專利名稱：細胞色素c和它的基因的制作方法
已知細胞色素c是為了完成伴隨著將分子氧還原成水的底物的氧化在起始的脫氫酶和最終的氧化酶之間介導(dǎo)電子傳遞的基本成份之一。這一電子傳遞反應(yīng)的基礎(chǔ)是血紅素鐵的氧化還原。最近有人作出嘗試，利用細胞色素c的電子傳遞反應(yīng)作為模仿生物材料或元件的新物質(zhì)，命名為生物芯片；如利用嗜熱氫桿菌的細胞色素c552(Kodama等，美國專利No.5459046)。包括葡糖桿菌和醋桿菌的醋酸細菌具有高效的糖和糖醇氧化能力并且在工業(yè)上用于生產(chǎn)用作維生素C生產(chǎn)的中間物質(zhì)的醋和L-山梨糖。對于氧化發(fā)酵，細胞色素c對完成氧化起了重要的作用。已經(jīng)從許多生物體包括葡糖桿菌中純化和鑒定了細胞色素c蛋白，如Matsushita等報道了從弱氧化葡糖桿菌中純化結(jié)合CO的細胞色素c553(CO)(分子量48千道爾頓)(FEMS Microbiol.Lett.,10:267-270,1981)和后來發(fā)現(xiàn)細胞色素c553(CO)相同于葡糖桿菌的乙醇脫氫酶的第二個亞單位。如生物工程發(fā)酵雜志，74,209-213,1992(Y.Takeda等)公開的，在乙醇脫氫酶第二亞單位缺陷的葡糖桿菌中細胞色素c553(CO)的擴增以特定的速度(每克細胞每小時產(chǎn)生的克產(chǎn)物)稍微改進了D-山梨醇到L-山梨糖的生產(chǎn)。除了細胞色素c553，從葡糖桿菌中還分離了細胞色素c551(AL)(分子量55千道爾頓)和細胞色素c551(CO)(分子量72千道爾頓)(Ameyama等，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)51,2943-2950(1987))。
本發(fā)明的一個目的是提供屬于具有電子受體功能的蛋白質(zhì)家族的新的細胞色素c。更具體地說，本發(fā)明的新的細胞色素c可用作脫氫酶如乙醇和醛的脫氫酶的電子受體。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明所述的多肽的功能衍生物。這些功能衍生物的定義是以本發(fā)明的氨基酸序列為基因，在所述序列中增加，插入，缺失和/或替代一個或更多的氨基酸殘基，采用本領(lǐng)域已知或本文特別敘述的檢測方法測定這些衍生物仍然具有細胞色素c活性。通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)肽合成方法或如本文公開的本領(lǐng)域中已知的方法和如Sambrook等(分子克隆，冷泉港實驗室出版，紐約，美國，第二版1989)公開的基于DNA序列的重組手段可以制造這些功能衍生物。通常不改變所述分子活性的蛋白質(zhì)和肽中的氨基酸的交換在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，并例如由H.Neurath和R.L.Hill在“蛋白質(zhì)”(學(xué)術(shù)出版社，紐約，1979，參見圖6，第14頁)中的描述。最普遍存在的交換是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Thy/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu,Asp/Gly以及這些的相反交換。
另外，本發(fā)明涉及包括如序列表中公開的編碼至少具有細胞色素c551的部分一級結(jié)構(gòu)和一種生物特性的在原核或真核寄主細胞中表達的多肽的DNA序列以及它們的互補鏈，或包括這些序列的那些DNA序列，與這些序列或其片段優(yōu)選地在標(biāo)準(zhǔn)條件下雜交的DNA序列和由于基因密碼的簡并性，在標(biāo)準(zhǔn)條件下與這些序列不雜交但編碼具有精確地相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。
在本文中，雜交的“標(biāo)準(zhǔn)條件”意指本領(lǐng)域技術(shù)人員通常用于檢測特異的雜交信號并在Sambrook等，“分子克隆”第二版(冷泉港實驗室出版1989，紐約)中敘述的條件，或優(yōu)選地稱謂嚴(yán)謹雜交和不嚴(yán)謹洗滌條件，或更優(yōu)選地所謂溫和嚴(yán)謹條件或更優(yōu)選地稱謂嚴(yán)謹雜交和嚴(yán)謹洗滌條件，如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的并在Sambrook等(如上所述)中敘述的。
本發(fā)明的另一個目的是提供如上指出的進一步包括編碼具有醇/醛脫氫酶活性的多肽的DNA序列的DNA序列，如實施例6中所述，可以制備這樣的構(gòu)建體。
