專利名稱：2－羧甲基－5－(5－氟胞嘧啶－1－基)－1,3－氧硫雜茂烷及其衍生物的制作方法
本專利申請是CN95109814.4的分案申請。原申請的申請日為1992年2月22日；原申請的發(fā)明名稱為核苷對映體的外消旋混合物的拆分方法。
本發(fā)明涉及生物活性的核苷領域，特別是包括含有2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1基)-1，3-氧硫雜茂烷(“FTC”)的抗病毒組合物，其生理學上可接受的衍生物，或其生理學上可接受的鹽，和其拆分方法及(-)-β-L和(+)--β-D FTC對映體的用途。
1981年，一種疾病被確定為獲得性免疫缺乏綜合癥(AIDS)，這種疾病嚴重破壞人體免疫系統(tǒng)，而且?guī)缀鯖]有例外地導致病人死亡。1983年，測定了引起AIDS病因是人類免疫缺乏病毒(HIV)。到1990年12月，世界衛(wèi)生組織估計全世界感染HIV病人為8百萬到1千萬，在美國就有1,000,000——1,400,000人。
1985年報導了合成的核苷3’-疊氮-3’-脫氧胸苷(AZT)可以抑制人類免疫缺乏病毒的復制。后來證明許多其它合成的核苷，包括2’，3’-二脫氧肌苷(DDI)，2’3’-二脫氧胞苷(DDC)，3’-氟-3’-脫氧胸苷(FLT)，和2’，3’-二脫氧-2’，3’-二脫氫胸苷(D4T)可以有效地抗HIV。證明其它許多的2’，3’-二脫氧核苷在體外可以抑制多種病毒的生長。很明顯，通過細胞激酶將細胞磷酸化為5’-三磷酸鹽后，這些合成的核苷并入病毒DNA的生長線，由于沒有3’-羥基的存在引起鏈中止。
各種2’，3’-二脫氧核苷在體內或體外抑制HIV復制的成功導致許多研究者設計和試驗核苷，即在核苷的3’-位用雜原子取代碳原子。Norbeck等人公開了(±)-1-[(2β，4β)-2-(羥甲基)-4-(二氧戊環(huán)基)]胸腺嘧啶(稱為(±)-二氧戊環(huán)-T)顯示了抗HIV的中等活性(EC50在ATH3細胞中為20μm)，并且在濃度為200μm對于未感染的對照細胞沒有毒性，Tetrahedron Letters30(46)，6246，(1989)。歐洲專利申請公開No0337713和U.S.專利No5,041,449，轉讓給IAFBiochem International，Inc.，公開了2-取代的-4-取代的-1，3-二氧戊環(huán)，它顯示了抗病毒活性。
U.S.專利No5,047,407和歐洲專利申請公開No0382526，也轉讓給IAF Biochem International，Inc。公開了許多2-取代的-5-取代的-1，3-氧硫雜茂烷核苷具有抗病毒活性，特別是報導了2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(以下稱為(±)-BCH-189)的Cl’-β異構體的外消旋混合物(關于在4’-位)幾乎與AZT有相同的抗HIV活性，而且在試驗水平沒有細胞毒性。已經發(fā)現(xiàn)(±)-BCH-189抑制體外從病人身體分離出的AZT-阻抗HIV的復制，該病人用AZT治療已超過36周。
另一種嚴重影響人類健康的病毒是肝炎B病毒(以下稱為“HBV”)。HBV引起人類癌癥僅次于煙草。HBV引起癌癥的機理還不清楚，盡管假定它可以直接觸發(fā)腫瘤的發(fā)展，或通過慢性炎癥，硬化及與感染有關的細胞再生間接觸發(fā)腫瘤的發(fā)展。
當經過2-6個月培養(yǎng)之后，其中宿主沒有感染，HBV感染可能導致急性肝炎和肝損傷，引起腹部疼痛，黃疸，及提高某些酶的血液水平。HBV可能引起暴發(fā)性肝炎，且迅速發(fā)展，使得肝大部分被破壞，以至常常成為致命的疾病。
一般急性肝炎病人可以痊愈，然而，有些病人其大量的病毒抗原仍留在血液中一個相當長，或不確定的時間，引起慢性感染。慢性感染可以導致慢性持續(xù)性肝炎。在發(fā)展中國家，感染慢性持續(xù)性HBV的病人最普遍。到1991年中期，僅在亞洲，慢性HBV攜帶者就有近2億2千500萬，全世界幾乎有3億攜帶者。慢性持續(xù)性肝炎可以引起疲勞，肝硬變，肝細胞癌，早期肝癌。
在西方工業(yè)國家，相當多的人有染上HBV的危險，包括那些與HBV攜帶者或他們的血樣接觸的人。HBV的傳播是與獲得性免疫缺乏綜合癥非常相似，這就說明了為什么患AIDS或AIDS相關綜合癥的病人普遍感染HBV，然而，HBV比HIV更容易接觸傳染。
用人類血清一衍生疫苗免疫病人對HBV有免疫力已經發(fā)展起來。然而現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)疫苗的有效產生也會帶來一些麻煩，因為從慢性攜帶者得到人類血清供應是有限的，并且純化過程是費時和昂貴的。進而，由不同血清制備的每批疫苗必須在黑猩猩身上試驗以保證安全。通過遺傳工程也已經生產出疫苗。已經顯示用α-干擾素——一種遺傳工程中的蛋白質——進行治療是有希望的。然而，迄今為止，還沒有一種藥學試劑可以有效地抑制病毒的復制。
為藥學目的銷售的核苷，它不僅必須是低毒性，而且必須是低成本生產。大量研究和發(fā)展新的、低成本的方法目的在于大規(guī)模生產核苷?，F(xiàn)行制備2’，3’-二脫氧核苷均通過以下二條路線之一原核苷的衍生或衍生糖部分與雜環(huán)堿縮合。盡管通過變化原核苷獲得新核苷類似物的方法有許多缺點，但是這個方法的主要優(yōu)點是幾乎已經自然地建立起了絕對立體化學。然而，這種方法不能用于既含有人工產生的堿又含有人類產生的糖類部分(即不能用原核苷制備)的核苷如1，3-氧硫雜茂烷核苷和1，3-二氧戊環(huán)核苷的生產。
當一個糖或一個糖類似部分與一個雜環(huán)堿縮合形成一個合成的核苷時，生產出的核苷有兩個手性中心(在C1’和C4’位)，因此為二個非對映體對形成存在。每個非對映體以一對對映體形式存在。因此，該產品為四個對映體的混合物。
人們常常發(fā)現(xiàn)用人工生產的既在C1’位又在C4’位立體化學結構的核苷其活性低于天然方法得到的立體化學結構相同的核苷。例如，Carter等人報導的在細胞培養(yǎng)中獲得的(-)-Car-bovir對映體(2’，3’-二脫氫-2’，3’-二脫氧鳥苷)減少逆轉錄酶活性50％的濃度(EC50)是0.8μm，而Carbovir(+)對映體的EC50大于60μm。Antimic robial Agents andChemotherapy，346，1297-1300(1990，6)。
PCT國際公開No WO91/11186公開了制備1，3-氧硫雜茂烷核苷可以用高含量非對映體選擇性(從C1’-碳到雜環(huán)堿具有β構型鍵的高百分比的核苷)通過小心選擇路易斯酸用縮合方法進行。人們發(fā)現(xiàn)，當氯化錫用作縮合催化劑時，1，3-氧硫雜茂烷核苷與堿縮合產生幾乎全部是β-立體定向結構。其它路易斯酸提供低的(或不)C1’-β選擇性或簡直不催化反應。
根據以上事實，獲得性免疫缺乏綜合癥，AIDS-相關綜合癥，及肝炎B病毒已經達到流行全世界的程度，而且在感染病人方面已經具有嚴重的結果，因此，強烈需要提供一種新的有效的藥學試劑來治療這些病人，而且對宿主是低毒性的。
還需提供一種低成本、商品化制備藥學上重要核苷的方法，特別是通過糖一類似部分與堿縮合得到在合成核苷的C4’位上的β-立體定向。
因此，本發(fā)明目的是提供一種治療感染HIV病人的方法和組合物。
本發(fā)明另一目的是提供一種治療感染HBV病人或其它宿主動物的方法和組合物。
本發(fā)明的再另一個目的是提供對映體富集的1，3-氧硫雜茂烷核苷。
本發(fā)明還有一個目的就是提供1，3-氧硫雜茂烷核苷C4’-對映體的拆分方法。
治療感染HBV和HIV的病人或其它宿主動物的方法和組合物是施用在藥學上可接受載體中的有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，其藥學上可接受的衍生物，包括5’或N4烷基化或酰化衍生物，或其藥學上可接受的鹽。
人們已經發(fā)現(xiàn)，2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(“FTC”)顯示出抗人類免疫缺乏病毒有意想不到的高活性。而且對于宿主細胞具有非常低的毒性。人們也已經發(fā)現(xiàn)FTC顯示出抗HBV有非常高的活性。因此它可以用于治療患有與HBV感染有關的各種疾病的病人。
毒性和藥物代謝動力學研究證實FTC的用途，即作為藥物施用的抗病毒劑。FTC和它的對映體對于人骨髓外周細胞濃度高達50μm和其它細胞系濃度高達200μm時是沒有毒性的。FTC-TP主要是PBMC和HepG2細胞中的細胞內的代謝產物。用一個多(I)低聚(dC)模板-引物FTC-TP較強地抑制具有0.2μMK1的HIV-1逆轉錄酶(RT)。用序列分析，當用HIV-RT(C-終端)時可以說明FTC-TP是一個蛋白質DNA鏈末端。
用FTC進行慢性治療對于嚙齒動物是沒有毒性的，甚至每天口服劑量為85mg/kg至少兩個月。對于獼猴FTC的藥物代謝動力學顯示出高的口服生物藥效率(約73±6％)和血漿末端半衰期約為1.34±0.18(口服和I.V.給藥的平均值)。
本發(fā)明也公開了核苷對映體的外消旋混合物，包括FTC的外消旋混合物的拆分方法，包括把外消旋混合物暴露在酶中的步驟，該酶優(yōu)選催化對映體之一的反應。該方法可以用于拆分許多核苷，包括在糖部分或堿部分任意被取代的嘧啶和嘌呤核苷。該方法也可以用于拆分在糖部分含有附加雜原子的核苷衍生物，例如，(±)-FTC和(±)-BCH-189。核苷的拆分可以以中等成本大規(guī)模地進行。
