專利名稱：利用空間定域的靶分析物復(fù)制檢測(cè)和量化在樣品中核苷酸序列靶分析物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)在物質(zhì)樣品中靶分析物存在或缺乏的方法與隨身用具；本發(fā)明還涉及當(dāng)發(fā)現(xiàn)分析物存在于樣品中時(shí)量化它的方法。所分析的樣品可以是生物學(xué)物質(zhì)；環(huán)境物質(zhì)；食品物質(zhì)；或某些可以攜帶靶分析物的其它物質(zhì)。靶分析物是懷疑存在于所試驗(yàn)的物質(zhì)中的特異性核苷酸序列。可疑有機(jī)體或靶序列的存在或缺乏可以通過用鏈置換擴(kuò)增(SDA)或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑擴(kuò)增靶分析物確定。如果RNA的核苷酸序列是靶分析物，同時(shí)使用了SDA或PCR試劑，在擴(kuò)增步驟之前必須通過逆轉(zhuǎn)錄把RNA轉(zhuǎn)變成DNA。另外，在某些情況下，靶分析物RNA擴(kuò)增方法(如Qβ復(fù)制酶或RNA-X擴(kuò)增)可以不轉(zhuǎn)錄而利用。分析可在凝膠或半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行(這種培養(yǎng)基使得靶分析物可以擴(kuò)增，但是限制擴(kuò)增的靶分析物的遷移以便擴(kuò)增產(chǎn)物在培養(yǎng)基中形成靜止的可檢測(cè)的靶分析物菌落。菌落可通過各種技術(shù)檢測(cè)和計(jì)算，包括可檢測(cè)的SDA或PCR引物的利用；或靶分析物-互補(bǔ)特異性核苷酸序列；或可檢測(cè)的插層探針(如溴化乙錠、吖啶橙、SYBR綠以及相關(guān)產(chǎn)品)的利用。這樣的探針可由Eugene分子探針公司(俄勒岡)提供。
樣品中靶細(xì)菌分析物存在或缺乏的分析(其中所說的樣品置于無菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基上)是熟知的。各種細(xì)菌可以以這種方式在水、食物、生物樣品(如尿、腦脊髓液、肋膜液、腹水、關(guān)節(jié)液、糞等)中檢測(cè)到。這一試驗(yàn)方法依賴于靶分析物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中復(fù)制到可以觀察到靶分析物的可見菌落的程度的能力?？梢杂胁顒e地標(biāo)記細(xì)菌的各種類型以幫助區(qū)別在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的不同細(xì)菌菌落。當(dāng)使用這一分析方法時(shí)，可以形成可檢測(cè)的菌落所必需的時(shí)間可以短至一天而長(zhǎng)至幾周。
J.L.Burg等描述了通過Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增的RNA的快速熒光檢測(cè)方法，分析生物化學(xué)，vol.230(pp263-272)1995，學(xué)院出版公司。前述的檢測(cè)方法是非特異性的并需要大量的樣品制劑以適當(dāng)?shù)仄鹱饔?。另外，Burg等人的方法不能用于檢測(cè)在樣品中的DNA，并且不能在一次檢測(cè)一個(gè)以上的RNA靶。任何擴(kuò)增的RNA的量化是方法開端和樣品容器中可檢測(cè)的熒光存在之間的時(shí)間延遲的函數(shù)。
能夠在一次試驗(yàn)中檢測(cè)一種或多種可復(fù)制的靶核苷酸序列分析物的存在或缺乏并在短時(shí)間內(nèi)量化靶分析物是十分需要的。能夠檢測(cè)不能在非細(xì)胞系統(tǒng)中復(fù)制的有機(jī)體并檢測(cè)DNA基因組(認(rèn)為以多生命形式存在)也是十分需要的。