本發(fā)明的另一個目的是提供具有細胞色素c活性并由上面定義的DNA序列編碼的多肽，或具有細胞色素c活性、可從屬于葡糖桿菌屬的微生物中得到或已得到、選自分別顯示下面的物理化學(xué)特性的細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的多肽(a)細胞色素c551Ⅰ(a)分子量凝膠過濾分析約為19±1千道爾頓，SDS-PAGE分析約為18.0±1.0千道爾頓；
(b)吸收光譜其還原形式在551nm,522nm和417nm處顯示最大吸收，分別作為α,β和γ峰；(c)血紅素含量約1摩爾血紅素/摩爾蛋白質(zhì)；(d)等電點約3.95；和(b)細胞色素c551Ⅱ(a)分子量凝膠過濾測得約19±1千道爾頓，和SDS-PAGE分析約為16.8±1.0千道爾頓；(b)吸收光譜其還原形式在551nm,522nm和417nm處顯示最大吸收，分別作為α,β和γ峰；(c)血紅素含量約1摩爾血紅素/摩爾蛋白質(zhì)；(d)等電點約3.75。
本發(fā)明的另一個目的是提供如上定義的進一步包括編碼具有醇/醛脫氫酶活性的多肽的DNA序列的DNA序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供適于原核或真核宿主細胞中表達的含有如上定義的DNA序列的載體和已經(jīng)用所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，更具體地說其中已經(jīng)將如上定義的DNA序列整合進基因組的所述宿主細胞，此外是真核起源并優(yōu)選地是哺乳動物或植物細胞的宿主細胞或是原核起源的，特別是當(dāng)選自包括細菌如大腸桿菌，惡臭假單胞菌，木醋桿菌，巴氏醋桿菌，醋化醋桿菌，漢氏醋桿菌，和弱氧化葡糖桿菌，如弱氧化葡糖桿菌DSMNo.4025組的寄主細胞中表達的載體。
另外本發(fā)明的目的是提供生產(chǎn)細胞色素c551的方法，該方法包括在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)如上定義的宿主細胞和從培養(yǎng)物中回收細胞色素c551。
在體內(nèi)和體外存在醇和醛脫氫酶時本發(fā)明的細胞色素c也用于提高從L-山梨糖或D-山梨醇生產(chǎn)2KGA和進一步從相應(yīng)的底物生產(chǎn)醛，羧酸和酮。
化合物2KGA是在抗壞血酸(維生素C)的生產(chǎn)中根據(jù)已知的Reichstein方法可以轉(zhuǎn)化成抗壞血酸的重要中間產(chǎn)物。通過發(fā)酵從L-山梨糖或從D-山梨醇生產(chǎn)2KGA是已知的。如農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，54(5),1211-1218,1990(T.Hoshino等)和歐洲專利公開No.606621中公開的，借助于山梨糖和山梨醇脫氫酶催化的反應(yīng)，已知葡糖桿菌菌株可生產(chǎn)2KGA。
所以利用本發(fā)明的細胞色素c生產(chǎn)維生素C也是本發(fā)明的一個目的。
在更詳細地敘述本發(fā)明之前，下面給出了附圖的簡要說明

圖1顯示了細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的吸收光譜。每個樣品的蛋白質(zhì)濃度各是0.4毫克/毫升。連續(xù)的和斷裂的線分別是還原和氧化形式的光譜。
圖2顯示了從天然的細胞色素c551Ⅱ分離的肽和合成的低聚核苷酸的序列。
圖3顯示了攜帶具有細胞色素c551基因的質(zhì)粒的GOS2R的Western影印分析。
圖4顯示了用于表達醇/醛脫氫酶(AADH)-細胞色素c551共軛物的質(zhì)粒的制備，它是在C末端具有類似細胞色素c的序列的醋化醋桿菌的乙醇脫氫酶(ADH)的模仿過程中構(gòu)建的。*1將ADH的脫氫酶區(qū)和細胞色素區(qū)之間的序列(對應(yīng)于成熟的ADH的氨基酸582到595的PALNNRGFLPVKPP)用作連接AADH區(qū)和細胞色素c551區(qū)的接頭。*2導(dǎo)入限制性位點NheⅠ和Bam HI連接這三部分(AADH，接頭，和細胞色素c551)。
在更詳細地說明本發(fā)明之前，在下面給出了包括可從氧化葡糖桿菌得到的純化的細胞色素c551的異構(gòu)體Ⅰ和Ⅱ的物理化學(xué)特性。
(1)分子量在凝膠過濾純化步驟中，細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ顯示了約19+/-1千道爾頓的表觀分子量。和，SDS-PAGE分析顯示了細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的分子量分別為18.0+/-1.0和16.8+/-1.0千道爾頓。所以，存在兩種顯示接近分子量的細胞色素c551的制劑并且細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ都是單體蛋白質(zhì)。