用這里描述的方法，可以將FTC拆分成它的(+)-β-D和(-)-β-L對映體。對于抗HIV，HBV，和SIV，(-)-(β)-L-對映體似乎比(+)-(β)-D-對映體更有效。對于抗HIV，HBV和SIV，F(xiàn)TC的(+)-對映體也是活性的。


圖1是2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(“FTC”)的化學結構圖。
圖2是制備2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-硫雜茂烷的方法流程圖。
圖3是FTC的(+)和(-)的對映體的堿性磷酸酯酶和蛇毒磷酸二酯酶的特性流程圖。
圖4是說明用酶 AmanoPS-800(空白方塊)和PLE(空白圓圈加點描繪的)，F(xiàn)TC5’-丁酯的酯酶-催化水解進程與時間的關系5是外消旋的和對映體富集FTC(其制備用實施例4的方法)濃度(μm)效果與感染HIV-1人的PBM細胞抑制百分率的關系曲線圖。((黑圈，(±)-FTC)，(空白圈，(-)-FTC)，(黑方塊，(+)FTC)。
圖6是外消旋和對映體富集FTC(用實施例3方法制備)的濃度(μm)效果與感染HIV-1人的PBM細胞的抑制百分率的關系圖。((黑圈，(±)-FTC)，(空白圈，(-)-FTC)，(黑方塊，(+)-FTC)。
圖7是在人PBM細胞中氚代的(±)-FTC吸收(2個測定的平均值)的時間(小時)與Pmol/(106細胞)的關系圖。
圖8是測定從人PBM細胞中釋出的有放射性標記的(±)-FTC的時間與Pmol/(106細胞)的關系圖。
圖9說明在含有10μM[3H]-(±)-FTC介質中培育的人HepG-2細胞中(兩個測定值的平均值)的[3H]-(±)-FTC和它的磷酸衍生物的存在，以時間對Pmol/(106細胞)測出。
圖10是當用10μM[3H]-(±)-FTC (700DPM/Pmol)脈沖細胞24小時后，并在將其除去后，將化合物定濃24小時，在人HepG-2細胞中[3H]-(±)-FTC和其磷酸衍生物的衰減時間與Pmol/(106細胞)關系圖。
圖11是當用10μM[3H]-(±)-FTC(700DPM/Pmole)培育24小時后，人HepG2細胞中的[3H]-(±)-FTC和其磷酸衍生物的混合濃度的減少的時間與Pmol/(106細胞)的關系圖。
圖12是FTC對映體對粒細胞-巨噬細胞前體細胞的群體形成的作用圖，測量百分存活率與濃度(μM)的關系((-)FTC，空白圈；(+)-FTC，黑圈；AZT，黑方塊)。
在這里，術語“對映體富集核苷”是涉及至少含有95％核苷的單個對映體的核苷組合物。
在這里，術語FTC為2-羥甲基-5-(5氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(外消旋形式或對映體)，也稱為2’-脫氧-5-氟-3’-硫雜胞苷。
在這里，術語(±)FTC為(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3氧硫雜茂烷。
在這里，術語(-)-FTC為(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
在這里，術語(+)-FTC為(+)-β-D-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
在這里，術語FTC-MP，F(xiàn)TC-DP，和FTC-TP分別為FTC的單磷酸酯，二磷酸酯，和三磷酸酯。
在這里，術語BcH-189為2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
在這里，術語“優(yōu)選酶催化”是指通過一種酶進行催化，該酶有利于一個被酶作用物而不利于另一個。
在這里，離去基團意思是這樣的一個官能團，即當它從連接的分子上離開時形成起始的碳化作用的官能團。
在這里本發(fā)明公開了治療人和其它宿主動物HIV和HBV感染及以類似方式復制的其它病毒的方法和組合物，包括施用有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(±)-β-D，L，(-)-β-L或(+)-β-D對映體，藥學上(生理學上)可接受的衍生物，包括5’或N4烷基化或?；苌?，或其藥學上(生理學上)可接受的鹽，它們在藥學上可接受的載體中。如下所述，本發(fā)明化合物既具有抗還原病毒活性，如抗-HIV-1，抗-HIV-2，和抗猴的免疫缺乏病毒(抗-SIV)活性，其本身也代謝為顯示抗還原病毒活性的化合物。
FTC和其藥物學上可接受的衍生物或含有這些化合物的藥學上可接受的制劑用于預防和治療HIV感染和其它相關疾病如AIDS-相關綜合癥(ARC)，持續(xù)性擴散淋巴結造影術(PGL)，AIDS-相關神經病學疾病，抗-HIV抗體陽性，和HIV-陽性疾病，Kaposi’s肉瘤，血小板減少性紫癜和機會致病菌感染。另外，這些化合物或制劑可以用于預防或延遲某些抗-HIV抗體或HIV-抗原陽性或已受到HIV感染的人的臨床疾病的發(fā)展。
FTC和其藥學上可接受的衍生物或其鹽或含有這些化合物的其藥學上可接受的制劑也用于預防和治療HBV感染和其它相關疾病如抗-HBV抗體陽性和HBV-陽性疾病，由HBV引起的慢性肝炎，肝硬變，急性肝炎，突發(fā)性肝炎，慢性持續(xù)性肝炎及疲勞。這些化合物或制劑也可以用于預防或延遲某些抗-HBV抗體或HBV-抗原陽性或已受到HIV感染的人的臨床疾病的發(fā)展。
總之，本發(fā)明包括下列方面(a)(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其藥學上可接受的衍生物及其鹽；(b)(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其藥學可接受的衍生物及其鹽；(c)(+)-β-D-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其藥學上可接受的衍生物及其鹽；(d)用于醫(yī)療例如治療和預防HIV和HBV感染的(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，它的(-)和(+)對映體，及其藥學上可接受的衍生物和鹽；(e)用(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，它的(-)和(+)對映體，及其藥學上可接受的衍生物和鹽于治療HIV或HBV感染的藥物的生產；(f)含有(±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，它的(-)和(+)對映體，或其藥學上可接受的衍生物或其鹽和一種藥物上可接受的載體的藥學制劑；(g)制備2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的方法，該方法包括(i)任意保護的5-氟胞嘧啶與式A的1，3-氧硫雜茂烷反應，和任意除去任何羥基保護基；
其中R1a是氫或羥基保護基，包括一個?；?，及L是一個離去基團；(ii)式B化合物(其中R1a如上定義，和R1b是一個氨基保護基)與一個用來在胞嘧啶環(huán)的5-位引入一個氟原子的氟化劑反應；
(iii)式C化合物
(其中R1a如上定義)與一個用來將在尿嘧啶環(huán)的4-位氧基轉化為氨基的試劑反應；除去任何保留的保護基以產生所需產品。
(h)制備2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的(-)或(+)對映體的方法包括使(-)和(+)對映體混合物形式的該化合物或其衍生物(例如5’-酯)經過一定條件或與用來分離對映體的試劑反應，如果需要將所得衍生物轉化為母體化合物。
關于方法(e)(i)羥基保護基包括如下詳細描述的保護基，包括酰基(例如乙?；?，芳酰基(例如苯甲?；蛉〈郊柞；?，三苯甲基，或單甲氧基三苯甲基，芐基或取代芐基，三取代甲硅烷基，包括三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。5-氟胞嘧啶化合物可以任意被三取代甲硅烷基所保護?？梢杂贸Ｒ?guī)方法除去保護基。離去基團L是在核苷化學領域中已知的那些典型的離去基團，例如鹵素如氯或溴，烷氧基如甲氧基或乙氧基，或?；缫阴；虮郊柞；?。
方法(e)(i)中的反應可以在有機溶劑(例如1，2-二氯乙烷或乙腈)中，在路易斯酸，優(yōu)選氯化錫，或三甲基甲硅烷基triflate的存在下進行。
式A化合物(其中L代表一個酰基，例如乙?；?可以通過如下方法得到，使式D化合物
(其中R1a如上定義)與一個還原劑如氫化鋁鋰反應，接著為了所需中間體用一個適當?shù)脑噭┨幚?，例如為了?；靡粋€羧酸酐如乙酸酐，為了鹵化用氯化或溴化試劑，或用烷基化試劑。
式D化合物可以通過式E化合物
與HSCH2CO2H在升溫條件下來制備。
式E化合物可以通過具有式CH2＝CH-CH2-OR烯丙醚或烯丙酯或具有式ROCH2-CH＝CH-CH2OR的2-丁烯-1，4-二醇的二醚或二酯的臭氧分解來制備，其中R為一個保護基，如烷基，甲硅烷基或酰基。