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)在物質(zhì)樣品中靶分析物存在或缺乏的方法與隨身用具。核苷酸靶的檢測(cè)通過在合適的粘性培養(yǎng)基中擴(kuò)增DNA或RNA序列的一個(gè)獨(dú)特的部分以在培養(yǎng)基中形成擴(kuò)增的核苷酸序列的相對(duì)靜止的菌落，然后檢測(cè)并計(jì)數(shù)可在培養(yǎng)基中形成的任何形成的核苷酸序列菌落來完成。這樣，所檢測(cè)的靶分析物是擴(kuò)增的核苷酸序列或可疑生命形式的序列。在培養(yǎng)基中散布所形成的靶分析物菌落相對(duì)于標(biāo)記或探針試劑的散布是有限的。
培養(yǎng)基含有或結(jié)合靶分析物特異性引物和合適的酶與試劑，這些酶與試劑引起在靶分析物DNA或RNA中特定的核苷酸序列的擴(kuò)增，使用的方法是鏈置換擴(kuò)增(SDA)或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或任何其它擴(kuò)增的方法如單一引物或無引物3SR，在某些情況下是Qβ復(fù)制酶RNA擴(kuò)增。在某些情況下，可以在實(shí)施本發(fā)明時(shí)利用在PCR技術(shù)(用于DNA擴(kuò)增的原理和擴(kuò)增，Ehrlich,H.A.ed.1989,Stockton出版社，紐約)中描述的其它擴(kuò)增方法。結(jié)果是在培養(yǎng)基中創(chuàng)造了特定核苷酸序列的局部高密度群體菌落。在樣品中包含并被引入培養(yǎng)基、并且不通過擴(kuò)增步驟復(fù)制的非靶基因組片段不成倍增加，它們也不能檢測(cè)。分析可在含有或結(jié)合一種或多種標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASMs)的培養(yǎng)基中完成。LASMs包括這樣的合成核苷酸序列，它互補(bǔ)于形成靶分析物的特異性核苷酸序列的部分，這樣就擴(kuò)增了特異性核苷酸序列。標(biāo)記可以是游離染料或熒光團(tuán)，或連接到互補(bǔ)的合成核苷酸序列上的物質(zhì)。LASMs最初均勻地分布在整個(gè)培養(yǎng)基中。LASMs，遵循在培養(yǎng)基中的散布規(guī)律，通過培養(yǎng)基向擴(kuò)增的核苷酸序列菌落遷移，并結(jié)合到這些核苷酸序列上，由此有差別地突出相對(duì)于培養(yǎng)基其余部分的菌落。由于LASMs朝著菌落的局部遷移，會(huì)在每個(gè)菌落的周圍形成低強(qiáng)度標(biāo)記的暈輪，并且在每個(gè)暈輪的中心將是相應(yīng)于標(biāo)記的菌落的高強(qiáng)度的峰。存在于培養(yǎng)基中的DNA或RNA的未擴(kuò)增分子由于其低濃度是不可檢測(cè)的(即使在用吖啶橙、溴化乙錠或其它染料染色后)。在某些情況下，標(biāo)記可以連接到用于PCR或SDA擴(kuò)增的一個(gè)或兩個(gè)寡核苷酸引物上。在這些情況下，引物起LASMs的作用。信號(hào)強(qiáng)度的動(dòng)力學(xué)研究的利用可以使非特異性背景信號(hào)無效，如可以由細(xì)胞碎片引起，因?yàn)檫@樣的非特異性背景信號(hào)不隨擴(kuò)增顯著地增加。
當(dāng)樣品進(jìn)行僅一種靶分析物的存在或缺乏的測(cè)定時(shí)，菌落可以通過DNA或RNA的非特異性染色(如吖啶橙或溴化乙錠)檢測(cè)。這樣的原因是這些熒光團(tuán)可以非特異性地插入任何擴(kuò)增的核苷酸序列，當(dāng)這樣產(chǎn)生時(shí)，特異性通過擴(kuò)增引物的特異性達(dá)到而無須把熒光團(tuán)與互補(bǔ)核苷酸序列連接。在測(cè)定一個(gè)以上靶分析物的樣品的情況下，則一個(gè)以上互補(bǔ)核苷酸序列可以連接到一種或多種不同的熒光團(tuán)上以突出任何擴(kuò)增的在培養(yǎng)基中形成的核苷酸序列菌落并確定它們的類型。多達(dá)二十一種不同的靶分析物可以通過使用攜帶多達(dá)三個(gè)有差別的可檢測(cè)的熒光團(tuán)的LASM在單一測(cè)定或分析中檢測(cè)。
