專利名稱：：一種富含異麥芽低聚糖糖漿的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種富含異麥芽低聚糖糖漿的制備方法。該方法包括固定在可重復(fù)使用載體上的酶的使用。本發(fā)明還涉及通過在所述在可重復(fù)使用載體上使用所述的固化酶得到的糖漿及其所述糖漿的用途。異麥芽低聚糖糖漿含有相當大數(shù)量的例如異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、黑糖、曲二糖、異潘糖的支鏈低聚糖和高級支鏈低聚糖。取決于應(yīng)用意圖，該產(chǎn)品以粉狀或液狀形式銷售。其可能應(yīng)用于食品領(lǐng)域的例子有-調(diào)味料(蛋黃醬、醋、湯基料等)-糖食(糖果，口香糖、巧克力、冰淇淋、冰糕、糖漿、餡餅)-加工過的果蔬食品(果醬、馬茉蘭、果醬、腌制食品)，肉或魚食品(火腿、香腸等)-焙烤制品(面包、蛋糕、餅干)-預(yù)煮過的食品(色拉、煮過的豆等)-罐裝和瓶裝食品、飲料(咖啡、果汁、密汁飲料、充氣飲料、檸檬汁飲料、可樂)-方便食品(速溶咖啡、速食蛋糕基料等)。異麥芽低聚糖糖漿還可以用作動物飼料和寵物食品的配料。非食品應(yīng)用領(lǐng)域有化妝品和藥品(香煙、口紅、牙膏、內(nèi)科藥等)。多年來人們了解到，當它們按正常日需量口服異麥芽低聚糖時，對人和動物的總的身體狀況有好處。該低聚糖的主要作用在于增加大腸內(nèi)雙岐桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量以及降低腐敗細菌的濃度。通過形成酸或通過抗微生物活力，雙岐桿菌與一些例如抑制病菌成長的改善健康的特性聯(lián)系在一起。它們也與以下各種各樣的效果聯(lián)系在一起調(diào)整免疫系統(tǒng)(抗癌特性)、減少三酸甘油酯和膽固醇含量、產(chǎn)生維生素(B族)、減少血氨濃度、防止易位、抗生素治療后的消化道的修復(fù)、產(chǎn)生消化酶、減少抗生素帶來的副作用(KohmotoT_FukuiF_TakakuH_MachidaY_etal_BifidobacteriaMicroflora，7(2)(1988)，61-69；KohmotoK_TsujiK_KanekoT．ShiotaM_etal_Biosc．Biotech．Biochem_56(6)(1992)，937-940；KanekoT，KohmotoT_KikuchiH_FukuiF_etal_NipponNogeikagakuKaishi，66(8)(1992)，1211-1220，ParkJ-HJin-YoungY_Ok-HoS_Hyun-KyungS_etal_Kor．J．Appl．Microbiol．Biotechnol_20(3)，(1992)，237-242)。通過使用D-葡糖基轉(zhuǎn)換酶(E．C．2．4．1．24，轉(zhuǎn)葡糖苷酶，α-葡糖苷酶)的轉(zhuǎn)葡糖基反應(yīng)合成異麥芽低聚糖。在與α-D-葡糖低聚糖的培養(yǎng)下，該酶催化水解和轉(zhuǎn)換反應(yīng)。該轉(zhuǎn)換經(jīng)常發(fā)生在6-OH(葡糖分子的羥基6)，由D-葡萄糖制得異麥芽糖，或由麥芽糖制得潘糖。該酶也可以轉(zhuǎn)移至D-葡萄糖的2-OH或3-OH上以形成曲二糖或黑糖，或者轉(zhuǎn)回4-OH重新形成麥芽糖。轉(zhuǎn)葡糖苷酶反應(yīng)的結(jié)果，麥芽低聚糖轉(zhuǎn)變成異麥芽低聚糖，結(jié)果使其成為含有更高比例的通過α-D-1，6葡糖糖苷鍵連接的葡糖部分的低聚糖級別。來自黑曲霉(A．niger)的轉(zhuǎn)葡糖苷酶僅作用于具有低DP(McClearyB．V_GibsonT．S_CarbohydrateResearch185(1989)147-162；BensonC．P_KellyC．T_FogartyW．M_J．Chem．Tech．Biotechnol_32(1982)790-798；PazurJ．H_TominagaY_DeBroseC．W_JachmanL．M_CarbohydrateResearch，61(1978)279-290)的低聚糖。可以以不同方式得到異麥芽低聚糖。例如用葡糖淀粉酶處理60-80％的高度干燥固體濃度的葡萄糖糖漿，結(jié)果形成大部分為DP2的異麥芽低聚糖。其它例子為通過添加支鏈淀粉酶到液化淀粉中，支鏈化麥芽糖糖漿和用葡聚糖蔗糖酶處理蔗糖以實現(xiàn)麥芽糖轉(zhuǎn)換。已有報道以不連續(xù)方式制得市售異麥芽低聚糖產(chǎn)品。一般制備方法(JP61-212296，ShowaSangyoCo．