關于方法e)(ii)，5-氟取代可以用本領域已知方法引入(M.J Robins，等人，在Nucleic Acid Chemistry中，Part2，L.B.Townsend和R.S.Tipson，編輯，J.Wiley and Sons，New York，895-900(19/8)在此作為參考；R.Duschinsky在Nucleic AcidChemistry中，Part l，L.B.Townsend和R.S.Tipson，編輯，J.Wiley and Sons，New York 43-46(1978)在此作為參考)。氟化試劑可以是，例如氟代三氯甲烷中的三甲基次氟酸。
關于方法e)(iii)式C化合物可以用1，2，4-三唑，及4-氯苯基二氯磷酸酯處理，以形成相應的4-(1，2，4-三唑基)化合物，然后通過與如甲醇反應將該化合物轉化為所需4-氨基(胞嘧啶)化合物。
式B和C的起始原料可以如通過適當?shù)?任意保護的)堿與式A化合物用類似方法e)(i)中描述的方法制備。5-氟尿嘧啶和5-氟胞嘧啶可以從Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI53233，USA.買到。
(±)對映體的拆分可以按照下面第III節(jié)中的詳細說明進行。
FTC可以通過與適當?shù)孽セ瘎珲；u或酐反應，轉化為藥學上可接受的酯。FTC或其藥學上可接受的衍生物可以用常規(guī)方法例如，用適當?shù)膲A處理轉化為其藥學上可接受的鹽。FTC的酯或鹽可以轉化為FTC，例如用水解。
這里公開的抗病毒活性化合物是2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷(見圖1)，它以外消旋或分離的對映體形式存在。
對于受者，活性化合物的施用可以任何衍生物形式，它可以直接或間接提供母體FTC化合物，或顯示其本身活性。非限制性的例子是藥學上可接受的鹽(或稱為“生理學上可接受的鹽”)，活性化合物的5和N4酰化或烷基化衍生物(或稱為“生理學活性衍生物”)。在一個具體實施方案中，?；囚人狨?，其中酯基的非羰基部分選自直鏈的，支鏈的，或環(huán)的烷基，烷氧基烷基包括甲氧基甲基，芳烷基包括芐基，芳氧基烷基如苯氧基甲基，芳基包括任意被鹵素，C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的苯基，磺酸酯如烷基或芳烷基磺?；谆酋；?，單，二或三磷酸酯，三苯甲基或單甲氧基三苯甲基，取代芐基，三烷基甲硅烷基(例如二甲基-叔-丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。在酯中的芳基最優(yōu)為苯基。烷基可以是直鏈的，支鏈的，或環(huán)的，C1-C18的基團最佳。
FTC的藥學上可接受的衍生物具體例子包括，但不僅限于
其中R1和R2分別選自烷基和?；?，特別是包括，但不僅限于甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，異丙基，異丁基，仲丁基，叔丁基，異戊基，正戊基，叔戊基，3-甲基丁?；?，氫琥珀酰基，3-氯苯甲酸酯，環(huán)戊基，環(huán)己基，苯甲酰基，乙?；挛祯＃谆酋；?，丙?；?，丁?；?，戊?；?，己、辛、癸酸的，月桂酸的肉豆寇酸的，棕櫚酸的，硬脂酸的，油酸的?；被岚?，但不僅限于丙氨?；?，纈氨酰基，亮氨酰基，異亮氨?；滨；奖滨；?，色氨?；?，甲硫氨酰基，甘氨酰基，絲氨?；?，蘇氨?；腚装滨?，酪氨酰基，天冬酰胺酰基，谷氨酰胺?；?，天冬氨?；?，谷氨?；?，賴氨酰基，精氨酰基和組氨?；?，其中R1和R2之一可以是H。
FTC或其衍生物可以以其藥學上可接受的鹽的形式提供。正如這里用的，術語藥學上可接受的鹽或絡合物涉及保留所需母體化合物生物活性的及顯示最小的，不期望的毒性效果的FTC的鹽和絡合物。這些鹽的非限制性例子有(a)由無機酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，磷酸，硝酸等等形成的酸加成鹽和由有機酸如乙酸，草酸，酒石酸，琥珀酸，蘋果酸，抗壞血酸，苯甲酸，單寧酸，棕櫚酸，藻酸，聚谷氨酸，萘磺酸，萘二磺酸和聚半乳糖醛酸形成的鹽；(b)由多價金屬陽離子如鋅，鈣，鉍，鋇，鎂，鋁，銅，鈷，鎳，鎘，鈉，鉀等等形成的堿加成鹽，或與有機陽離子N，N-二芐基亞乙基-二胺，銨，或1，2-乙二胺形成的堿加成鹽；或(c)，(a)和(b)結合的鹽，例如單寧酸鋅鹽等等。
改良的活性化合物，特別是在N4和5’-0位的改變，可以影響這些活性物質的代謝生物利用率和代謝率，因此控制了這些活性物質的傳遞。進一步地，這種改良可以影響化合物的抗病毒活性，在某些情況下，增加了母體化合物的活性。這很容易用這里描述的方法或其它本領域技術人員熟知的方法，通過制備衍生物和測試其抗病毒活性來平價。
FTC的外消旋混合物可以根據在PCT國際公開No WO91/11186，
公開日1991年8月8日，及申請人Emory University公開的詳細方法或在實施例1中公開的方法制備?？傊摲椒ò▽⒕哂惺紺H2＝CH-CH2-OR的烯丙醚或酯，或具有式ROCH2-CH＝CH-CH2OR的2-丁烯-1，4-二醇的二醚或二酯進行臭氧化以形成具有OHC-CH2-OR式的乙醇醛，其中R是保護基，如烷基，甲硅烷基或?；?；將巰基乙酸加到乙醇醛中以形成具有式2-(R-氧基)-甲基-5-氧代-1，3-氧硫雜茂烷的內酯；還原內酯得到在氧硫雜茂烷環(huán)5-位含有離去基團的各種化合物；將這些化合物在SnCl4存在下與甲硅烷化的5-氟胞嘧啶偶合，形成FTCβ-異構體；并且任意地除去保護基。實施例1 (±)-β-D，L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的制備FTC外消旋混合物的制備方法已在圖2中示出，下面詳細描述。2-丁烯-1，4-二醇的保護在一個干燥的，2L，三頸燒瓶中，在惰性氣體中，將100g(93.5ml＝1.135mol＝1.00eq)的2-丁烯-1，4-二醇和15g(約0.1eq.)的DMAP(4-二甲氨基吡啶)溶解在800ml無水吡啶電攪拌同時冷卻到0℃。然后將丁酰氯(260ml＝2.2eq)慢慢加入，防止過熱，使其攪拌1小時。用少量冰水驟冷反應液。將液體從鹽中傾析，并真空蒸發(fā)。將余下的鹽溶解在水中，并用乙酸乙酯萃取水溶液兩次。合并其它幾層用飽和CuSO4洗滌一次，用含有Norit的飽和NaHCO3洗滌兩次，然后用硅藻土插塞真空過濾。
將濃的反應混合物溶解在乙醚中，接著用同上述洗滌鹽溶液的相同方法洗滌。
合并有機層，用旋轉蒸發(fā)濃縮，然后在真空下放置。這個反應是一般非常接近于定量的反應。根據需要，可以很容易地增加規(guī)模。產品，1，4-二丁?；?2-丁烯-1，4-二醇是一種無色到淡黃色透明液體。
被保護的二醇的臭氧分解在一個裝有一個大干燥管和一個為引入氣體的開口管的，干燥的，5L三頸瓶中將1，4-二丁?；?2-丁烯-1，4-二醇(1.365mol)溶解在4L無水CH2Cl2中。該管最好不是燒結玻璃的，否則氣泡管將塞阻暴露出濃溶液。將該溶液攪拌并冷卻至-78℃，同時將隋性氣體鼓泡通過該溶液。當溶液已經足夠冷時立刻關閉進氣口，并將燒瓶和攪拌器移至臭氧發(fā)生器。將氧氣鼓泡通過攪拌著的溶液至少20分鐘，同時保持冰浴。對于這個長時間反應，低溫冷卻利于保持低的溫度。然后在8-8.5psi引入臭氧。完成之后，關閉臭氧。在加入3當量Me2S之前將氧氣鼓泡通過溶液約半小時。從冷卻浴中移出燒瓶，轉移到通風櫥中攪拌約2天，以使其完全還原。蒸發(fā)溶液并在真空中放置幾小時。
這個反應一般產生約95％的被保護的醛(2-丁酰氧乙醛)，無色到黃色的透明液體。用巰基乙酸將乙醛環(huán)化在裝有一個Dean Stark-型汽水閥的燒瓶中，將乙醛(1.0當量)溶解在甲苯中，以提供0.80-0.85M的溶液。加入巰基乙酸(1.1當量)，并將混合物加熱到回流。將水共沸地經過汽水閥除去。反應在3小時后完成，并使其冷卻到室溫。用等體積的飽和NaHCO3水溶液洗滌有機溶液兩次，再用水洗一次。用MgSO4和Norit干燥，在真空蒸發(fā)之前用硅藻土真空過濾。反回來再用乙醚萃取第一次NaHCO3洗液；用水洗醚液一次，用MgSO4和Norit干燥，用硅藻土真空過濾，與從甲苯溶液中蒸出另一個有機物質一起蒸發(fā)。合并上述物質，真空放置過夜。
這個反應一般提供產率90％的2-(丁酰氧)-甲基-5-氧代-1，3-氧硫雜茂烷。內酯的還原和乙酸酯的轉化在一個裝有機械攪拌和保持惰性氣體氣氛的干燥的三頸燒瓶中，將2-丁酰氧-甲基-5-氧代-1，3-氧硫雜茂烷(1.00當量)溶解在無水THF中，以得到0.23M溶液。在經過套管加入1.1當量的1.0MLi(叔-BuO)3AlH的THF之前，攪拌溶液并冷卻至0℃。用2∶1乙醚/己烷溶劑系統(tǒng)和茴香醛著色劑通過TLC表明還原約3小時完成。