在進(jìn)行本發(fā)明的分析中，重要的是所選擇的靶分析物DNA或RNA的擴(kuò)增的核苷酸序列具有這樣的大小，即大約150mer至大約500mer，以便這樣的拷貝不能在培養(yǎng)基之內(nèi)迅速遷移，這樣在分析過程期間在培養(yǎng)基之內(nèi)將保持相對(duì)靜止。同樣重要的是，所選擇的LASMs具有這樣的大小，即大約18mer至大約40mer，以便足夠地小以使它們?cè)谂囵B(yǎng)基之內(nèi)能夠比擴(kuò)增的靶分析物序列更迅速地?cái)U(kuò)散，并足夠地長(zhǎng)以具有對(duì)擴(kuò)增的核苷酸序列的必要的特異性。理想地是，可以利用大約18mer的LASM。另外，針對(duì)擴(kuò)增的靶分析物中的不同核酸序列的適當(dāng)大小的兩個(gè)或多個(gè)LASMs可用于提高的特異性。當(dāng)然，培養(yǎng)基也必須具有這樣的類型以使包括探針的擴(kuò)增試劑可在培養(yǎng)基內(nèi)足夠快地?cái)U(kuò)散以使得擴(kuò)增比這樣擴(kuò)增的產(chǎn)物更迅速地從菌落擴(kuò)散開。
樣品通過首先溶解其所有細(xì)胞和有機(jī)體組分以把所有樣品的細(xì)胞和有機(jī)體組分的基因物質(zhì)釋放進(jìn)溶液制備用于分析，參見Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook,J.(1987)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港出版社。然后把溶解的樣品的富含核苷酸的已知體積的等分試樣引入培養(yǎng)基并均勻分布在培養(yǎng)基上。如果必要，靶分析物擴(kuò)散進(jìn)培養(yǎng)基可由垂直電泳和/或在分析之前通過限制消化或機(jī)械剪切減少其大小擴(kuò)大。這樣，樣品的靶組分的遺傳物質(zhì)DNA和/或RNA在培養(yǎng)基中接觸擴(kuò)增物質(zhì)。這樣，在接觸的基因物質(zhì)上的靶核苷酸序列擴(kuò)增到靶分析物的拷貝的菌落在培養(yǎng)基上形成的程度。因?yàn)榘蟹治鑫锏拇笮∫约翱截惖拇笮”容^大，擴(kuò)增的靶分析物菌落將相對(duì)靜止地保持在培養(yǎng)基上。LASMs(如果在培養(yǎng)基中不預(yù)先摻入)在擴(kuò)增步驟之后添加至培養(yǎng)基中，并且比較均勻地分布。測(cè)定了LASMs的大小以能夠遷移入或通過培養(yǎng)基。因此，LASMs遷移至靶分析物菌落并結(jié)合至靶分析物菌落中的拷貝上。這一結(jié)合將使菌落發(fā)射比培養(yǎng)基周圍區(qū)更高水平的標(biāo)記信號(hào)，事實(shí)上，接觸菌落的就近圍繞區(qū)發(fā)射削弱標(biāo)記的信號(hào)。凈結(jié)果是在培養(yǎng)基中由“模糊”暈輪圍繞的“亮點(diǎn)”。最后，在樣品中沒有任何靶分析物存在，培養(yǎng)基保持標(biāo)記信號(hào)發(fā)射的比較平坦的水平，并將看來均勻“著色”。包含熒光團(tuán)的互補(bǔ)核苷酸結(jié)合到它們各自的靶分析物的檢測(cè)也可以通過時(shí)間分辨熒光完成(如美國(guó)專利5,485,530,Lokowicz等所述)。如果需要，樣品在細(xì)胞裂解前可施用于培養(yǎng)基以確定相對(duì)于細(xì)胞核苷酸的靶的定域，即確定靶是在胞內(nèi)還是在胞外。如果需要，LASMs以及其它擴(kuò)增需要的試劑可浸滲在固相支持體上，如尼龍膜或紙帶，并允許通過把膜放置于培養(yǎng)基的頂端而擴(kuò)散進(jìn)培養(yǎng)基。