Ltd．)由30％ds的玉米、馬鈴薯或木薯淀粉的漿液用耐高溫的α-淀粉酶液化達到6-10DE的液化作用開始。該液化作用在pH5和60℃下進行，并加入β-淀粉酶和轉(zhuǎn)葡糖苷酶，糖化持續(xù)48-72小時。在糖化階段結(jié)束時，用活性炭和離子交換劑過濾和精制該糖漿。該純制品最后濃縮至約80％ds(TakakuH_HandbookofAmylasesandrelatedenzymes，Ed．TheAmylaseResearchSocietyofJapan，PergamonPress，Oxford，(1988)，215-217)。使用的該β-淀粉酶來自大豆或小麥，轉(zhuǎn)葡糖苷酶主要來自真菌源，優(yōu)選黑曲霉。人們已知其它制備方法，它們包括用α-淀粉酶和轉(zhuǎn)葡糖苷酶的混合物轉(zhuǎn)化淀粉水解液(JP41-48693，NipponComStarchKK)和使用形成DP3或DP4的α-淀粉酶并與轉(zhuǎn)葡糖苷酶一起把淀粉轉(zhuǎn)化成高DP3或DP4的糖漿，制得低支鏈的聚糖(JP31-87390、Gunei，KagakuKogyo)。人們?yōu)榱酥频卯慃溠康途厶且言诳扇苄悦阁w系上花費了大量精力，可以看到在固定化酶領(lǐng)域沒有上述活性。為了制得異麥芽低聚糖糖漿，日本專利申請JP63-109790(轉(zhuǎn)讓給ShowaSangyoCo．)描述了使用固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶綴合物。在轉(zhuǎn)葡糖苷酶存在下，通過明膠與戊二醛的交聯(lián)得到該綴合物。獲得的綴合物機械穩(wěn)定性低，在可能送到支持柱(holdingcolumns)之前必須經(jīng)粉碎。由于反應(yīng)相當不均勻，在載體物料內(nèi)酶的分布也不均勻，這使得動力混亂，制得的最終產(chǎn)物不是最大可獲得量的異麥芽低聚糖。另外的缺點是該載體不能重復(fù)使用。在酶活性耗盡后，整個綴合物必須扔掉，從經(jīng)濟和生態(tài)學(xué)方面考慮這是不良的溶液。歐洲專利申請EP301522涉及從葡萄糖和果糖的混合物引發(fā)制備異麥芽糖。對于該方法，其說明書沒有公開使用可重復(fù)使用的載體，此外其實施例僅顯示出使用非固化酶以實現(xiàn)該轉(zhuǎn)換。美國專利US3935070涉及異構(gòu)化淀粉水解液以把至少一部分葡萄糖轉(zhuǎn)換成果糖?？梢越又撧D(zhuǎn)換在膨潤土上用轉(zhuǎn)葡糖苷酶進行處理。膨潤土不是可重復(fù)使用的載體而且引發(fā)物為葡萄糖母液。日本專利申請JP04051899(轉(zhuǎn)讓給NGKInsulatorsLtd．)公開了使用固定在包括二氧化硅和氧化鎂的多孔陶瓷顆粒上的酶。這些陶瓷顆粒不可重復(fù)使用。日本專利申請JP62278984(轉(zhuǎn)讓給DaikinKogyoKK)公開了使用包括細胞和酶的共固化物(co-immobilisate)。同樣這樣的制品也不可重復(fù)使用。本發(fā)明描述了一種異麥芽低聚糖糖漿的制備方法，其中通過轉(zhuǎn)葡糖苷酶酶法轉(zhuǎn)換淀粉水解液，該轉(zhuǎn)葡糖苷酶使用用于固定轉(zhuǎn)葡糖苷酶的可重復(fù)使用的載體。該淀粉水解液為具有4-70DE的糖漿，優(yōu)選20-60DE。優(yōu)選地，該載體為陰離子交換樹脂，通過吸附轉(zhuǎn)葡糖苷酶固定在其上。其它酶與轉(zhuǎn)葡糖苷酶共固定為本發(fā)明又一方面，這里的其它酶為支鏈淀粉酶或α-淀粉酶。這些酶可以一起固定在相同載體上，但是分別固定酶也是可能的。這使兩個酶轉(zhuǎn)換步驟分開成為可能。本發(fā)明另一方面載體／酶的結(jié)合物通過與一個或幾個交聯(lián)劑反應(yīng)而進一步得到加強。本發(fā)明公開了含有大于40％異麥芽低聚糖的異麥芽低聚糖糖漿的連續(xù)制備方法，優(yōu)選異麥芽低聚糖含量大于45％。通過每小時至少3柱床體積的流速和至少25天的周期來實現(xiàn)這些值。另一方面，精制異麥芽低聚糖糖漿，即通過色譜方式或過濾進一步處理異麥芽低聚糖糖漿。本發(fā)明另一部分是，在異麥芽低聚糖糖漿的制備過程中或其后，增加其甜度。這可以通過添加甜味劑或通過用葡萄糖異構(gòu)酶或水解酶使葡萄糖轉(zhuǎn)換成果糖的附加的酶轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)。該酶轉(zhuǎn)換可以與轉(zhuǎn)糖基作用同時或在轉(zhuǎn)糖基作用之后進行。