然后加入約10當量新蒸餾的Ac2O，并使其攪拌2天，得到乙?；a品。通過加入飽和NaHCO3使反應驟冷，攪拌過夜。然后蒸發(fā)并加另外NaHCO3一起攪拌該溶液過夜。該溶液用乙醚萃取，用飽和NaHCO3洗滌(小心地)兩次，用水洗滌一次，用MgSO4和Norit干燥，用硅藻土真空過濾并蒸發(fā)。產品為暗黃色的透明液體。氣相色譜(Init.T-80℃；Init.時間＝5分鐘升溫率-10°/分鐘；最終T＝240℃)表明其純度一般約為70％。5-氟胞嘧啶的甲硅烷基化將5-氟胞嘧啶(1.05當量，依據在前面步驟中用GC顯示的純度，基于所獲得的乙酰化鄰位羥基內醚的量)通過在至少10當量含有催化量的純硫酸銨(0.05-0.10當量)的六甲基二硅氮烷中回流，在溶液變透明后2小時進行甲硅烷基化。然后密封燒瓶用帶有輔助阱的真空泵除去溶劑。產品為白色固體，在真空下放置過夜直至準備用于以下偶合反應。用乙酰化鄰位羥基內醚偶合甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶在氮氣氛下，在SnCl4溶液(135.6ml，1molCH2Cl2的溶液)中加入甲硅烷基化的5-氟胞嘧啶(33.86g，0.124mol)在室溫下將溶液攪拌15分鐘。在氮氣氛下，在30分鐘內，將上述溶液經插管加到乙酸乳酯(38g，0.113mol)的二氯甲烷(400ml)中。將反應溶液攪拌2小時，通過TLC確定反應完成的時刻用二氯甲烷(500ml)稀釋反應溶液并用氫氧化銨溶液使其驟冷。慢慢加入氫氧化銨溶液(100ml)使反應溫度保持在30℃以下，結果生成一種白色沉淀。
將混合物再攪拌30分鐘，然后通過硅膠填充柱(直徑7英寸高5英寸)，依次用二氯甲烷(2L)，乙酸乙酯(2L)和乙酸乙酯∶乙醇(9∶1)(4L)洗脫。在乙酸乙酯和乙酸乙酯∶乙醇洗脫液中含有所需產品。合并這些溶液后減壓蒸發(fā)。然后用無水乙醚(200ml)洗滌剩余粘稠固體，得到一種白色固體(25.35g；71％)，F(xiàn)TC-5’-丁酸酯。
將FTC-5’-丁酸酯(8.74g，0.026mol)溶解在250ml甲醇中。在室溫加入甲醇鈉(2.85g，0.052mol)。將反應液攪拌1小時，通過TLC確定反應完成時刻。加入NH4Cl溶液(10ml)以使反應驟冷，然后減壓除去溶劑。在硅膠(5g)上吸收殘余物，并通過一個小柱子，用乙酸乙酯∶乙醇(9∶1)作為洗脫劑。合并含有產品的分離液，并蒸發(fā)得到粘稠固體，用無水乙醚洗滌得到白色固體FTC(6.00g，88％)。(1HNMR(DMSO-d5)8.18(1H，d，H6，J＝8.4Hz)，7.81&7.57(2H，寬，NH2)，6.12(1H，dd，H1′，J＝5.7&4.2Hz)，5.40(1H，t，OH，J＝5.7Hz)，5.17(1H，t，1H4，J＝3-6Hz)，3.74(2H，m，2H5，)，3.41(1H，dd，1H2′，J＝5.7&11.7H2，3.11(1H，dd，1H2′，J＝4.2&11.7Hz)；13CNMR(DMSO-d6)157.85(d，J＝13.4Hz)，153.28，136.12(d，J＝241Hz)，126.01(d，J＝32.6Hz)，86.90，86.84，62.48，37.07；mp195-196℃。
這里提供了一種拆分核苷對映體外消旋混合物的方法，該混合物包括但并不限于FTC的(+)和(-)對映體。該方法也能夠用于拆分糖類或類糖部分的外消旋混合物，如1，3-氧硫雜茂烷和1，3-二氧代茂烷的衍生物。該方法涉及使用一種能較好地催化外消旋混合物中一種對映體進行反應的酶。根據其物理結構方面新的差異，該反應對映體可以從未反應對映體中分離。如這里所公開的，本領域的技術人員將能夠選擇一種對所選擇的核苷對映體具有選擇性的酶(或對不需要的對映體具有選擇性，作為去除它的方法)，該酶可以選自下面討論的一種酶或系統(tǒng)評價的其它已知酶。如這里所公開，本領域的技術人員也將知道如何改進被酶作用物，以達到希望的拆分目的。通過使用手性NMR位移試劑，旋光測定或手性HPLC，能夠測定回收到的酯的旋光富集。
下面實施例進一步說明于在拆分對映體外消旋混合物中酶的用途。其它已知的外消旋混合物的拆分方法可以和這里公開的拆分方法聯(lián)合使用。所有這些改進均包括在本發(fā)明范圍內。
在具體實施方案中，該方法包括將核苷外消旋體混合物的C5′-羥基與酰基化合物反應得到其中核苷在酯的甲醇端的C5′-酯。然后，在給定的時間內，用一種能優(yōu)先分裂或水解一種異構體而對另一異構體不發(fā)生作用的酶處理核苷C5′-酯的外消旋混合物。
該方法的一個優(yōu)點在于它能夠用于拆分許多核苷，包括在糖部分或堿基部分被任意取代的嘧啶和嘌呤核苷。該方法也能用于拆分在糖部分含有附加的雜原子的核苷衍生物，例如FTC和BCH-189。該方法廣泛的應用性取決于這一事實，即雖然酯的甲醇部分在酶區(qū)別異構體的作用中起著一定作用，但這些酶主要的識別位置是在酯的羧酸部分。進一步說，人們能夠很好地從一種酶/被酶作用物研究的結果推斷另一種看起來相異的系統(tǒng)，只要兩種被酶作用物的羧酸部分相同或基本相似。
該方法的另一優(yōu)點在于它具有區(qū)域選擇性。典型用于水解酯的酶并不催化分子其它部分的其它反應。例如，脂肪酶催化2-羥基甲基-5-氧-1，3-氧硫雜茂烷酯的水解，但并不水解內酯。這與一般的酯水解化學方法形成鮮明的對比。
該方法進一步的一個優(yōu)點在于將未水解對映體和已水解對映體從反應混合物中分離出來非常簡單。未水解對映體比已水解對映體具有較好的親脂性，因此可以通過用眾多非極性有機溶劑中的一種或其混合物進行簡單的萃取將其有效地回收，非極性有機溶劑包括已烷和己烷/乙醚。親脂性較差，極性較強的水解了的對映體可以通過用一種極性較強的有機溶劑如乙酸乙酯進行萃取或冷凍干燥，然后用乙醇或甲醇萃取而得到。在水解過程中應避免使用醇，因為它能在某種條件下使酶變性。
在酶和被酶作用物的適當配合下，可以建立分離核苷對映體的條件?？梢酝ㄟ^用一種能夠水解所需對映體的酶處理外消旋混合物(然后用一種極性溶劑萃取極性水解物)或用一種能夠水解不需要的對映體的酶處理外消旋混合物(然后用一種非極性溶劑將不需要的對映體除去)的方法分離得到所需要的對映體。
催化酯水解的酶包括酯酶如豬肝酯酶，脂肪酶包括豬胰脂肪酶和Amano PS-800脂肪酶，枯草桿菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶。
圖3是堿性磷酸酯酶和蛇毒液磷酸二酯酶對FTC的(+)和(-)對映體特性流程圖。如表所示，堿性磷酸酯酶將兩個對映體的三磷酸酯水解成FTC，因此它不是一種有效的分離方法。磷酸二酯酶I優(yōu)先將FTC的(+)-異構體水解為其單酯，然后該單酯與5′-核苷酸酶接觸得到(+)-FTC。
用于酯化核苷C5′-位的最有效的?；恍柰ㄟ^用所選擇的酶體系對一系列同系物進行評價這些不適當?shù)膶嶒灳湍艽_定。例如，當用丁酸酯化1，3-氧硫雜茂烷核苷時，用豬肝酯酶和Amano PS-800進行的拆分可利用其高對映選擇性(94-100％對映體過量)和相對選擇性進行。豬肝酯酶優(yōu)先水解FTC的(+)-對映體，Amano PS-800優(yōu)先水解FTC的(-)-對映體。表1中報導的對映體過量百分比是留在處理混合物的酶中的純化丁酸酯的量(即在PLE中的(-)-FTC丁酸酯和在Amano PS-800中的(+)-FTC丁酸酯)。
用特殊的核苷對映體混合物和特殊的酶能夠評價的?；姆窍薅ㄐ缘睦影ㄍ榛人岷腿〈榛然?，它們可以是乙酸，丙酸，丁酸和戊酸。對于某些酶，優(yōu)選使用一種具有強吸電子性的?；衔镆酝ㄟ^減弱酯鍵使水解方便地進行。吸電性?；睦影é?鹵代酯，如2-氯丙酸，2-氯丁酸和2-氯戊酸。α-鹵代酯是極好的脂肪酶被酶作用物。
通常可用催化量的酶在pH值接近于該酶最適宜的pH的緩沖水溶液中完成該酶催化水解。隨著該反應的進行，由于釋放出羧酸，pH值有所降低，應該加堿水溶液以保持pH接近酶所需的最適值。該反應的進程可以很容易地通過檢查pH的變化和保持pH所需的堿量來確定。疏水酯(未水解對映體)和較高極性的醇(水解對映體)能夠連續(xù)并有選擇性地被審慎選擇的有機溶劑從溶液中萃取出來。或者，可將要拆分的物質通過一根酶被固定在固體支持物上的柱子。
在多相條件下進行的酶催水解具有很差的可重復性。因此，優(yōu)選在均相條件下進行水解。醇溶劑不是優(yōu)選的，因為它們能使酶失活。通過使用非離子表面活性劑如Triton x-100能夠得到均相。然而，這些表面活性劑的加入不僅有助于溶解起始物質，還可以提高產品的水溶解性。因此，雖然酶反應在加入非離子表面活性劑時比在多相條件下能更有效地進行，但卻使回收的起始物質和產品的分離更加困難。產品可以用合適的層析和化學(如有選擇的鹽的形式)技術分離。二?；塑湛梢允褂茫鼈兂３＞哂泻芎玫挠H脂性而很難溶于所用介質中。
實施例2FTC酯的對映選擇性脂肪酶催化水解許多FTC 5′-O-?；苌锸峭ㄟ^±)-FTC N-鹽酸鹽的選擇性O-?；频玫?見表1和圖4)。在此已經檢查了脂肪酶對這些衍生物水解的效應。如表1所示，豬肝酯酶(PLE)對FTC(+)-對映體酯的水解顯示了高水平的選擇性，在HPLC-分析的混合物中主要剩下(-)-FTC丁酸酯。相反，PS-800優(yōu)先水解FTC(-)-對映體的酯，在HPLC-分析的混合物中主要剩下(+)-FTC丁酸酯。同時也發(fā)現(xiàn)水解的速度取決于酰基的性質；乙酰基衍生物明顯慢于丁?；苌铩，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FTC丙酸酯的水解速度甚至快于丁酸酯衍生物。回收百分數(shù)和對映體過量百分數(shù)都可用HPLC確定。盡管當使用PLE時對映選擇性非常好(一般為97％e.e.或更高)，但進一步的富集仍能通過連續(xù)酶催水解反應完成，在酶催水解反應中從PLE-催化水解中得到的對映體富集丁酸酯用PS-800進行酶催水解。
表1酯進行酶水解的效果對比被酶作用物回收％ E.E％(s.m)用PLE水解FTC酯 (-)-FTC(丁酸酯)乙酸酯32.68N.D.
丙酸酯39.87N.D.
丁酸酯48.0098丁酸酯45.7198.6用PS800水解FTC酯(+)-FTC(丁酸酯)乙酸酯73.17N.D.
丙酸酯52.67N.D.
丁酸酯58.34N.D.