測(cè)定可以在通過在培養(yǎng)基中產(chǎn)生靶分析物的拷貝用樣品接種培養(yǎng)基之后在幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)完成。在任何細(xì)胞類型或樣品中存在的病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、原生動(dòng)物或特異性核苷酸可以通過利用特異性核苷酸序列擴(kuò)增和本發(fā)明的檢測(cè)方法測(cè)定，并且，由于人們知道添加至培養(yǎng)基的樣品體積，通過計(jì)算在培養(yǎng)基中的突出的菌落的數(shù)量，人們可檢測(cè)每單位體積樣品的靶分析物的量，這樣使靶分析物的樣品能夠獲得定量分析。
培養(yǎng)基的一部分用不包含已知的靶核苷酸的對(duì)照樣品接種，但完全如已知樣品那樣進(jìn)行處理和制備。培養(yǎng)基的這一部分可作為陰性對(duì)照。最后，擴(kuò)增標(biāo)記的菌落在培養(yǎng)基的陰性對(duì)照區(qū)中形成，人們可以推測(cè)培養(yǎng)基或擴(kuò)增或溶解試劑或所有部分的沾染，測(cè)定的結(jié)果無效。培養(yǎng)基的另一部分通過在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)施用包含已知量的靶分析物的樣品也可以隔離并作為陽性對(duì)照。如果培養(yǎng)基的陽性對(duì)照區(qū)不能具有菌落的適當(dāng)數(shù)量與類型，測(cè)定的擴(kuò)增和/或檢測(cè)步驟不能正確起作用，測(cè)定無效。
因此，提供可以用來測(cè)定樣品中靶分析物存在或缺乏的方法與儀器是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供描述的特性的方法與儀器，其中所說的樣品放置在與靶分析物特異性標(biāo)記物質(zhì)(可以在培養(yǎng)基之內(nèi)遷移)結(jié)合的培養(yǎng)基上。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供描述的特性的方法與儀器，其中所說的靶分析物是特性核苷酸序列或來自生命形式的RNA或DNA的序列。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供描述的特性的方法與儀器，其中所說的靶分析物通過形成其擴(kuò)增菌落并有區(qū)別地標(biāo)記任何擴(kuò)增的菌落(在培養(yǎng)基中形成)檢測(cè)。
本發(fā)明的這些和其它目的及優(yōu)點(diǎn)在結(jié)合附圖時(shí)從下列本發(fā)明的詳細(xì)描述更容易看出，其中

圖1是按照本發(fā)明形成的標(biāo)記的靶分析物特異性與生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合物的平面圖觀；圖2和3是類似于圖1的平面圖觀，但是顯示了由于在測(cè)定的樣品中靶分析物的存在在混合物中形成不同程度的局部強(qiáng)度標(biāo)記區(qū)；圖4是從樣品發(fā)出的信號(hào)強(qiáng)度水平的圖象掃跡，樣品通過自動(dòng)信號(hào)檢測(cè)儀器掃描。
實(shí)施本發(fā)明的詳盡的實(shí)施例現(xiàn)在參考圖1，顯示的是培養(yǎng)基矩形部分的平面圖觀，通常由數(shù)字2表示，這適合于進(jìn)行本發(fā)明的方法。當(dāng)在樣品中沒有任何靶分析物存在時(shí)，如在圖1中顯示的培養(yǎng)基區(qū)域陰暗均勻以表明均勻分布的標(biāo)記信號(hào)發(fā)射，該發(fā)射在培養(yǎng)基用樣品接種之前或在樣品引入和溫育之后由人眼或掃描儀檢測(cè)。在培養(yǎng)基2中的區(qū)3是不接觸測(cè)定樣品的區(qū)，但是該區(qū)含有所有用于試驗(yàn)的試劑并因此作為陰性對(duì)照區(qū)。在圖1中的區(qū)5是也含有所有用于試驗(yàn)的試劑的區(qū)。