圖1顯示了制得的異麥芽低聚糖(=％異麥芽糖+％黑糖+％異麥芽三糖+％潘糖+％異麥芽四糖)隨結(jié)合期和用于交聯(lián)的戊二醛的量而變化曲線圖。本發(fā)明描述了一種異麥芽低聚糖糖漿的制備方法，其中通過轉(zhuǎn)葡糖苷酶或具有類似活性的酶，使用用于酶固定的可重復(fù)使用的載體，經(jīng)酶法轉(zhuǎn)換淀粉水解液。該淀粉水解液具有4-70的DE，優(yōu)選20-60。例如通過酶或酸水解、現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法得到該淀粉水解液?？梢允褂萌魏慰芍貜?fù)使用的物料作為載體。為了達到本發(fā)明的目的，可重復(fù)使用的意思是載體可以脫去酶或酶活性，并且載體保持完整無缺。載體物料可以用酶重新裝填和重復(fù)使用。例如可以通過用酸液或堿液沖洗的辦法對載體進行清洗，這可以分批或在柱內(nèi)進行。添加鹽也是有利的。另一種可能是使用蛋白質(zhì)降解酶。另外的方式是加熱物料。優(yōu)選地，使用的上述物料具有陰離子交換基團。這樣的物料可以以纖維素為基礎(chǔ)。其它更優(yōu)選的載體為以聚丙烯酸酯或聚苯乙烯為基礎(chǔ)的具有弱堿性基團的載體，優(yōu)選是以酚醛為基礎(chǔ)的載體，例如DuoliteTMA568(RohmandHaas)。優(yōu)選地，載體為陰離子交換樹脂，轉(zhuǎn)葡糖苷酶通過吸附(即非共價的方式)固定在其上。這樣可以容易地除去沒有活性的酶，隨后用新鮮的酶重新裝填。在本發(fā)明實施例(見實施例11)中顯示出酶可以容易地從載體中除去。載體的重新裝填使得結(jié)合物的活性完全恢復(fù)。這意味著載體物料在其被替換之前可以使用相當長的時間。實施例1描述了把轉(zhuǎn)葡糖苷酶固定在陰離子交換樹脂上。在柱內(nèi)對于30％ds麥芽糖糖漿轉(zhuǎn)換的該催化劑的使用顯示出，在每小時約3柱床體積的恒定流速下形成的異麥芽低聚糖的總量為約40％，并且該過程持續(xù)至少約30天。觀察到單一異麥芽低聚糖的量的變化小。酶活性主要在DP2-DP6范圍。在實施例2中描述了固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶與戊二醛的交聯(lián)。使用的該戊二醛是在最終濃度為1％下。結(jié)果(實施例2)顯示出酶的交聯(lián)提高了具有與沒有交聯(lián)的所得糖漿組分不同的糖漿的形成。具體地說，葡萄糖的量增加。異麥芽低聚糖的總量約為35％，5％的減少幾乎可以完全歸因于潘糖的減少。其它酶與轉(zhuǎn)葡糖苷酶共固定為本發(fā)明的又一方面，這樣的其它酶為支鏈淀粉酶或α-淀粉酶。支鏈淀粉酶或α-淀粉酶把較高DPn餾分降解成較小碎片，這樣易于使轉(zhuǎn)葡糖苷酶發(fā)揮作用。這些酶可以一起固定在相同載體上，但是分別固定酶也是可能的。這使兩個酶轉(zhuǎn)換步驟分開成為可能。α-淀粉酶和／或支鏈淀粉酶可以與轉(zhuǎn)葡糖苷酶保持物理地分開。例如它可以放在轉(zhuǎn)葡糖苷酶前面。這樣處理的好處是當其中一種酶耗盡時，不必替換所有的酶，而是可能僅替換一種酶并繼續(xù)使用其它未耗盡的酶。實施例10中公開了這樣單個的固定法。同樣在制得的結(jié)合物上用戊二醛進行處理以使固定化酶穩(wěn)定。在應(yīng)用于30％ds麥芽糖糖漿時的結(jié)合物內(nèi)所得的轉(zhuǎn)葡糖苷酶和支鏈淀粉酶(1∶7．5(w／w))的共固定提供了具有更低葡萄糖含量和增加了DP3含量的異麥芽低聚糖糖漿。由于支鏈淀粉酶的活性，DPn含量減半(實施例3)。異麥芽低聚糖開始的量約48％，然而經(jīng)過一段時間該值降低許多。因此很清楚該催化劑不穩(wěn)定。潘糖量約為18％。進行具有一半數(shù)量的支鏈淀粉酶的相似實驗以提供不同異麥芽低聚糖的光譜(實施例4)。為了穩(wěn)定該結(jié)合物，用不同濃度的戊二醛處理共固定酶／載體。用大于約0．1％的戊二醛使得其穩(wěn)定性大大增加。異麥芽低聚糖總量在45％以上，而且當流速增加到每小時6柱床體積時仍保持在該值之上(實施例6)。實施例6和7還顯示出用0．25％和1％的戊二醛都可以實現(xiàn)其穩(wěn)定性的增加。本發(fā)明因此顯示了連續(xù)制備含有大于40％異麥芽低聚糖的異麥芽低聚糖糖漿，優(yōu)選大于45％。流速至少每小時3柱床體積并且持續(xù)至少25天來實現(xiàn)這些值。另一方面，精制異麥芽低聚糖，即通過色譜方式或過濾進一步處理異麥芽低聚糖。通過色譜技術(shù)或通過超濾或納米過濾進一步分級分離制得的異麥芽低聚糖糖漿以除去葡萄糖餾分且以這種方式得到富含異麥芽低聚糖的糖漿。