(2)吸收光譜和血紅素含量圖1顯示了通過添加連二硫酸鈉完全還原的細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的吸收光譜。兩個細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的光譜是難于互相區(qū)分的。還原的細胞色素分別在作為α,β和γ峰的551nm,522nm和417nm處顯示最大吸收。并且氧化的細胞色素在作為γ峰的411nm處顯示最大吸收。通過Drabkin(生物化學(xué)雜志146:605,1942)的吡啶血紅素方法確定了細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的血紅素含量約為1摩爾/摩爾單體血紅素蛋白質(zhì)。
(3)等電點通過LKB(Stockholm，瑞典)等電點電泳系統(tǒng)確定細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的等電點(pI)分別為3.95和3.75。
(4)細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的肽圖譜比較用V8蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶在同樣的條件下消化細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ，并通過反相HPLC分析比較肽片段圖譜。細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的主要肽片段圖譜(約30個肽片段峰)是相同的，另外分別在細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ處觀察到少數(shù)小肽片段峰。結(jié)果表明了在細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ之間有強烈的氨基酸序列的同源性。
(5)細胞色素c551Ⅱ的氨基酸序列經(jīng)過未知的修飾封閉了細胞色素c551Ⅰ和Ⅱ的N末端的氨基酸。所以根據(jù)肽片段確定了內(nèi)部的氨基酸序列。除了V8蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶消化的肽片段，用賴氨酰-肽鏈內(nèi)切酶消化細胞色素c551Ⅱ(除去血紅素和S-羧基甲基化的)制造出其它肽片段。用得到的幾個肽片段測定了下列內(nèi)部氨基酸序列No.1(序列表SEQ ID No.3):AlaAspThrAlaAlaThrGluGluAlaProAlaAlaAlaAlaGlyAlaAlaThrSerIleTyrAspGlyValTyrThrAlaAlaGlnAlaGluAlaGlyGlnAlaAlaTrpMetThrSerXaaAlaSerXaaHisGlyProThrAlaArgGlySer,No.2(序列表SEQ ID No.4):GlyProArgValIleGlyProValIleAsnAsnLysTyrAlaAspLysProLeuLeuAspTyrPheAsnTyrThrArgAspAsnMetProMetGlyAlaProHisSerLeuSerAspAspThrTyrValGlu,No.3(序列表SEQ ID No.5):IleLeuGlnSerHisGlyAlaGluProGlyGluThrGlu。
通過培養(yǎng)適當(dāng)?shù)奈⑸?，破碎細胞和從破碎細胞的無細胞提取液，優(yōu)選地從微生物的可溶部分分離和純化來制備本發(fā)明提供的細胞色素c。
在本發(fā)明中用于分離本發(fā)明的細胞色素c的微生物優(yōu)選地屬于能夠生產(chǎn)細胞色素c的葡糖桿菌屬。所述微生物的功能等同物、繼代培養(yǎng)物、突變體和變異體也可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的菌株是氧化葡糖桿菌。特定的和優(yōu)選的氧化葡糖桿菌菌株已經(jīng)于1987年3月17日保藏于Gottingen(德國)的德國微生物收集處(Deutsche Sammlung von Mikroorganisen)，保藏號DSM No.4025。另外，該菌株的繼代培養(yǎng)物也已經(jīng)根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定保藏于日本工業(yè)科學(xué)和技術(shù)部，發(fā)酵研究院(Ageney of IndustrialScience and technology,Fementation Research Institute)，保藏號Gluconobacter oxydans DSM No.4025 FERM BP-3812(保藏日期1992年3月30日)。另外，歐洲專利公開0278 477公開了這一菌株的特征。
