一種用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物、方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物、方法及 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 靶基因的選擇對(duì)真菌檢測(cè)鑒定至關(guān)重要。目前在真菌研究中常選用的靶基因 有rRNA復(fù)合體、線粒體細(xì)胞色素 b(mitochondrial cytochrome b，cyt b)、微管蛋白 (beta-tubulin)等基因。rRNA復(fù)合體中，ITS序列含有高度的可變區(qū)，且每個(gè)基因組中含 有約100拷貝，多用于設(shè)計(jì)屬、種特異性引物，診斷侵襲性真菌病及分析系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān) 系的研究中。目前對(duì)于橡膠樹(shù)白粉菌的檢測(cè)鑒定，尚未在ITS序列中找到特異性引物，故不 能直接用來(lái)區(qū)分橡膠樹(shù)白粉菌與其他菌。
[0003] 因此，尋找一種快速檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物、方法及 應(yīng)用，本發(fā)明提供的特異性引物，利用PCR技術(shù)，能快速、有效地檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌，經(jīng)試驗(yàn) 確定該引物具有較強(qiáng)的特異性及較高的靈敏度。
[0005] 第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物，所述用于檢測(cè)橡膠 樹(shù)白粉菌的引物包括引物對(duì)，所述引物對(duì)為如下引物對(duì)的任一種：
[0006] 1)SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列及SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列組成的引物 對(duì)；2) SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列及SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列的 互補(bǔ)核苷酸序列組成的引物對(duì)。
[0007] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，各引物對(duì)中的至少一條序列替換為與序列自身具有90%、 95%、98%或99%同源性的核苷酸序列。具體地，比如，SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列替 換為與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列具有90%、95%、98%或99%同源性的核苷酸序列。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的方法，包括如下步驟：
[0009] a.制備如第一方面所述的用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物；
[0010] b.提取待測(cè)樣品的DNA _旲板；
[0011] C.配制PCR反應(yīng)體系，所述PCR體系中包括所述用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物和 所提取的待測(cè)樣品的DNA ;
[0012] d.采用PCR反應(yīng)檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有橡膠樹(shù)白粉菌。
[0013] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟c中，所述PCR體系中的DNA模板的濃度不低于 lng/uL〇
[0014] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟c中，所述PCR體系中的每條引物的濃度均為 IOuM0
[0015] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟c中，所述PCR體系中還包括：Tag聚合酶、Tag酶 緩沖液、dNTP。
[0016] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述步驟d中，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為55_60°C (進(jìn)一 步優(yōu)選為57°C )。
[0017] 第三方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸序列，為采用如第一方面所述的引物，對(duì)橡膠 樹(shù)白粉菌的核酸進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增獲得的核苷酸序列，所述核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 所示的核苷酸序列或與SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
[0018] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述核苷酸序列為如與SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列具有 90%、95%、98%、99%同源性的核苷酸序列，或與SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列互補(bǔ)的核苷 酸序列具有90 %、95 %、98 %、99 %同源性的核苷酸序列。
[0019] 第四方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的基因芯片，其具有如第一方面 所述引物中的至少一種。
[0020] 第五方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的試劑盒，其具有如第一方面所 述引物。進(jìn)一步還包含如第二方面所述的PCR反應(yīng)體系。
[0021] 第六方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述引物、如第二方面所述的方法、第三 方面所述的核苷酸序列在檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌中的應(yīng)用。
[0022] 在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述用于為：在制備檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的基因芯片或試劑 盒中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：據(jù)本發(fā)明提供的鑒定橡膠樹(shù)白粉菌的特異性引物，可 以特異性地?cái)U(kuò)增獲得一段橡膠樹(shù)白粉菌的標(biāo)簽序列。本發(fā)明所述的特異性引物還可以制備 成檢測(cè)用基因芯片和/或試劑盒，由于使用流程簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，用時(shí)短、靈敏性高、具備實(shí) 際可操作性，因此能夠方便、快速地鑒定橡膠樹(shù)白粉菌。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的橡膠樹(shù)白粉菌特異性檢測(cè)電泳結(jié)果；
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的橡膠白粉菌檢測(cè)的靈敏度實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。若無(wú)特殊說(shuō)明，本 發(fā)明采用試劑均為行業(yè)內(nèi)常規(guī)試劑。發(fā)明采用的病原菌、所致病害名稱(chēng)：
[0027] CN 105177138 A 說(shuō)明書(shū) 3/4 頁(yè)
[0029] 本發(fā)明采用的試劑盒：
[0030] 真菌基因組DNA提取參照OMEGA真菌DNA提取試劑盒（貨號(hào)：D3390));植物基因 組DNA提取參照OMEGA植物DNA提取試劑盒（貨號(hào)：D3485)。
[0031] 本發(fā)明合成的用于檢測(cè)橡膠樹(shù)白粉菌的引物對(duì)：
[0032] 表1.特異性引物設(shè)計(jì)與合成
[0034] 實(shí)施例1特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
[0035] 將供試菌株基因組DNA及橡膠樹(shù)葉片基因組DNA全部稀釋成DNA濃度為lng。用 14640外引物（如表1所示）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)其特異性，以滅菌的ddH20為陰性對(duì)照。
[0036] PCR反應(yīng)體系為：25 μ L反應(yīng)體系 IOxTaqBuffer 2. 5 μ L ;2· 5mM dNTPs 2 μ L ;正反 引物（1〇4]?)2.5 41^;模板0嫩141^2.51]丁&9〇嫩聚合酶0.5 41^;(1(1!120 14 4匕
[0037] 反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s ;57°C退火30s ;72°C延伸lmin，35個(gè)循 環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)束后取5 yL PCR產(chǎn)物加入IyL Loading buffer于含