本發(fā)明另一部分是在制備異麥芽低聚糖糖漿過程中或在其后增加其甜度，這可以通過添加甜味劑或通過用葡萄糖異構(gòu)酶或水解酶進行附加的酶轉(zhuǎn)換來實現(xiàn)。在實施例8中，經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶柱轉(zhuǎn)換異麥芽低聚糖糖漿以實現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)換為果糖，而對其它低聚糖沒有大的影響。提高甜度或異麥芽低聚糖含量的另一途徑是用水解酶(以溶解或固定的形式)處理制得的異麥芽低聚糖糖漿，該水解酶優(yōu)選或僅僅水解麥芽低聚糖，而對異麥芽低聚糖僅僅具有小的親和力或甚至沒有親和力。這樣的酶的例子為來自黑曲霉或例如曲霉種屬或根酶種屬(Aspergillussp．orRhizopussp．)的其它酶源的葡糖淀粉酶，它們優(yōu)選水解麥芽低聚糖(ManjunathP_ShenoyB．C_RaghavendraRaoM．R_JournalofAppliedBiochemistry，5(1983)，235-260；MeagherM．M_etal_BiotechnologyandBioengineering，34(1989)，681-693；PazurJ．H_KleppeK_TheJournalofBiologicalChemistry，237(4)(1962)，1002-1006；Hirornik_NittaY_etal_BiochimicaetBiophysicaActa，302(1973)，362-37)。使用葡糖淀粉酶進行相同的處理。在這種情況下，耗費所有其它低聚糖產(chǎn)生大量的葡萄糖(實施例9)。也可以使用來自象嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的α-D-吡喃葡糖苷酶的酶。該酶不能水解異麥芽低聚糖，僅降解在富含異麥芽低聚糖的糖漿中存在的麥芽低聚糖(SuzukiY_ShinjiM_NobuyukiE_BiochimicaetBiophysicaActa，787(1984)，281-189)。也可以使用所謂麥芽糖酶的其它α-D-葡糖苷酶。例如來自酵母的麥芽糖酶僅水解麥芽糖，而對麥芽三糖的水解較少(KellyC．T_FogartyW．M_ProcessBiochemistry，May／June(1983)，6-12)。麥芽低聚糖水解成葡萄糖之后，通過色譜技術(shù)或通過納米過濾或超濾，該糖漿可以富含異麥芽低聚糖。以下實施例用于解釋本發(fā)明的主要方面。實驗酶活性測定通過McClearyet．a(chǎn)l．的方法(McClearyB．V_GibsonT．S_CarbohydrateResearch，185(1989)，147-162)測定轉(zhuǎn)葡糖苷酶的活性。在轉(zhuǎn)葡糖苷酶存在下，使甲基-α-D-吡喃葡糖苷(glucopyranoside)在pH5．0和60℃下反應(yīng)10分鐘，因此變成D-葡萄糖。測定D-葡萄糖，活性用國際單位表示。一國際單位(U)為每分鐘打開一微摩爾配糖鍵所需的酶量。通過Lappalainen等人改進的方法(LappalainenA_Niku-PaavolaM-L_SuorttiT_PoutanenK_Starch，43(12)(1991)，477-482)測定支鏈淀粉酶活性。通過使支鏈淀粉與支鏈淀粉酶在pH5和50℃下反應(yīng)15分鐘來測定支鏈淀粉酶的活性。支鏈淀粉水解成低聚糖，通過DNS-試劑比色測定該低聚糖。由麥芽糖濃度和吸光度之間關(guān)系表示的標準曲線來計算酶活性。一單位為每分鐘內(nèi)產(chǎn)生一微摩爾還原基團所需的酶的量，表示麥芽糖當量。底物除實施例7和8外，所有實驗中用作底物的糖漿具有以下近似組分DP1DP2DP3DP4DP5DP6DP7DP8DP9DP1DP≥0113．448．120．81．21．11．62．73．22．41．014．5這些底物含有很少量的異麥芽低聚糖DP麥芽異麥芽黑麥芽三潘異麥芽三異麥芽四糖異構(gòu)總DPn1糖糖糖糖糖糖量3．447．01．10．020．30．50．11．22．826．5使用實施例中描述的這些底物，不排除使用類似麥芽糊精的其它底物(具有葡糖當量＜20的淀粉水解產(chǎn)物)，或包括不同量DP1-DP20和更高DPn的糖漿。低聚糖分析在配備有ShodexKS-801柱的HPLC上以Na+形式和RI檢測進行底物和產(chǎn)物的特征分析。該方法提供DP1、DP2、DP3、DP4和DPn組分。用Bio-RadHPX42-A柱測定DP1-DP10組分。單個異麥芽低聚糖的量通過高效陰離子交換色譜法進行測定，即使用具有脈沖安培滴定檢測的DionexCarbopacPA-1柱。