戊酸酯41.5094實施例3通過FTC丁酸酯的對映選擇性脂肪酶催化水解制備(+)和(-)FTC的方法將(±)-FTC的5′-O-丁酸酯(0.47mmol，149mg)溶解在16ml pH為8的緩沖液CH3CN為4∶1的溶液中。將澄清溶液攪拌并用26mg豬肝酯酶(PLE-A)處理。反應進程由HPLC監(jiān)測(圖4)。20小時后(52％轉化)，用2×80mlCHCl3和80ml乙酸乙酯萃取反應混合物。將有機層萃取液合并，用無水MgSO4干燥，過濾并通過旋轉蒸發(fā)濃縮。將所得的殘余物在2×1000m PTLC盤上用乙酸乙酯洗脫(二次洗脫)，分離后得到53mg(以原料為基，36％)FTC丁酸酯，經HPLC分析確定該丁酸酯具有98％對映體過量(e.e.)。然后將對映體富集丁酸酯依次用1.6ml甲醇和0.38mmol(20mg)甲醇鈉處理。將所得混合物在室溫下攪拌，并用HPLC監(jiān)測反應過程。在30分鐘內反應完全。通過旋轉蒸發(fā)將溶劑除去得到白色固體的粗品(76mg)，將其在1000m PTLC上用5∶1的乙酸乙酯∶乙醇洗脫。分離得到(-)-FTC白色固體(33mg，產率82％)。FTC5′-O-乙酸酯衍生物的HPLC分析顯示97％e.e.；[α](20，D)-120.5°(C＝0.88，無水乙醇)。
通過向完成的反應混合物中加HCCl3(它也可使酶變性)，在真空下汽提溶劑然后用HCCl3萃取來避免在操作過程中出現(xiàn)乳濁液。
類似地，將1.2mmol(375mg)的(±)-FTC5′-O-丁酸酯溶解在40ml 4∶1 pH8緩沖溶液-CH3CN中。將澄清溶液攪拌并用58mg豬肝酯酶(PLE-A)處理。反應過程由HPLC監(jiān)測。90分鐘后(38％轉化)，將反應混合物加入150mlCHCl3中。將層分開并將水溶液層冷凍干燥以除去溶劑。將冷凍干燥后得到的白色殘余物用3×10ml無水乙醇萃取。將萃取液過濾，合并并真空濃縮得到的179mg油狀物粗品。將粗品在45×30mm的硅膠柱上先后用3×75ml乙酸乙酯和5∶1的乙酸乙酯-乙醇洗脫。分離得到(+)-FTC白色固體(109mg，根據起始丁酸酯計算產率為37％)。(+)-FTC的5′-O-乙酸酯衍生物的HPLC分析顯示97.4％e.e.；[α](20，D)+113.4°(C＝2.53；無水乙醇)。
用0.12mmol(37mg)FTC5′-O-丁酸酯和7mg在4.0ml4∶1 pH為8的緩沖液CH3CN中的PS-800可以進行類似的反應。該反應顯著地比用PLE-A要慢，需要74小時，59％轉化?；厥盏亩∷狨?11.4mg，起始量的31％)通過HPLC顯示94％e.e.。
在另一種實施方案中，胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶可用于拆分2-羥甲基-5-(胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷和其衍生物包括2-羥甲基-5-(5-氟-胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷的外消旋混合物。該酶催化胞嘧啶部分去氨基到尿嘧啶?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，1，3-氧硫雜核苷的一個對映體是胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶的較好底物。那個未轉化成尿嘧啶衍生物的對映體(并因此仍然是堿性)被一種酸性溶液從溶液中萃取出來。必須很小心以避免強酸溶液(pH低于3.0)因它可使氧硫雜茂烷環(huán)裂開。
胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶可以從鼠肝或人肝中分離出來，或從原核生物系統(tǒng)如E.CoLi.的重組體序列表達出來。
用胞苷-脫氧胞苷脫氨基酶拆分胞苷核苷對映體的方法能作為單獨的拆分方法或與其它方法聯(lián)合使用，其它的方法包括如上面所述的用酶催水解拆分5′-O-核苷酯。
上面所述用于拆分核苷對映體外消旋混合物的方法可以與其它常規(guī)的對映體拆分方法聯(lián)合使用。以提高最終產品的旋光純度。
常規(guī)的拆分方法包括許多物理和化學技術。通常最簡單及最有效的技術是重結晶，它基于這樣一條原則即外消旋體比相應的單個對映體更好溶解。重結晶可以在任何步驟包括在?；衔锘蜃罱K對映體階段進行。如果成功，這種簡單的方法可以代表選擇方法。
當重結晶不能得到可接受的旋光純物質時，可以用其它方法。如果核苷是堿性的(例如胞苷)，可以用能形成非對映體混合物的手性酸，此非對映混合物具有明顯不同的溶解性。手性酸的非限定性例子包括蘋果酸，扁桃酸，二苯甲?；剖?，3-溴樟腦-8-磺酸，10-樟腦磺酸及二-對甲苯?；剖?。類似地，用手性酸衍生物進行的游離羥基的酰化也可導致形成物理性質差別很大因而可以分離開的非對映體混合物。
小量的對映體富集核苷可通過將外消旋混合物通過一根為手性分離設計的HPLC柱而得到或純化，該柱包括由Rainin公司銷售的環(huán)糊精鍵合柱。
實施例4由HPLC分離核苷外消旋混合物(±)-FTC C4′-對映體的拆分可以用一根從Rainin公司(Woburn，Ma)得到的手性環(huán)糊精鍵合(環(huán)鍵合AC-I)柱來進行。條件如下Isocratic 0.5％甲醇水溶液流速1ml/min.，在262nm UV檢測。從J.T.Baker(Phillipsburg，N.I)得到HPLC級甲醇。將外消旋混合物注射進去并收集餾分。集中含單一對映體的餾分，冷凍然后冷凍干燥。化合物通過UV光譜及其HPLC保留時間來鑒定。通常，(-)-對映體比(+)-對映體具有較短的保留時間(參見J.Liquid Chromatography7353-376，1984)。化合物的濃度由UV光譜測定，用已知濃度(15μM)的標準水溶液進行生物學評價。每種對映體的保留時間列于表2。
表2FTC對映體的保留時間化合物 Rf(min)(-)-FTC8.3(+)-FTC8.7實施例5 用手性柱分離FTC對映體的另一種方法用一根環(huán)鍵合I-AC柱(5μm，25cm×4.6mm，Rainin公司，Woburn，MA，類號AST-41049)，流速為0.6ml/min的0.5％恒溶劑成分的甲醇(Fisher Scientific，Inc.HPLC級，類號A-452-4，在水中)，在262nm處進行UV檢測，F(xiàn)TC對映體的保留時間分別是12.68分鐘((-)-FTC)和13.20分鐘((+)-FTC)。
用一根Chiralpak AS柱(10μm，25cm×4.6cm，J.T.Baker，Inc.Philli sburg，NJ，類號7406-00，序號09-29-10320)，流速為0.8ml/min的異丙醇(HPLC級，fisher Scientific，Inc.，類號A-451-4)，在262nm處進行UV檢測，F(xiàn)TC對映體的保留時間分別是5.9分鐘((-)-FTC)和9.8分鐘((+)-FTC)。
通常，理想的情況是第一步先篩選大量核苷外消旋混合物以確定哪一個可進一步拆分成對映體富集組分并進行進一步的抗病毒活性評價。核苷抑制HIV的能力可通過許多試驗技術來測定。這里所用的技術(下面詳細加以描述)能測定對植物血球凝集素(PHA)中病毒復制的抑制作用，其中植物血球凝集素能刺激感染HIV-1(LAV鏈)的人體外周血液單核(PBM)細胞。產生的病毒量能通過測量病毒編碼逆轉錄酶素確定。所產生的酶的量與產生的病毒量成比例。表3提供了許多(±)-1，3-氧硫雜茂烷和核苷的EC50值(抑制PBM細胞中50％病毒復制的核苷的濃度，估計10％誤差率)和IC50值(抑制促細胞分裂劑刺激的未感染人體PBM細胞中的50％生長的核苷濃度)。
實施例6 (±)-1，3-氧硫雜茂烷核苷的抗HIV活性A、將從肝炎B和HVI-1血清陰性健康供體得到的三天齡植物血球凝集素刺激的PBM細胞(105細胞/ml)感染濃度約為每ml50％組織培養(yǎng)感染劑量(TICD50)100倍的HIV-1(LAV鏈)，并將其在有或沒有各種濃度的抗病毒化合物存在的情況下培養(yǎng)。
B、大約感染1小時后，將介質在有受試化合物(在介質中二倍于最終濃度)或沒有的情況下加入燒瓶中(5ml，最終體積10ml)AZT用作陽性對照。
C、將細胞與病毒(約2×105dpm/ml，用逆轉錄酶分析加以確定)接觸并置于CO2恒溫箱中。從Atlanta，Georgia的疾病控制中心得到HIV-1(LAV鏈)。用于培養(yǎng)PBM細胞，獲得病毒和測定逆轉錄酶活性的方法如McDougal等人(J.Immun.Meth.76，171-183，1985)和Spira等人(J.Clin.Meth.25，97-99，1987)所描述，只是兩性霉素B不包括在介質中(參見Schinazi等人著Antimicrob.Agents Chemother.32，1784-1787(1988)；Id.，341061-1067(1990))。
D、第6天，將細胞和上清液轉移到15ml試管中并在約900g下離心10分鐘。除去5ml上清液并將病毒在40000rpm下離心30分鐘(Beckman70.1Ti旋度)而濃縮。將增溶了的病毒丸進行逆轉錄酶水平的測定。結果用dpm/ml樣品上清液表示。來自較小體積上清液(1ml)的病毒在增溶和確定逆轉錄酶水平前可以離心濃縮。
半數(shù)有效(EC50)濃度可用半數(shù)有效方法(Antimicrob.AgentsChemother.30，491-498(1986))來確定。簡單地說，病毒抑制的百分數(shù)(由逆轉錄酶的測定方法來確定)是相對于化合物，微摩爾濃度測定的。EC50是化合物抑制50％的病毒生長的濃度。
E、將促細胞分裂劑刺激的未感染人體PBM細胞(3.8×105個細胞/ml)在有和無藥物存在下，在類似于上面描述的用于抗病毒分析的條件下進行培養(yǎng)。6天后，用血球計數(shù)器和錐蟲藍排除法計算細胞，如Schinazi等人著Antimicrobial Agents andChemotherapy，22(3)，499(1982)所描述。IC50是抑制50％的正常細胞生長的化合物濃度。
表3人體PBM細胞中1，3-氧硫雜茂烷核苷的各種類似物的EC50和IC50抗病毒 胞毒性代碼 X或YREC50，μM IC50，μmDLS-009X＝0H＞100 ＞100DLS-010X＝0Me 64.4＞100DLS-027X＝0F＞100 ＞100DLS-028X＝0Cl 60.8＞100DLS-044X＝0Br ＞100 ＞100DLS-029X＝0I＞100 ＞100DLS-020Y＝NH2H0. 02 ＞100DLS-011Y＝NH2Me ＞10＞100DLS-022Y＝NH2F0.01＞100DLS-023Y＝NH2Cl 38.7＞100DLS-021Y＝NH2Br 77.4＞100DLS-026Y＝NH2I0.72＞100DLS-058(-) Y＝NH2F0.008 ＞100DLS-059(+) Y＝NH2F0.84＞100DLS-053Y＝NH2CF360.7＞100DLS實驗室筆記本上的標號。
