯三糖苷(簡稱MSTG)。
該化合物為白色無定形粉末，易溶解于水、甲醇、乙醇、二甲基亞砜、吡啶等溶劑。其光譜數(shù)據(jù)為
UVλmax(MeOH)nm(logε)208(1.362)，231(0.637)，288(0.232)。
IRνmax(KBr)cm-13401，2897，1712，1603，1585，1491，1456，1309，1244，1165，1078，1043，895，843，758。
HRFAB-MS(m/z)(％)601.177338[M+Na]+，(計算值為601.174455，分子式為C24H34O16Na，)。
Pos.FAB-MS(m/z)579[M+H]+。
EI-MS of acetate(m/z)763[glc+2xyl]+，259[xyl]+。
1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δppm7.63(1H，dd，J＝1.8，7.8Hz，H-6)，7.49(1H，dt，J＝1.8，7.8Hz，H-4)，7.23(1H，d，J＝7.8Hz，H-3)，7.04(1H，t，J＝7.8Hz，H-5)，5.10(1H，d，J＝6.9Hz，glc H-1)，4.42(1H，d，J＝7.5Hz，xyl H-1)，4.13(1H，d，J＝7.2Hz，xyl H-1)，3.78(3H，s，OCH3)。
13C-NMR(DMSO-d6，75MHz)δppm166.2(C-7)，155.5(C-2)，133.6(C-4)，130.7(C-6)，121.2(C-1)，120.2(C-5)，115.0(C-3)，104.6(x-1)，103.8(CH，x′-1)，97.9(CH，g-1)，82.0(CH，g-2)，76.2(CH，x-3)，75.5x3(CH，x′-3，g-3，g-5)，74.5(CH，x-2)，73.3(CH，x′-2)，69.4(CH，g-4)，69.3(CH，x-4)，68.8(CH，x′-4)，67.7(CH2，g-6)，65.7(CH2，x-5)，65.4(CH2，x′-5)，51.9(CH3)。
HMQC和HMBC結果如下表所示。
MSTG的核磁其振波譜數(shù)據(jù)(DMSO-d6，δppm)


取第三部分2克加95％乙醇加熱溶解后、冷卻、放置析出結晶，過濾得到900毫克淺棕色結晶。將結晶用95％乙醇重結晶，得到白色結晶400毫克。鑒定為水楊酸甲酯二糖苷(簡稱MSDG)。
該化合物為白色針狀結晶，易溶解于水、甲醇、乙醇、二甲基亞砜、吡啶等溶劑。其光譜數(shù)據(jù)為Pos.FAB-MS(m/z)485[M+K]+，469[M+Na]+，447[M+H]+。
1H-NMR(DMSO-d6，300MHz)δppm7.61(1H，dd，J＝2.0，7.8Hz，H-6)，7.51(1H，dt，J＝2.0，7.8Hz，H-4)，7.33(1H，d，J＝7.8Hz，H-3)，7.06(1H，t，J＝7.8Hz，H-5)，4.83(1H，d，J＝7.2Hz，glc H-1)，4.17(1H，d，J＝7.5Hz，xyl H-1)，3.78(3H，s，OCH3)。
13C-NMR(DMSO-d6，75MHz)δppm166.2(C-7)，155.8(C-2)，133.5(C-4)，130.1(C-6)，121.4(C-1)，120.9(C-5)，116.4(C-3)，103.8(CH，x-1)，100.7(CH，g-1)，76.4(CH，g-3)，76.3(CH，x-3)，76.0(CH，g-5)，73.3(CH，x-2)，73.2(CH，g-2)，69.5x2(CH，g-4，x-4)，68.1(CH，g-6)，65.6(CH2，x-5)，52.0(CH3)。
制備實施例2用藥材重量10倍的水將滇白珠(重量數(shù)9kg)回流提取3次，每次1小時。然后將提取液過濾，濾液在50-65℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml，再過濾或離心，取上清液。將上清液加入到處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用水洗脫至Molish反應為陰性，然后用30％乙醇洗脫。收集30％乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，得到滇白珠枝葉的提取物362g。
制備實施例3首先用藥材重量8倍的50％乙醇將滇白珠枝葉(重量數(shù)9kg)回流提取3次，每次1小時。然后將提取液過濾，濾液在50-65℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml，再過濾或離心，取上清液。將上清液加入到處理好的大孔吸附樹脂柱上，先用水洗脫至Molish反應為陰性，然后用30％乙醇洗脫。收集30％乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，得到滇白珠枝葉的提取物358g。