實施例1固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用鹽酸調(diào)整至pH3．5。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物1夜。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，調(diào)整到pH4．2，以3BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。表1描述了通過固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶作用的糖組分的變化</tables>表1表2描述了制得的不同異麥芽低聚糖。表2除了異麥芽低聚糖的總量約為40％外，DPn部分也含有相當多的具有DP≥5的支鏈化低聚糖。盡管經(jīng)過一段時間異麥芽低聚糖總量保持恒定，仍可以注意到制得的單個異麥芽低聚糖的小的變化。表3描述了通過結(jié)合物轉(zhuǎn)換底物后低聚糖數(shù)據(jù)的變化。表3從表3中很明顯，固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶的作用位于DP2-6的范圍。所有DP2和DP3分子轉(zhuǎn)換成葡萄糖和DP4-6分子。DP10+部分實際上沒有變化。實施例2用戊二醛處理過的固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用0．3ml的1MNa2CO3調(diào)整。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物4小時。加入5ml5％的戊二醛溶液(最終濃度1％)，室溫下攪拌該樹脂1夜。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，調(diào)整到pH4，以3BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。表4描述了通過固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶作用的糖組分的變化:表4當與表1中出現(xiàn)的結(jié)果進行比較時，很明顯，戊二醛改變了固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶的作用方式。受戊二醛處理過的結(jié)合物比實施例1中描述的結(jié)合物產(chǎn)生更多的葡萄糖。表5描述了制得的不同的異麥芽低聚糖。表5當與未經(jīng)處理的TG結(jié)合物(表2)比較時，發(fā)現(xiàn)異麥芽低聚糖的量減少。這直接關(guān)系到戊二醛結(jié)合物內(nèi)的潘糖產(chǎn)生較少。實施例3共固定轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶(1)用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用鹽酸調(diào)整至pH3．5。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物4小時。加入15g支鏈淀粉酶(來自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，整夜連續(xù)固定化。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，調(diào)整到pH4．2，以3BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。表6描述了通過固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶結(jié)合物的糖組分的變化表6與實施例1中制備的固定化轉(zhuǎn)葡糖苷酶結(jié)合物相比，產(chǎn)生較少的葡萄糖，而特別是DP3很高。而且由于固定化支鏈淀粉酶的作用Dpn部分減半。經(jīng)過一段時間注意到葡萄糖的形成降低，這表示該結(jié)合物不具有高的穩(wěn)定性。表7描述了制得的不同的異麥芽低聚糖。表7從表7中很明顯，經(jīng)過一段時間異麥芽低聚糖含量減少。實施例4共固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶(2)與實施例3描述的結(jié)合物不同，變換轉(zhuǎn)葡糖苷酶活性／支鏈淀粉酶活性的比例，以提供給酶載體。