區(qū)5不接觸樣品，但是接觸含有已知濃度的靶分析物的陽性對(duì)照溶液。當(dāng)靶分析物在樣品中存在時(shí)，圖2和3是在培養(yǎng)基2中的發(fā)射方式變化的說明。圖2顯示了在產(chǎn)生許多更高度標(biāo)記的菌落4(在培養(yǎng)基2中由低水平標(biāo)記的暈輪6圍繞)的樣品中比較低水平的靶分析物的結(jié)果。圖3顯示了在樣品中存在比較高水平的靶分析物的結(jié)果。從圖2和3注意到人們可以對(duì)菌落4計(jì)數(shù)，并且由于樣品接種物的體積和培養(yǎng)基2的區(qū)域大小已知，人們可以通過本發(fā)明的方法得出每單位體積靶分析物的濃度。從圖2和3還可注意到陽性對(duì)照區(qū)5具有相同數(shù)量的菌落，而與在培養(yǎng)基2的其余部分中形成的菌落的數(shù)量無關(guān)。
圖4是標(biāo)記的發(fā)射強(qiáng)度的圖形，該標(biāo)記可由自動(dòng)分析儀器檢測(cè)(當(dāng)它進(jìn)行培養(yǎng)基的線形掃描時(shí))。掃跡8代表培養(yǎng)基本身的發(fā)射水平；下沉10代表在暈輪6中低水平的發(fā)射；峰12代表菌落4中的高水平發(fā)射。
下列是可以利用本發(fā)明的技術(shù)檢測(cè)的可疑有機(jī)體特異性的靶分析物的實(shí)施例以及用于檢測(cè)每個(gè)靶分析物的試劑。
實(shí)施例1可以利用本發(fā)明的技術(shù)檢測(cè)和量化的一個(gè)有機(jī)體是HIV-1病毒。用于檢測(cè)HIV-1的靶分析物基因是病毒聚合酶，其功能是病毒基因組的復(fù)制。(可以注意到聚合酶基因僅是可以以這一方法檢測(cè)的幾個(gè)HIV-1基因之一。事實(shí)上，同時(shí)量化兩個(gè)HIV-1基因(例如，聚合酶和蛋白酶)的濃度的方案對(duì)極少數(shù)假陽性結(jié)果是敏感的，因?yàn)榫酆厦笇?duì)蛋白酶的比是相對(duì)恒定的。)可以利用PCR來擴(kuò)增病毒聚合酶基因的正向引物是GCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCC；反向引物是CCTGCGGGATGTGGTATTCC。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于上述正向引物或反向引物之間的某一區(qū)。互補(bǔ)核苷酸序列可以共價(jià)連接到提供必要的發(fā)射信號(hào)的熒光團(tuán)上。在這種情況下，LASM應(yīng)該在寡核苷酸3＇末端的核苷酸的3＇位置缺乏羥基基團(tuán)以阻止一個(gè)LASM與另一個(gè)雜交形成的產(chǎn)物的擴(kuò)增。如果不利用單個(gè)LASM，那么熒光團(tuán)將連接到用于PCR的寡核苷酸引物的一個(gè)或兩個(gè)的5＇端或一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵上。所有引物和LASMs應(yīng)該在寡核苷酸3＇末端的核苷酸的3＇位置缺乏羥基基團(tuán)以阻止一個(gè)LASM與另一個(gè)雜交形成的產(chǎn)物的擴(kuò)增。合適的培養(yǎng)基包括包含2.5至5.0％丙烯酰胺和0.025至2.5％雙丙烯酰胺的丙烯酰胺凝膠；或0.5％瓊脂糖；以及包含0.75至1.5％瓊脂糖的標(biāo)準(zhǔn)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠。如上所述，本發(fā)明的技術(shù)通過利用具有低凝膠百分比的培養(yǎng)基組合物優(yōu)化，例如大約4至5％丙烯酰胺凝膠與2％或更少的瓊脂糖。
以適當(dāng)?shù)腜CR試劑浸滲的培養(yǎng)基可以制備如下。制備由20mM Tris，大約8.0的pH(在50mM EDTA中)組成的100ml洗滌溶液；由2mM Tris，大約8.0的pH(在0.5mM EDTA中)組成的10ml母液。在室溫下把凝膠浸沒在5ml的洗滌溶液中大約15分鐘。這一步驟在新鮮的洗滌溶液中重復(fù)5次。然后把凝膠浸沒在包含PCR引物、酶以及dNTPs等的5ml母液中。