在好氣條件下，在用適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)補充的含水培養(yǎng)基中可以培養(yǎng)該微生物。培養(yǎng)可以在約4.0和9.0之間，優(yōu)選地約6.0和8.0之間的pH中進行。根據(jù)pH，溫度和所用的營養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)期可以變化，通常2-6天產(chǎn)生滿意的結(jié)果。進行培養(yǎng)的優(yōu)選的溫度范圍是約13℃-36℃，優(yōu)選地是約18℃-33℃。
通常需要培養(yǎng)基含有營養(yǎng)素如可同化的碳源、可消化的氮源和無機物質(zhì)、維生素、痕量元素和其它生長促進因子。作為可同化的碳源，可以利用甘油，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖，D-阿拉伯糖，L-山梨糖，D-山梨醇和諸如此類。
也可以利用各種有機或無機物質(zhì)作為氮源，如酵母提取物，肉提取物，蛋白胨，酪蛋白，玉米浸出液，脲，氨基酸，硝酸鹽，銨鹽和諸如此類。作為無機物質(zhì)，可以利用硫酸鎂，磷酸鉀，氯化鐵和亞鐵，碳酸鈣和諸如此類。
在下面，敘述了在培養(yǎng)后從該微生物分離和純化細胞色素c和其基因/DNA序列的克隆的實施方案。
(1)通過離心或過濾從發(fā)酵液中收獲細胞。
(2)在緩沖液中懸浮細胞并通過勻漿器、超聲儀或用溶菌酶處理等破碎細胞，得到細胞的裂解溶液。
(3)通過常用的蛋白質(zhì)純化方法如硫酸銨沉淀、透析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析從破碎的細胞的無細胞提取液，優(yōu)選地從該微生物的可溶部分分離和純化細胞色素c。
本發(fā)明提供的細胞色素c可用作屬于脫氫酶的酶的電子受體，用于從乙醇和醛生產(chǎn)醛、羧酸和酮，特別是用于通過L-山梨糖酮從L-山梨糖或D-山梨醇生產(chǎn)2-KGA。
簡要地說，通過下列步驟可以得到用于本發(fā)明的細胞色素c基因，DNA序列，重組表達載體和也稱為轉(zhuǎn)化的宿主細胞的重組生物體(1)從提供接受來自脫氫酶的電子的細胞色素c的微生物分離染色體DNA和在大腸桿菌中用染色體DNA構(gòu)建基因文庫。
(2)通過菌落、噬菌斑、或Southern雜交、PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))克隆、Western-影印分析和諸如此類從染色體DNA克隆細胞色素c基因。
(3)通過常用方法確定如上得到的細胞色素c基因的核苷酸序列以便選擇含有細胞色素c基因的DNA分子并構(gòu)建可以有效地表達細胞色素c基因的重組表達載體。
(4)通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)接合和電穿孔構(gòu)建攜帶細胞色素c基因的重組微生物。
如下詳細地舉例說明了用于本發(fā)明以上方面的材料和技術(shù)通過本領(lǐng)域已知的程序可以純化總?cè)旧wDNA。從總?cè)旧wDNA通過下列方法將編碼細胞色素c的基因克隆進質(zhì)?；蚴删w載體(ⅰ)通過在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后，從凝膠上分離整個蛋白質(zhì)或通過肽酶處理得到的肽片段，并將它們用于蛋白質(zhì)測序儀如AppliedBiosystems自動氣相序列儀470A(Perkin Elmer公司，Norwalk,Conn.,USA)從純化的細胞色素c確定部分氨基酸序列，根據(jù)上面得到的氨基酸序列，用DNA合成儀如Applied Biosystems自動DNA測序儀381A(Perkin Elmer)合成低聚核苷酸探針，用低聚核苷酸探針通過Southern-、菌落-或噬菌斑-雜交從攜帶目的基因的菌株的基因文庫中分離攜帶目的基因的克??；(ⅱ)通過免疫學(xué)方法，用抗細胞色素c的抗體從基因文庫中篩選表達細胞色素c的克??；或(ⅲ)通過PCR方法用根據(jù)上面測定的氨基酸序列合成的兩個低聚核苷酸從總?cè)旧wDNA中擴增該DNA并將上面得到的PCR產(chǎn)物作為探針，通過Southern-、菌落-、或噬菌斑-雜交從在大腸桿菌中構(gòu)建的基因文庫中分離攜帶整個細胞色素c基因的克隆。通過《酶學(xué)方法》73卷，第46頁，1981中敘述的方法可以用純化的細胞色素c蛋白或它的肽片段制備上面提到的與所述細胞色素c反應(yīng)的抗體。
利用M13噬菌體通過熟知方法如雙脫氧鏈終止法可以測定細胞色素c基因的核苷酸序列(Sanger F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467,1977)。
為了表達細胞色素c基因或通常說的有效編碼細胞色素c活性的DNA序列，可以利用各種啟動子，例如，存在于所述的細胞色素c基因上游的原始啟動子，抗生素抗性基因如Tn5的卡那霉素抗性基因(Berg,D.E.和C.M.Berg.1983.生物/技術(shù)1:417-435)、pBR322的氨芐青霉素抗性基因的啟動子，和大腸桿菌的β-半乳糖苷酶(lac)、trp-、tac-、trc-啟動子，λ-噬菌體的啟動子和任何在包括細菌如大腸桿菌、惡臭假單胞菌、木醋桿菌、巴氏醋桿菌、醋化醋桿菌、漢氏醋桿菌和氧化葡糖桿菌的微生物，哺乳動物細胞和植物細胞宿主中起作用的啟動子。