用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用鹽酸調(diào)整至pH3．5。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物4小時。加入7．5g支鏈淀粉酶(來自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，整夜連續(xù)固定化。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，調(diào)整到pH4，以3BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。表8描述了通過固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶結(jié)合作用的糖組分的變化。表8也很清楚，象實施例3描述的結(jié)合物，隨時間的推移轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶結(jié)合疏松。表9描述了制得的不同的異麥芽低聚糖。表9表9描述的結(jié)果顯示該結(jié)合物產(chǎn)生的異麥芽低聚糖量隨時間推移而降低。因此可以總結(jié)出該結(jié)合物是不穩(wěn)定的。實施例5用不同濃度的戊二醛處理的共固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用0．3ml的1MNa2CO3調(diào)整。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物4小時。接著，加入15g支鏈淀粉酶(來自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，連續(xù)固化4小時。然后分別加入5ml的5％、2．5％、1．0％、0．5％或0．1％的戊二醛溶液以分別提供1％、0．5％、0．2％、0．1％或0．02％的戊二醛溶液，室溫下攪拌該樹脂1夜。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿(3．3％DP1、49．7％DP2、21．9％DP3、0．9％DP4、24．2％DP≥5)，調(diào)整到pH4．2，以3BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。圖1顯示了異麥芽低聚糖(=％異麥芽糖+％黑糖+％異麥芽三糖+％潘糖+％異麥芽四糖)產(chǎn)品隨結(jié)合期而變化的圖。從圖1清楚地看出戊二醛處理具有使轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶結(jié)合物性能穩(wěn)定的效果。實施例6用0．2％最終濃度的戊二醛處理的共固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶按照實施例5制得轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶結(jié)合物。用0．2％最終濃度的戊二醛實現(xiàn)其交聯(lián)。30％ds麥芽糖糖漿，調(diào)整到pH4．2，以3BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。表10描述了通過固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶作用的糖組分的變化表10注意到，隨時間推移觀察到僅少量葡萄糖減少。表11描述了制得的不同的異麥芽低聚糖。表11表11顯示的結(jié)果證實用這種結(jié)合物以3BV／h可以獲得46％穩(wěn)定的異麥芽低聚糖產(chǎn)品。流速增加到～6BV／h制得的葡萄糖含量減少，而制得的異麥芽低聚糖的量保持恒定。流速進一步增加到～9BV／h制得的異麥芽低聚糖的量減少。表12給出了隨時間推移制得的糖漿的低聚糖分布的變化。表12表12證實制得的糖漿中大多數(shù)低聚糖在DP6-7以下的區(qū)域被發(fā)現(xiàn)，與底物相反，其大部分(23．5％)低聚糖具有高于6的DP。當與實施例1(表3)描述的結(jié)合物比較時，很明顯，共固定支鏈淀粉酶的作用大大地減少DP10+部分。實施例7用1．0％最終濃度的戊二醛以不同流速處理共固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶／支鏈淀粉酶用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用0．