對(duì)于用SDA方法的擴(kuò)增，使用包含適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)的相關(guān)引物。例如，可以通過SDA用來擴(kuò)增病毒的聚合酶基因的正向引物是TTGAATAGTCGGTTACTTGTTGACACTCGGCACTTTAAAT；反向引物是ACCGACTATTGTTGACACTGCCTGCGGGATGTGGTATTCC。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。基于寡核苷酸的LASM不應(yīng)互補(bǔ)于前述正向或反向引物，但是互補(bǔ)于靶分子的一部分。這一作用特異地集中可檢測(cè)試劑于分子菌落上，而不是集中于可游離地分布于整個(gè)培養(yǎng)基中的引物上?；パa(bǔ)核苷酸序列可以共價(jià)地連接到一種或多種熒光團(tuán)上，該熒光團(tuán)提供了必要的發(fā)射信號(hào)。如果不利用獨(dú)立的LASM，那么熒光團(tuán)將連接到用于SDA的寡核苷酸引物的一個(gè)或兩個(gè)的3＇端或一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵上。
用適當(dāng)?shù)腟DA試劑浸滲的培養(yǎng)基可以制備如下。制備由50mM磷酸鉀(具有大約7.4的pH)和6mM MgCl2組成的100ml洗滌溶液；由洗滌溶液加SDA引物、適當(dāng)?shù)南拗泼?、外源Klenow聚合酶以及dNTPs組成的10ml母液。將凝膠浸沒在5ml洗滌溶液中，在室溫下保持大約15分鐘。這一步驟在新鮮的洗滌溶液中重復(fù)5次。然后將凝膠浸沒在5ml母液中。
LASM可以制備如下。對(duì)于染料異硫氰酸鹽標(biāo)記，互補(bǔ)核苷酸序列鏈含有攜帶附加的伯胺的一種或多種修飾堿基。將要標(biāo)記的鏈溶解在pH9.0的0.1M碳酸氫鈉中，將染料異硫氰酸鹽以10mg/ml的濃度溶解在干DMF中。然后將染料溶液隨攪拌滴加至互補(bǔ)核苷酸序列溶液中，反應(yīng)在室溫下溫育12小時(shí)。然后通過凝膠過濾除去游離染料，通過凝膠電泳或HPLC純化染料互補(bǔ)的核苷酸序列綴合物。對(duì)于染料琥珀酰亞胺酯標(biāo)記，將要標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸序列溶解在0.1M磷酸鈉(pH8.0)中?；パa(bǔ)核苷酸序列-標(biāo)記綴合反應(yīng)在4℃下進(jìn)行以最小化琥珀酰亞胺酯標(biāo)記的水解。各種染料標(biāo)記的DNA可以由化學(xué)合成直接制備并廣泛地用于DNA測(cè)序。
靶分析物可以以下列方式嵌入培養(yǎng)基中。大約2.5×107細(xì)胞的懸浮液從組織勻漿或培養(yǎng)物中制備，并在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基(無胎牛血清)或等滲鹽水中徹底洗滌。然后混合物在2,000g 4℃下離心20分鐘，取出上清液，將包含核酸的沉淀完全排水。將細(xì)胞重新懸浮在5ml 50mM Tris(pH8.0)和50mM EDTA中并在-20℃下凍結(jié)。向凍結(jié)的溶液添加0.5ml溶菌酶溶液(在0.25M Tris(pH8.0)中的10mg/mL溶菌酶)，混合物在4℃下溫育45分鐘。添加1ml STEP溶液(0.5％十二烷基硫酸鈉、50mM Tris(pH7.5)、0.4MEDTA、1mg/mL蛋白酶K(在利用之前添加)，溶液在50℃下溫育一小時(shí)。添加6ml的緩沖酚，將乳狀液在1,000g下離心15分鐘。將上面的包含核酸的層轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的試管中，添加0.1體積3M乙酸鈉和2體積無水乙醇。包含DNA和RNA的沉淀重新溶解在5mL 50mM Tris(pH7.5)和1mM EDTA中。如果僅需要細(xì)胞DNA，可以添加200μg RNase。核酸可以直接施用于培養(yǎng)基，或它可以首先利用限制酶處理或用針剪切以減少它的平均大小。