為了上面的目的，在編碼序列上導(dǎo)入在宿主細胞中可操作的其它的調(diào)控元件例如Shine-Dalgarno(SD)序列(例如，AGGAGG等等，包括在宿主細胞中可操作的天然和合成的序列)和轉(zhuǎn)錄終止子(包括在宿主細胞中可操作的天然和合成的序列的反向重復(fù)結(jié)構(gòu))并且和上面描述的啟動子一起使用。
為了表達周質(zhì)多肽細胞色素c蛋白，通常含有15-50個氨基酸并完全疏水的信號肽是必需的。編碼信號肽的DNA可選自宿在所需的宿主細胞中可操作的任何天然和合成序列。
各種宿主/克隆載體的結(jié)合可以用于克隆雙鏈DNA?？寺≥d體通常是含有復(fù)制原點、調(diào)節(jié)元件、包括多克隆位點的克隆位點和選擇標(biāo)記如包括氨芐青霉素、四環(huán)素、卡那霉素、鏈霉素、慶大霉素、壯觀霉素等等的抗性基因的抗生素抗性基因的質(zhì)?；蚴删w。
在大腸桿菌中表達目的基因的優(yōu)選的載體選自通常用于大腸桿菌的任何載體，如pBR322或它的衍生物包括pUC18和pBluescriptⅡ,pACYC177和pACYC184(細菌學(xué)雜志134:1141-1156,1978)和它們的衍生物，和起源于廣譜宿主范圍質(zhì)粒的載體如RK2和RSF1010。用于在包括弱氧化葡糖桿菌DSM No.4025的葡糖桿菌和惡臭假單胞菌中表達目的基因的優(yōu)選的載體選自可以在葡糖桿菌和/或惡臭假單胞菌以及優(yōu)選的克隆生物體如大腸桿菌中復(fù)制的任何載體。優(yōu)選的載體是廣譜宿主范圍的載體如粘粒載體如pVK102和它的衍生物和RSF1010和它的衍生物，和含有在葡糖桿菌中起作用的復(fù)制原點和另一個大腸桿菌中有功能的原點的載體。為了穩(wěn)定和有效地表達克隆基因和有效地培養(yǎng)攜帶克隆基因的寄主細胞，應(yīng)該仔細考慮載體的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性。也可以將含有轉(zhuǎn)座元件如Tn5的DNA序列用作載體以便將目的基因?qū)雰?yōu)選的宿主，特別是染色體上。同時可將含有任何從優(yōu)選宿主中分離的DNA和目的基因的DNA序列用于將所需的DNA序列導(dǎo)入優(yōu)選的宿主，特別是染色體上。通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)接或電穿孔可以將這樣的DNA序列轉(zhuǎn)移到優(yōu)選的宿主中。
有用的寄主是原核或真核生物起源的并可以包括微生物、哺乳動物細胞和植物細胞。作為優(yōu)選的微生物，可以提到細菌如大腸桿菌、惡臭假單胞菌、木醋桿菌、巴氏醋桿菌、醋化醋桿菌、漢氏醋桿菌、弱氧化葡糖桿菌、和任何革蘭氏陰性細菌，它們能生產(chǎn)重組細胞色素c。所述的微生物的功能等價物、繼代培養(yǎng)物、突變體和變異體也可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的菌株是大腸桿菌K12和它的衍生物、惡臭假單胞菌或氧化葡糖桿菌DSMNo.4025。
通過已知方法將編碼本發(fā)明的細胞色素c的DNA序列連接進入含有在上述宿主細胞中可操作的調(diào)節(jié)區(qū)如啟動子和核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子的適當(dāng)載體以便生產(chǎn)表達載體。
為了構(gòu)建攜帶表達載體的寄主細胞，可以利用各種DNA轉(zhuǎn)移方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合交配(普通和分子細菌學(xué)方法，第14和15章，PhilippGerhardt等編，美國微生物學(xué)協(xié)會，1994)和電穿孔。用構(gòu)建轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法可以選自分子生物學(xué)領(lǐng)域已知的方法。通常的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以用于大腸桿菌、假單胞菌和醋桿菌。轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也可以用于大腸桿菌。接合交配系統(tǒng)可以廣泛地用于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌包括大腸桿菌、惡臭假單胞菌和氧化葡糖桿菌。PCT申請
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