3ml的1MNa2CO3調(diào)整。加入2gTransglucosidaseL“Amano”(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物4小時。接著，加入15g支鏈淀粉酶(來自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，連續(xù)固化4小時。然后加入5ml5．0％的戊二醛溶液以提供1％的戊二醛溶液，室溫下攪拌該樹脂1夜。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿(3．3％DP1、48．4％DP2、20．8％DP3、1．3％DP4、26．2％DP≥5)，調(diào)整到pH4．2，以10BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。通過HPLC分析柱出口處的產(chǎn)物。表13說明經(jīng)固化的轉(zhuǎn)葡糖苷酶作用后糖組份的變化。表13由表13很顯然看出，以3BV／h制得大量葡萄糖，而DPn部分相對于底物減少很多。流速增加到6-9BV／h，葡萄糖產(chǎn)量減少，同時殘余DPn含量增加。表14顯示出固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶作用后糖組分的變化</tables>表14表14顯示的數(shù)據(jù)證實，以3BV／h可以獲得約45-46％的異麥芽低聚糖。當流速增加到6BV／h時，異麥芽低聚糖的量沒有降低。在9BV／h，注意到異麥芽低聚糖降低。實施例8通過葡萄糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化作用增加異麥芽低聚糖糖漿的甜度該實施例描述了通過把可獲得的部分葡萄糖轉(zhuǎn)變成果糖來增加異麥芽低聚糖糖漿甜度的方法。以3-4．5BV／h運送富含異麥芽低聚糖的糖漿(pH7．8，60％ds，200ppmMg2+)通過固化葡萄糖異構(gòu)酶結(jié)合物(50℃的恒溫)。表15給出了異構(gòu)化結(jié)果表15表15中結(jié)果證實，容易制得9％果糖變體的異麥芽低聚糖糖漿。自然也可獲得具有其它果糖百分比的異麥芽低聚糖糖漿。表16證實，在異構(gòu)化過程中異麥芽低聚糖組分幾乎沒有變化。表16實施例9通過水解酶轉(zhuǎn)換增加異麥芽低聚糖糖漿甜度該實施例描述在來自黑曲霉的葡糖淀粉酶存在的情況下，水解酶在異麥芽低聚糖糖漿上的作用。以～1BV／h運送富含異麥芽低聚糖的糖漿(80％ds，PH4)通過固化葡糖淀粉酶結(jié)合物。表17給出了低聚糖光譜的變化表17很清楚，制得了葡糖，而低聚糖量降低。表18顯示出異麥芽低聚糖含量的變化。表18表18證實，相當大量的麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖和DPn部分分解為葡萄糖。自然也可以在例如30％ds的低ds下進行水解反應(yīng)，示于表19。表19表19清楚地顯示出，流速降低使得DPn部分進一步降解。這也例證于表20中表20通過調(diào)整流速，可以降解最大量的DPn部分，而沒有水解太多的異麥芽低聚糖(表21)。表21實施例10固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶伴隨著的固化支鏈淀粉酶A)固化支鏈淀粉酶的制備用軟化水沖洗5ml的DuoliteA568以去除微粒。該樹脂隨后用0．15ml的1MNa2CO3調(diào)整。加入7．5gOptimaxL300(Genencor)，接著加入0．008ml戊二醛溶液(25％w／v)／ml的上清液。室溫下整夜緩慢攪拌該混合物。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿，調(diào)整到pH4．2，以6BV／h(柱床體積／小時)的最初流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。結(jié)合物脫支鏈化活性清楚顯示在表22中。送脫支鏈的麥芽糖糖漿通過B)中描述的固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶結(jié)合物。表22B)固化轉(zhuǎn)葡糖苷酶的制備用軟化水沖洗5ml的DuoliteA568以去除微粒。該樹脂隨后用0．15ml的1MNa2CO3調(diào)整。