如表3所示，通常，取代的胞嘧啶1，3-氧硫雜茂烷核苷比相應的尿嘧啶核苷具有更高的活性。在EC50和IC50的測定中誤差約為±10％。
(±)-FTC中的一個化合物(指“DLS-022”，化合物8)不僅具有優(yōu)越的活性(PBM細胞中約10nm)而且具有相當?shù)偷亩拘?＞100μM，在PBM，Vero和CEM細胞中)。進一步說，F(xiàn)TC的(-)-對映體(DLS-058)比外消旋混合物具有明顯強的活性。
(±)-FTC的IC50大于100μM，它表明該化合物在未感染PBM細胞中濃度達到100μM仍不具有毒性。
實施例7 由HPLC拆分的FTC對映體的抗病毒活性用實施例4的方法將FTC對映體分離，并用實施例6的方法評價抗病毒活性。結果列于表4中，并在圖5中加以說明。
表4FTC(+)和(-)對映體的抗病毒活性處理濃度 DPM/ml抑制％EC50μMμm (修正后)FTC(±)0.000173,75526.6 0.0180.005 83,00516.30.01 60,46541.30.05 34,12070.40.1 14,16092.40.5 18,09588.11 7,555 99.75 7,940 99.3105,810 101.7FTC(-)0.001 76,27523.8 0.020.005 58,59043.30.01 75,35024.80.05 28,89076.20.113,17593.50.59,485 97.6FTC(+)0.001 94,3403.8 0.280.005 107,430 -10.60.01 99,465-1.8
0.05 87,120 11.80.1 86,340 12.70.5 33,225 71.4如表4所示，在該試驗中FTC(-)-對映體比(+)-FTC對映體強約一個數(shù)量級，與外消旋混合物具有幾乎相同的抗-HIV活性。無論是對映體還是外消旋混合物，在人體PBM細胞中如錐蟲藍排除法所測定的那樣直到100μM才具有毒性。
實施例8 由實施例3的方法拆分的FTC對映體的抗病毒活性(±)-FTC的對映體可由實施例3的方法進行拆分，其抗病毒活性由實施例6的方法評價。結果在圖6中說明。如圖6所示，F(xiàn)TC外消旋混合物的EC50為0.017μM，(-)-FTC的EC50為0.0077μM，(+)-FTC的EC50為0.84μM。
實施例9 人體PBM細胞對(±)-FTC的吸收用放射標記的FTC進行該研究以追蹤細胞內檢測到的母體藥和代謝物的細胞內模型。所有的研究均以兩份進行。將人體外周血液單核細胞(PBM細胞)懸浮在含10％胎牛血清和抗生素的RPMI1640介質中(2×106細胞/ml)每個時間點10ml，并加入10μMFTC進行培養(yǎng)(特殊活性約700dpm/pmol)。細胞與藥物接觸2，6，12及24小時。在這些時間點，除去介質并用冷的Hank平衡鹽溶液洗滌兩次。加入0.2ml 60％冷甲醇/水進行萃取并在-70℃儲存過夜。第二天早晨，將懸浮液在-70℃，0.5小時內離心并萃取二次。將所有上清液(0.6ml)冷凍干燥至干。將殘余物再次懸浮在250μl水中并將50和100μl之間的等分試樣進行HPLC分析。由HPLC對細胞內母體藥和代謝衍生物定量。由于某些化合物的潛在的酸不穩(wěn)定性，需使用一種接近于生理pH的緩沖系統(tǒng)以分離代謝物。
圖7是在人體PBM細胞中氚化(±)-FTC(兩種測定的平均)出現(xiàn)(吸收)的時間(小時)與pmol/106細胞的關系圖。吸收情況的研究表明放射標記的FTC很容易被人體淋巴細胞吸收，它可以產生很大量的FTC5′-三磷酸酯衍生物。
實施例10 在各種細胞系中FTC的抗逆病毒活性用與實施例6中相似但并不相同的方法來測定在一系列細胞系中FTC的抗逆病毒活性。細胞系從人供體，AIDS Research和Reference Reagent Program，NIH，Rockville，Maryland，ATCC或紅十字得到。CEM胸苷激酶缺乏的細胞可以在5-溴-2′-脫氧尿嘧啶的存在下，由CEM細胞的連續(xù)病原體的培育得到。結果列于表5中。
表5在不同的細胞系統(tǒng)中FTC抗逆病毒活性細胞系統(tǒng)EC50(μM)(病毒鏈) (±)-FTCHIV-1PBMC(LAV-1) 0.027MT2(HTLVIIIB) 0.89CEM(LAV-1) 0.08CEM-TK(-)(LAV-1)0.026CEM(HTLVIIIB)NIH0.09HIV-2PBMC(ROD2) 0.0038(±)-FTC0.0007(-)-FTC0.026(+)-FTCSIVAA-2(SIV251) 4.6C-8166(SIV251) ＜8.0FIVCrFK(61E)≤1實施例11來自人體PBM細胞的(±)-FTC在介質中與藥物培養(yǎng)24小時后，用放射標記的FTC進行該研究以追蹤細胞內檢測到的母體藥和代謝物的細胞內模型，然后除去藥物。該研究測定了使細胞內三磷酸酯水平降低所需的時間。該研究重復進行。將未感染的細胞(2×105ml)懸浮在用血清補充(每個時間點10ml)的介質中并在37℃下于5％CO2的恒溫箱中培養(yǎng)。放射標記的FTC的濃度是10μM。將細胞用標記化合物脈沖24小時后，將細胞充分洗滌，然后用新鮮介質在無抗病毒藥的存在下填充(0小時)。在0，2，4，6，12，24和48小時(第二次培養(yǎng)時間)時，除去細胞，并立刻用60％冷甲醇/水萃取。離心得到萃取液并除去細胞丸。將萃取液冷凍干燥然后在-70℃下儲存。分析前，將物質再次懸浮在250微升HPLC緩沖液中并立即分析。通過HPLC，用粉粒學或HewlettPackard模型1090PHLC系統(tǒng)與一根陰離子交換Partisil 10 SAX柱(Whatman公司)，在1ml/min的流速，1Kpsi壓力下，在262nm進行UV檢測的情況下進行細胞內母體藥和代謝衍生物的定量。流動相包括去離子化水(A)，2mM NaH2PO4/16mM NaOAc(pH＝6.6)(B)，15mM NaH2PO4/120.2mM NaOAc(pH＝6.6)(C)和100mM NaH2PO4/800mM NaOAc(pH＝6.6)(D)。
分離方法用A isocratic5分鐘，再進行15分鐘線性梯度變化到100％B，接著進行20分鐘線性梯度變化到100％C，接著進行10分鐘線性梯度變化到100％D，然后用100％D進行30分鐘isocratic。
在人體細胞中的保留時間(分鐘)化合物 未變 單磷酸酯 二磷酸酯 三磷酸酯(±)-FTC 5.039.055.0 68.0
圖8是藥物除去數(shù)小時后測得的從人體PBM細胞得到的放射標記的(±)-FTC與濃度(Pmol/106細胞)的關系圖。如圖中所示，F(xiàn)TC-三磷酸酯的細胞內半衰期約為12小時，它們可以在1-5μM濃度下在細胞外藥物除去48小時后很容易地在細胞內檢測到，對化合物來說這遠高于EC50。進一步說，使用HIVRT，(±)-FTC三磷酸酯的親和力(K1)為0.2μM，它低于48小時濃度水平。
實施例12 藥物上可接受的(±)-FTC衍生物的抗-HIV活性。
a、使用與實施6中描述的相似方法，可以對由5’和N4位衍生制的許多藥物上可以接受的(±)-FTC衍生物進行PBM細胞抗-HIV活性的評價，結果如下。(±)-FTC5’-O-丁酸酯的EC50為0.0017。(±)-FTC N4-乙?；苌锏腅C50為0.0028。(±)-FTC5’-O-丁酸酯，N4酯的EC50為0.0058。
b、在MT4系統(tǒng)中(±)-FTC5’-O-丁酸酯的抗-HIV活性(EC50)為0.04μM。在同樣的分析中，未?；?±)-FTC的IC50為0.52μM。在該系統(tǒng)中AZT的IC50為0.09μM。
實施例13 在2.2.15細胞培養(yǎng)中對FTC的(+)和(-)對映體活性的評價對FTC對映體在2.2.15細胞培養(yǎng)(由肝炎病毒粒子轉化成HepG2細胞)中抑制病毒生長的能力在下面詳細加以描述。
在該培養(yǎng)體系中對抗病毒效果分析的總結和描述以及對HBV DNA的分析已經有所描述(korba和Milman，1991，AntiviralRes.15217)?？共《镜脑u價在細胞的兩個不同病原體培養(yǎng)物中進行。在所有盤上的所有阱中以相同密度同時接種。
由于細胞內和細胞外的HBV DNA水平固有的不同，只有比未處理細胞中HBV DNA體的平均水平降低3.5倍(對HBV病毒粒子DNA)或3倍(對HBV DNA復制中間體)以上才被認為具有統(tǒng)計學意義[P＜0.05]。在每個細胞DNA制備中整合進去的HBV DNA的水平(在這些試驗中在每個細胞基礎上它保持不變)用于計算細胞內HBV DNA體的水平，以保證在每個樣品之間進行等量細胞DNA的比較。
在未處理細胞中外HBV病毒粒子DNA的值在50到150pg/ml培養(yǎng)介質之間(平均值約為76pg/ml)。在未處理細胞中細胞內HBV DNA復制中間體在50到100pg/μg細胞DNA之間(平均值約為74pg/μg細胞DNA)?？偟膩碚f，由于用抗病毒化合物處理引起的細胞內HBV DNA水平的下降比HBV病毒粒子DNA水平的下降更不明顯且更慢發(fā)生(korha和Milman，1991，Antiviral Res.，15217)。
這些試驗的雜化分析顯示每個細胞約1.0pg細胞內HBVDNA等價于2-3個染色體復制品，1.0pg/ml細胞外HBV DNA等價于3×105病毒粒子/ml。
進行一些毒性分析以評價是否任何可以觀察到的抗病毒效果都是由影響細胞的生活力引起的。這里所用的方法是中性紅色染料吸收法，它是一種標準且廣泛用于分析各種病毒宿主系統(tǒng)包括HSV和HIV中細胞生活力的方法。毒性分析是在96阱平底組織培養(yǎng)盤中進行。將用于毒性分析的細胞進行培養(yǎng)并用與下面抗病毒評價中所述的相同的程序用參試化合物進行處理。每種化合物在4種濃度下進行試驗，每個都在三重培養(yǎng)基中(“A”，“B”和“C”阱)。通過中性紅色染料的吸收來確定毒性的相對水平。用內在染料在510nm處的吸收(Asin)作定量分析。用未處理細胞的9個獨立培養(yǎng)基中的Asin均值的百分數(shù)來表示該值，這些未處理細胞同受試化合物一樣保持在同一個96阱盤上。5號盤上9個對照培養(yǎng)基中染料吸收的范圍是91.6％到110.4％，6號盤是96.6％到109％。結果列于表6中。
表6在2.2.15細胞中受試化合物的毒性分析濃度染料吸收(對照的％)盤號 化合物 (μM)阱A 阱B 阱C5DMSO 10.0*0.7 1.6 0.93.3 55.968.7 61.71.0 91.296.4 106.80.3 98.7102.993.56(-)-FTC300 53.051.1 51.5100 64.166.6 77.630 98.794.3 96.410 94.394.9 92.26(+)-FTC300 43.456.7 58.5100 77.766.3 72.1
30 81.1 88.3 88.110 90.9 99.4 90.5*對DMSO，濃度用原料溶液的百分數(shù)表示。