制備實施例4取上述滇白珠提取物用乙醇溶解，拌入硅膠，干燥后用硅膠色譜柱分離。將柱子切割成5段，將各段硅膠取出，揮干溶劑，分別用乙醇洗脫至薄層檢查無硫酸顯色斑點，減壓回收溶劑。取第1部分再用硅膠柱色譜分離，洗脫溶劑為氯仿∶甲醇∶水(8∶2∶0.2)，按等份收集，用薄層層析檢查，氯仿∶甲醇∶水(8∶2∶0.2)展開，合并相同部分。再進行一次硅膠柱色譜分離，即制得化合物MSTG(I)。
藥效實施例5(1)鎮(zhèn)痛作用研究取小鼠30只，隨機分為3組，即control組、乙酰水楊酸(ASA)組及本發(fā)明藥物(水楊酸甲酯二糖苷MSDG)組，ASA組及MSDG組分別灌胃給10mg/ml ASA溶液0.2ml/10g和20mg/ml MSDG溶液0.2ml/10g，control組給等量蒸餾水。control組、ASA組及MSDG組分別于灌胃給藥后0.5h、0.5h及3h后腹腔注射0.6％醋酸溶液0.1ml/10g，ip醋酸后立即觀察15min扭體次數(shù)，以腹部內(nèi)凹，軀干與后腿伸張，臀部高起作為產(chǎn)生扭體反應的標準。ASA組及MSDG組小鼠扭體反應次數(shù)顯著低于空白對照組，說明MSG有較明顯的鎮(zhèn)痛作用，見圖1。
(2)抗血小板作用研究動物隨機分為空白組(蒸餾水)，ASA組(40mg/kg)，MSDG組(100mg/kg)。每天從20∶30至第二天8∶30禁食12小時，8∶30開始給藥，各組動物分別按1ml/100g分別灌胃給蒸餾水、4mg/mlASA、10mg/ml MSDG，每天一次，給藥三天。在第三天給藥后(ASA組1小時，MSDG組5小時)，將大鼠用戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg)，頸總動脈插管取血，以3.8％枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，血液置硅化管離心管中，1000rpm離心10分鐘，吸出上清，即為富血小板血漿(PRP)；剩余血漿再以3000rpm離心10分鐘，上清液即為貧血小板血漿(PPP)。用血小板聚集儀檢測血小板聚集率，誘導劑分別為ADP，終濃度5μM。計算聚集率，組間采用t檢驗檢測聚集率差異，研究結果見圖2。
權利要求
1.一種化合物具有式(I)的結構
2.權利要求1所述的化合物的制備方法，包含如下步驟(1)滇白珠用水、甲醇或乙醇加熱或回流提取，得到提取液；(2)將提取液過濾，濾液濃縮，再過濾或離心，取上清液；(3)將上清液加入到大孔吸附樹脂柱上，先用水洗脫至Molish反應為陰性，然后用梯度的乙醇洗脫。收集不同濃度的乙醇洗脫液，濃縮至干，得到滇白珠枝葉的不同極性部分提取物；(4)經(jīng)薄層層析檢查將含有水楊酸酯糖苷類化合物的部分，用乙醇溶解，拌入硅膠，干燥后用硅膠色譜柱分離，用氯仿∶甲醇∶水進行干柱層析后切割；(5)經(jīng)薄層層析檢查，合并含有水楊酸甲酯三糖苷化合物的部分，再進行硅膠柱色譜柱純化即制得化合物水楊酸甲酯三糖苷。
3.根據(jù)權利要求2所述的化合物制備方法，其特征在于步驟(2)中濾液在50-65℃減壓濃縮至濃度為0.5g生藥/ml。
4.一種藥物，含有式(II)結構的化合物或和藥學上可用的輔料。 式(II)其中R1＝甲基、乙基、丙基、丁基、糖基R2＝一糖、二糖、三糖；其中的糖可以是葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖。
5.根據(jù)權利要求4所述的藥物，其特征在于R1是甲基。
6.根據(jù)權利要求4所述的藥物，其特征在于R2是二糖。
7.一種藥物，含有按如下方法提取的有效成分(1)滇白珠用水、甲醇或乙醇加熱或回流提取，得到提取液；(2)提取液過濾，濾液濃縮，再過濾或離心，取上清液；(3)將上清液加入到大孔吸附樹脂柱上，先用水洗脫至Molish反應為陰性，然后用梯度的乙醇洗脫。收集不同濃度的乙醇洗脫液，濃縮至干，得到有效部位提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及水楊酸酯糖苷類化合物，以及制備該化合物的方法。本發(fā)明公開了一種新化合物——水楊酸甲酯三糖苷(I)及其制備方法。本發(fā)明還提供了一種含有水楊酸酯糖苷的藥物，該藥物具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎及抗血小板凝集作用。
文檔編號A61K31/7028GK1727354SQ20041004662
公開日2006年2月1日 申請日期2004年7月30日 優(yōu)先權日2004年7月30日
發(fā)明者丁怡, 杜冠華, 李建北, 張斌 申請人:丁怡