加入1gTransglucosidaseL“Amano”，接著添加0．08ml葡糖苷戊二醛溶液(25％w／v)。室溫下整夜緩慢攪拌該混合物。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。由支鏈淀粉酶結(jié)合物制得的糖漿以6BV／h(柱床體積／小時)的最初流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。異麥芽低聚糖糖漿產(chǎn)品顯示在表23中。表23實施例11樹脂的再生和用酶重新裝填A(yù))用軟化水沖洗10ml的DuoliteA568TM以去除微粒。該樹脂隨后用0．3ml的1MNa2CO3調(diào)整。加入1gTransglucosidaseL“Amano”’(液狀制品，11．2mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，103TGU／g酶溶液)，室溫下攪拌混合物4小時。接著，加入15g支鏈淀粉酶(來自GenencorInt．的OptimaxL300TM，2．6mg蛋白質(zhì)／g酶溶液，400PU／g酶溶液)，連續(xù)固化4小時。加入5ml1．0％的戊二醛溶液以提供0．2％的戊二醛溶液，室溫下攪拌該樹脂1夜。制得的結(jié)合物用軟化水沖洗并放入50℃下的雙層外殼玻璃柱內(nèi)。30％ds麥芽糖糖漿，調(diào)整到pH4．2，以10BV／h(柱床體積／小時)的流速泵送通過柱。該柱溫度保持在50℃。以3BV／h持續(xù)30天運行該結(jié)合物制得43-45％的異麥芽低聚糖。B)接著把該結(jié)合物送入一燒杯，用水沖洗以去除糖和微粒。樹脂的pH調(diào)到1．5，在60℃下攪拌該樹脂1小時。然后用NaOH使其pH升到12．5，連續(xù)攪拌1小時同時保持pH在12．5。然后用軟化水沖洗該結(jié)合物以去除微粒。C)對該再生過的樹脂重復(fù)進行步驟A)。固定相同量的酶，以A中描述的相同流速用新的結(jié)合物制得43-45％異麥芽低聚糖糖漿。權(quán)利要求1．一種含有異麥芽低聚糖的糖漿的制備方法，其中通過轉(zhuǎn)葡糖苷酶酶法轉(zhuǎn)換淀粉水解液，并且使用可重復(fù)使用的載體以固定轉(zhuǎn)葡糖苷酶。2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中淀粉水解液具有4-70的DE，優(yōu)選20-60DE。3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中載體為陰離子交換樹脂，通過吸附把轉(zhuǎn)葡糖苷酶固定在其上。4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于其它酶與轉(zhuǎn)葡糖苷酶共固定，所述的其它酶選自支鏈淀粉酶和α-淀粉酶，其中所述的共固定由一種或多種分開的載體實現(xiàn)。5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于載體／酶結(jié)合物通過與交聯(lián)劑反應(yīng)進一步得到強化。6．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征存于交聯(lián)劑為戊二醛。7．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于異麥芽低聚糖含有大于40％，優(yōu)選大于45％的異麥芽低聚糖，這些值由至少每小時3柱床體積的流速和至少25天的周期來實現(xiàn)。8．根據(jù)上述權(quán)利要求中任意之一的方法，其中進一步通過例如色譜方式或過濾來精制異麥芽低聚糖糖漿。9．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在異麥芽低聚糖糖漿的制備過程中或之后通過添加甜味劑或者通過附加葡萄糖異構(gòu)酶或水解酶的附加酶轉(zhuǎn)換增加其甜度。全文摘要本發(fā)明描述了一種異麥芽低聚糖糖漿的制備方法。該方法包括固定在可重復(fù)使用載體上的酶的使用。該載體優(yōu)選陰離子交換劑。用于轉(zhuǎn)變淀粉水解液的酶為轉(zhuǎn)葡糖苷酶和支鏈淀粉酶,優(yōu)選共固化這些酶。通過交聯(lián)進一步強化載體/酶的結(jié)合。文檔編號C13K13/00GK1205843SQ9810877公開日1999年1月27日申請日期1998年5月2日優(yōu)先權(quán)日1997年5月2日發(fā)明者R·L·M·維考特倫,V·S·恩古尹,H·W·W·勒珀申請人:塞里斯塔控股有限公司