如表6所示，在用于抗病毒評價的濃度下沒有觀察到受試化合物具有明顯的毒性(在未處理細胞中觀察到的染料吸收水平降低了50％以上)。受試化合物(-)-FTC和(+)-FTC在用于毒性試驗的最高濃度下(330μM)都顯示出毒性。
在正常變化范圍內，未處理細胞中HBV病毒粒子DNA和細胞內HBV復制中間體[HBV RI]的水平在攻擊期間保持不變。在1％濃度下，DMSO不影響2.2.15細胞培養(yǎng)基中HBV的復制水平。
如表7所示，(-)-FTC和(+)-FTC在試驗水平上都能明顯地抑制HBV的復制。如表8所示，(-)-FTC在4，1和0.25μM的濃度下還能明顯地抑制HBV病毒粒子DNA和細胞內HBV DNA的合成。
表7在2.2.15細胞培養(yǎng)基中試驗化合物對HBV生成的影響HBV病毒粒子DNA*細胞內HBV DNA(pg/ml培養(yǎng)介質)(pg/μg細胞DNA)阱 處理情況0天 4天 9天 MONO. RI.7A 未處理細胞 59 75 94 2.7 937B 未處理細胞 47 64 88 2.5 938A 未處理細胞 65 100 71 2.2 978B 未處理細胞 77 65 110 2.4 627K DMSO@1.00％ 100 50 48 1.9 957L DMSO@1.00％ 48 96 54 2.8 988K DMSO@1.00％ 93 63 68 2.2 868L DMSO@1.00％ 66 57 59 1.6 979U (-)-FTC@10μM 120 36 11.1 149V (-)-FTC@10μM 89 48 11.5 1910U (-)-FTC@10μM 58 41 0.1 1.9 1310V (-)-FTC@10μM 110 32 0.1 1.2 169W (+)-FTC@10μM 88 42 0.1 0.8 149X (+)-FTC@10μM 58 57 0.2 0.4 1910W (+)-FTC@10μM 69 55 0.1 0.7 1710X(+)-FTC@10μM45 390.10.4 15*對HBV病毒粒子DNA敏感性中止點是0.1pg/ml。
@將細胞內HBV DNA在處理的第9天進行24小時分析。在每個細胞DNA的制備中整合HBV DNA的水平用于計算游離基因的3.2Kb HBV染色體(MONO.)水平和HBV DNA復制中間體(RI)的水平。
表8在2.2.15細胞培養(yǎng)基中試驗化合物對HBV生成的影響HBV病毒粒子DNA*細胞內HBV DNA*(pg/ml培養(yǎng)介質)(pg/μg細胞DNA)阱處理情況 0天 4天 9天MONO.RI.31A 未處理細胞 645465 2.8 6531B 未處理細胞 515477 2.0 5332A 未處理細胞 100 7656 3.5 8132B 未處理細胞 539783 3.1 6835A (-)-FTC@4μM 7427＞0.1 1.4 135B (-)-FTC@4μM 8728＞0.1 0.5 136A (-)-FTC@4μM 120 201 0.9 136B (-)-FTC@4μM 59160.20.2 235C (-)-FTC@1μM 7013＞0.1 1.7 235D (-)-FTC@1μM 62 15＞0.1 1.2336C (-)-FTC@1μM 60 221 1.4236D (-)-FTC@1μM 89 280.3 1.5435E (-)-FTC@0.25μM 84 15＞0.1 1.5435F (-)-FTC@0.25μM 89 164 2.2436E (-)-FTC@0.25μM 66 131 1.8836F (-)-FTC@0.25μM 49 190.1 0.39*對HBV病毒粒子DNA敏感性中止點是0.1pg/ml。
+將細胞內HBV DNA在處理的第9天進行24小時分析。在每個細胞DNA的制備中整合HBV DNA的水平用于計算游離基因的3.2Kb HBV染色體(MONO.)和HBV DNA復制中間體(RI)的水平。
實施例14 人體肝細胞對(±)-FTC的吸收，F(xiàn)TC的HVB活性用人體肝細胞(HePG2細胞，從ATcc得到)重復實施例9的方法以確定FTC在這些細胞中的吸收和代謝。如圖9所示，(±)-FTC被HePG2細胞大量吸收。這些人體肝細胞將大部分(±)-FTC代謝成(±)-FTC三磷酸酯。
這個數(shù)據與這里提供的其它數(shù)據結合在一起表明(±)-FTC及其(-)，(+)對映體在肝細胞中被磷酸化。這些細胞可以被肝炎B病毒轉化。
實施例15在人體HepG2細胞中FTC的存在圖10說明了細胞用10μM[3H]-(±)FTC(700DPM/Pmol)脈沖24小時后，[3H]-(±)-FTC和其磷酸化衍生物在人體HepG2中的存在情況，用Pmol/106細胞對時間表示，并評價了除去后24小時內化合物的濃度。
表11說明了用10μM[3H]-(±)-FTC (700DPM/Pmol)培養(yǎng)24小時后，來自人體HePG2細胞中的[3H]-(±)-FTC和其磷酸化衍生物混合濃度的降低情況，用Pmol/106細胞對時間的關系表示。
如表中說明的那樣，甚至在48小時時細胞中仍存在1μM以上的活性化合物(對化合物而言這明顯高于EC50)。
實施例16 FTC對粒細胞-巨噬細胞前體細胞群體形成的影響圖12是FTC(-)和(+)對映體對粒細胞-巨噬細胞的前體細胞群體形成的影響圖，用存活百分數(shù)對濃度μM來測定，(-)-FTC為空心圈；(+)-FTC為實心圈；AZT為實心方塊。如圖所示，在該細胞系中，F(xiàn)TC(-)對映體比(+)-對映體或AZT均具有較小的毒性，即具有較高的IC50。
實施例17給大鼠服用后FTC的代謝物在10，50和100mg/kg的劑量下給大鼠靜脈施用(±)-FTC，并評價血漿藥物濃度對時間曲線下的面積(AUC)，總清除率(CLT)，穩(wěn)態(tài)分布體積(Vss)，平均保留時間(MRT)和半衰期(t1/2)。結果列于表9中。
表9給大鼠靜脈注射10，50，100mg/kg FTC后的藥物動力學參數(shù)*劑量AUC CLTVssMRT t1/2mg/kg mg h/LL/h/kg L/k8 h h10 9.65 0.9880.7580.768 0.75750 57.11 0.8740.6990.800 0.815100 120.720.8300.6630.798 0.969*AUC＝血漿藥物濃度對時間曲線下的面積；CL＝總清除率；Vss＝穩(wěn)態(tài)分布體積MRT＝平均保留時間t1/2＝半衰期實施例18 靜脈和口服FTC后FTC的藥物動力學參數(shù)給獼猴施用(靜脈(I.V.)和口服(P.O))33.3mg/kg(±)-FTC得到模型獨立的藥物動力學參數(shù)。結果列于表10中。值得注意的是，猴子對化合物的平均生物利用率為73％(±6％)。
表10給獼猴靜脈(I.V.)或口服(P.O.)33.3mg/kgFTC后得到的模型獨立的藥物動力學參數(shù)*猴 AUC CLTVssMRTt1/2KamgFh/h/kgL/kgh h h-1％I.V.RUh 19.14 1.742.71 1.56 1.28RMi 26.31 1.261.97 1.56 1.22RJd 22.51 1.482.00 1.36 1.47平均值 22.65 1.492.23 1.49 1.32±S.D. 3.590.240.42 0.12 0.13P.O.RUh 13.21 2.07 1.580.48 71RMi 21.11 2.32 1.080.43 80RJd 15.29 3.23 1.470.31 68平均值 16.54 2.54 1.380.41 73.00(±6)±S.D. 4.09 0.61 0.260.09 6.24*AUC＝血漿藥物濃度對時間曲線下面的面積；CL＝總清除率；Vss＝穩(wěn)態(tài)分布體積；MRT＝平均保留時間；t1/2＝半衰期；F＝生物利用率；Ka＝第一吸收速度常數(shù)。
表11處理1小時后FTC及其去氨基代謝物的CSF/血清比率猴 途徑 FTC代謝物(FTU)RUhI.V. 0.076 0.024RMiI.V. 0.662 0.032RJdI.V. 0.162 0.052平均值0.100 0.036±S.D.0.054 0.614RUhP.O. 0.048 0.026RMiP.O. 0.039 0.037RJdP.O. 0.117 0.055平均值0.068 0.039±S.D.0.043 0.015實施例19 獼猴中FTC及其代謝物的CSF/血清比率通過給獼猴服用33.3mg/kg活性化合物并在服藥后1小時內測量大腦脊髓液(CSF)和血清中(±)-FTC的量來評價(±)-FTC穿過血腦屏障的能力。結果列于表11中。數(shù)字表明在該哺乳動物中大量活性化合物穿過血腦屏障。
患有HIV或HBV感染性疾病的患者可通過服用有效量的(±)-FTC，其(-)或(+)對映體或藥物上可接受的衍生物或其鹽在有藥物上可接受的載體或稀釋劑存在下進行治療?；钚晕镔|可通過任何合適的途徑以液體或固體的形式施用，例如口服，非腸道，靜脈，肌肉，皮下或局部施用。
活性化合物包括藥物上可接受的載體或稀釋劑，以治療有效量的化合物提供給患者以抑制病毒在體內的復制，特別是HIV和HBV的復制，同時對服藥患者不引起嚴重的毒性作用?！耙种屏俊笔侵赴l(fā)揮抑制作用足夠的活性成份的量，該抑制作用例如由這里描述的一種方法來測定。
對上面提到的所有情況，(-)，(+)或(±)-FTC的優(yōu)選劑量為每天約1到50mg/kg，優(yōu)選1到20mg/kg體重，更為常用的是每天每千克體重要0.1到約100mg。藥物上可接受衍生物的有效劑量范圍根據釋放出母體核苷的重量來計算。如果衍生物本身具有活性，有效劑量則可用衍生物的重量如上所述那樣來估計，或用本領域技術人員公知的其他方法來估計。
該化合物可以以任何合適的劑型單位方便地施用，包括但并不限于每單位劑型含7到3000mg，優(yōu)選70到1400mg活性組分。50-1000mg的口服劑量是合適的。
理想的情況是，施用的活性組分能達到活性化合物的血漿峰濃度，即從約0.2到70μM，優(yōu)選約1.0到10μM。這是可以達到的，如通過靜脈注射0.1到5％的活性化合物或任意鹽溶液，或服用活性組份的大丸藥。
藥物組合物中活性化合物的濃度依賴于藥物的吸收，去活性和排泄速度以及本領域技術人員已知的其它因素。需要注意的是劑量值也隨著需緩解狀況的嚴重程度而有所變化。需要進一步理解的是對于特殊的情況，特殊的劑量規(guī)定應該按照個人的需要和施用或監(jiān)督服用該組合物的人的專門判斷，通過一定的時間加以調整，并且這里提出的濃度范圍僅作示范并不限制權利要求組合物的范圍或實施。活性組分可以一次服用，或分成許多較小的劑量在不同的時間間隔內服用。
活性化合物優(yōu)選的施用方式是口服。口服組合物通常包括一種惰性稀釋劑或可食用的載體。可以將它們封閉在膠囊中或壓成片劑。為了治療上口服的目的，活性化合物可以和賦形劑結合并以片劑，錠劑或膠囊的形式使用。藥學上可容的凝固劑和/或輔助物質也作為組合物的組成部分。
片劑，丸劑，膠囊，錠劑等等包含下面任何組份或具有相似性質的化合物凝固劑如微結晶纖維素，黃蓍樹膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖，崩解劑如藻酸，Primogel或玉米淀粉；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes；滑劑如膠體二氧化硅，加甜劑如蔗糖或糖精；或調味劑如薄荷，水楊酸甲酯或桔味劑。當單位劑型是膠囊時，它除了包含上面各類物質外還包含液體載體如脂肪油。此外，單位劑型可以包含改良單位劑型物理形狀的其它物質如糖衣，紫膠片或其它腸劑。
(±)-FTC，其(-)或(+)對映體或其藥物上可接受的鹽可作為酏劑，懸浮液，糖漿，糯米紙囊劑，口香膠囊等的組份服用。糖漿除了包含活性化合物外還包含蔗糖作為加甜劑和某些防腐劑，染料和著色劑及調味劑。
(±)-FTC，其(-)或(+)對映體或其藥物上可接受的衍生物或鹽也可以和其它不削弱所需作用的活性物質混合，或與具有增補所需作用的物質混合，如抗生素，抗真菌劑，消炎劑或其它抗病毒劑，包括其它核苷抗HIV化合物。
用于非腸道，肌內，皮下或局部施用的溶液或懸浮液包括下列成份用于注射的無菌稀釋劑如水，鹽水溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑如芐基醇或對羥基苯甲酸甲酯，抗氧劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖液如乙酸鹽，檸檬酸鹽或磷酸鹽以及用于調節(jié)強度的試劑如氯化鈉或右旋糖。非腸道制劑可以密封在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多劑量管瓶中。
如果是靜脈給藥，優(yōu)選的載體是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水液(PBS)。
在優(yōu)選實施方案中，將活性化合物與載體一起制備，這將保護該化合物免于從身體內快速消除，作為可控釋放劑型它包括移植物和微囊包封系統(tǒng)?？梢允褂蒙锝到?，生物相溶聚合物如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚甘醇酸，膠原蛋白，聚原酸酯和聚乙酸。這些劑型的制備方法對本領域技術人員來講是顯而易見的。在商業(yè)上這些物質也可以從Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc.得到。
脂質體懸浮液(包括脂質體，該脂質體帶有相對于病毒抗原的單克隆抗體以對準感染細胞)也是優(yōu)選的藥物學上可接受的載體。它們可以按照本領域技術人員公知的方法制備，例如美國專利4522811中所描述的方法(這里，該專利作為參考，全文加以收編)。例如，脂質體劑型可制備如下將合適的脂(類)(例如硬脂?；字Ｒ掖及罚仓；字Ｄ憠A，arachadoyl磷脂酰膽堿和膽甾醇)溶解在無機溶劑中，然后將其蒸發(fā)，在容器的表面蓋一薄層干脂。然后將活性化合物或其單磷酸酯，二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液引入容器中。然后用手使容器旋轉直至脂從容器側面游離且脂聚集體分散為止，這樣就形成了脂質體懸浮液。
FTC的單，雙及三磷酸酯可按如下所述方法制備。
單磷酸酯可按Imai等人著J.Org.Chem.，34(6)，1547-1550(1969年6月)的方法制備。例如，在約0℃并攪拌的情況下，將約100mg FTC和約280μl的磷酰氯在約8ml無水乙酸乙酯中反應約4小時。將反應物用冰驟冷。水相在一根活性碳柱上純化，用在1∶1乙醇和水的混合物中的5％氫氧化銨洗脫。蒸發(fā)洗脫劑得到FTC-5′-單磷酸銨。
二磷酸酯可按Davisson等人著J.Org.Chem.，52(9)，1794-1801(1987)的方法制備。FTC二磷酸酯可由相應的甲苯磺酸酯制得，相應的甲苯磺酸酯可將核苷與甲苯磺酰氯在吡啶中于室溫下反應約24小時制得，按常規(guī)方法處理產品(即將其洗滌，干燥并結晶)。
三磷酸酯可按Hoard等人著J.Am.chem Soc.，87(8)，1785-1788(1965)的方法制備。將FTC活化(制成咪唑烷，按本領域技術人員公知的方法)并用在DMF中的三丁基焦磷酸銨處理。該反應主要得到核苷的三磷酸酯，還有一些未反應的單磷酸酯和二磷酸酯。用DEAE柱的陰離子交換層析將其純化，然后分離出三磷酸酯，例如四鈉鹽。
本發(fā)明已對其優(yōu)選的具體實施方案做了詳述。從本發(fā)明前面的詳細描述中本領域的技術人員可以很明顯地看到本發(fā)明的各種變化和改良。所有這些變化和改良都包括在附加的權利要求范圍內。
權利要求
1. 2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)，-1，3-氧硫雜茂烷，其生理學上可接受的衍生物，或其生理學上可接受的鹽。
2.分離的對映體(一)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，其生理學上可接受的衍生物，或生理學上可接受的鹽。
3.權利要求1或2的衍生物
其中R1和R2分別為烷基；一個羧酸酯，其中酯基的非羰基部分選自以下基團直鏈的，支鏈的，環(huán)狀的烷基；烷氧基烷基，芳烷基；芳氧基烷基；芳基包括任意被鹵素，C1-C4烷基，或C1-C4烷氧基取代的苯基；磺酸酯；烷基或芳烷基磺?；粏?，二，三磷酸酯；或氨基酸酯，及R1和R2之一是氫。
4.權利要求3的衍生物，其中R1和R2分別選自以下基團甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，己基，異丙基，異丁基，仲-丁基，叔-丁基，異戊基，正戊基，叔-戊基，3-甲基丁酰基，氫琥珀酰基，3-氯苯甲酸酯，環(huán)戊基，環(huán)己基，苯甲酰基，乙酰基，新戊酰，甲磺?；?，丙酰基，丁?；祯；?，己、辛、癸酸、月桂酸、肉豆寇酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸的?；?，氨基酸包括，但不限于丙氨?；?，纈氨?；涟滨；惲涟滨；滨；?，苯丙氨?；?，色氨?；琢虬滨；?，甘氨?；?，絲氨?；?，蘇氨?；?，半胱氨酰，酪氨?；?，天冬酰胺酰基，谷氨酰胺?；?，天冬氨?；劝滨；?，賴氨?；?，精氨?；徒M氨酰，及R1和R2之一可以是氫。
5.按照權利要求4的衍生物，其中R1是正丙基，而R2是氫。
6.富于對映體形式的(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷。
7.一種藥物組合物，它包括在藥學上可接受的載體中的治療人類HIV感染的有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
8.一種藥物組合物，它包括在藥學上可接受的載體中的治療人類HIV感染的有效量的作為分離的對映體(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
9.一種藥物組合物，它包括在藥學上可接受的載體中的治療人類HIV感染的有效量的富于對映體形式的(-)-β-L-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
10.一種藥物組合物，它包括在藥學上可接受的載體中的治療人類HBV感染的有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
11.一種藥物組合物，它包括在藥學上可接受的載體中的治療人類HBV感染的有效量的分離的對映體(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
12.一種藥物組合物，它包括在藥學上可接受的載體中的治療人類HBV感染的有效量的富于對映體形式的(-)-β-L-羥甲基-5(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
13.權利要求7、8、9、10、11或12的組合物，其中載體是適合于口服的。
14.權利要求7、8、9、10、11或12的組合物，其中載體包括膠囊。
15.權利要求7、8、9、10、11或12的組合物，其中載體是片劑形式。
16.一種治療人類感染的HIV的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
17.一種治療人類HIV感染的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的分離的對映體(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
18.一種治療人類HIV感染的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的富于對映體形式的(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
19.一種治療人類HBV感染的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
20.一種治療人類HBV感染的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的分離的對映體(-)-β-L-2-羥甲基-5-(5-氟胞嘧啶-1-基)-1，3-氧硫雜茂烷，或其生理學上可接受的鹽。
21.一種治療人類HIV感染的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的以下結構式的化合物
其中R1和R2分別為烷基；一個羧酸酯，其中酯基的非碳基部分選自以下基團直鏈的、支鏈的，環(huán)狀的烷基；烷氧基烷基，芳烷基；芳氧基烷基；芳基包括任意被鹵素，C1-C4烷基，或C1-C4烷氧基取代的苯基；磺酸酯；烷基或芳烷基磺酰基；單，二，三磷酸酯；或氨基酸酯，及R1和R2之一是氫。
22.一種治療人類HBV感染的方法，包括施用在藥學上可接受的載體中有效量的以下結構式的化合物
其中R1和R2分別為烷基；一個羧酸酯，其中酯基的非碳基部分選自以下基團直鏈的、支鏈的，環(huán)狀的烷基；烷氧基烷基，芳烷基；芳氧基烷基；芳基包括任意被鹵素，C1-C4烷基，或C1-C4烷氧基取代的苯基；磺酸酯；烷基或芳烷基磺?；粏?，二，三磷酸酯；或氨基酸酯，及R1和R2之一是氫。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于治療人類HIV和HBV感染的方法和組合物,包括施用在藥學上可接受的載體中的有效量的2－羥甲基－5－(5－氟胞嘧啶－1－基)－1,3－氧硫雜茂烷,其藥學上可接受的衍生物包括5’或N
文檔編號C12P41/00GK1203232SQ9810890
公開日1998年12月30日 申請日期1998年5月15日 優(yōu)先權日1991年2月22日
發(fā)明者D·C·廖塔, R·F·施基納齊, Ｗ·Ｂ·崔 申請人:埃莫里大學