靶分析物擴(kuò)增PCR反應(yīng)可以進(jìn)行如下。將凝膠、樣品、PCR和LASM混合物加熱至95℃保持3分鐘，然后加熱至95℃30個(gè)循環(huán)保持45秒，在55℃下退火90秒并在72℃下每750個(gè)核苷酸延長(zhǎng)1分鐘。例如，如果擴(kuò)增750個(gè)核苷酸長(zhǎng)的靶，使得延長(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)行1分鐘；另一方面，如果靶長(zhǎng)375個(gè)核苷酸，使得延長(zhǎng)進(jìn)行30秒。反應(yīng)在72℃下延長(zhǎng)10分鐘結(jié)束。然后檢查培養(yǎng)基以確定在培養(yǎng)基中靶分析物菌落的存在或缺乏。
靶分析物擴(kuò)增SDA反應(yīng)可以進(jìn)行如下。將凝膠、樣品、SDA以及LASM混合物在37℃溫育三十分鐘至四小時(shí)。然后檢查培養(yǎng)基以確定在培養(yǎng)基中靶分析物菌落的存在或缺乏。
實(shí)施例2利用本發(fā)明的技術(shù)可以檢測(cè)和量化的另一個(gè)靶分析物是M.tuberculosis。檢測(cè)M.tuberculosis的靶基因是inhA，其功能是脂肪酸生物合成。用于通過PCR擴(kuò)增的inhA的正向引物是ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG；反向引物是GGCGCGCGAGGCCGGCAAGTACGG。
這些引物擴(kuò)增M.tuberculosis的inhA基因的279堿基對(duì)區(qū)。如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。基于寡核苷酸的LASM不應(yīng)互補(bǔ)于前述正向或反向引物，但是互補(bǔ)于靶分子的一部分。這一作用特異地集中可檢測(cè)試劑于分子菌落上，而不是集中于可游離地分布于整個(gè)培養(yǎng)基中的引物上。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
對(duì)于通過SDA的inhA基因的擴(kuò)增，正向引物是AGTCGGTTACTTGTTGACACTCGACCCAATCGAATTGCCA；反向引物是ACCGACTATTGTTGACACTGCGCGAGGCCG GCAAGTACGG。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
實(shí)施例3可以通過利用本發(fā)明的技術(shù)檢測(cè)和量化的另一個(gè)有機(jī)體是INH-抗性M.tuberculosis。用于檢測(cè)INH-抗性M.tuberculosis的靶分析物基因是突變的inhA，其功能是脂肪酸生物合成。用于通過PCR擴(kuò)增突變的inhA基因的正向引物是ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG；
反向引物是GCCGATCGATGAACCCCGGAGGTTCC。
這些引物擴(kuò)增在INH-抗性M.tuberculosis中的突變的inhA基因的159個(gè)堿基對(duì)區(qū)。如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)?；诠押塑账岬腖ASM不應(yīng)互補(bǔ)于前述正向或反向引物，但是互補(bǔ)于靶分子的一部分。這一作用特異地集中可檢測(cè)試劑于分子菌落上，而不是集中于可游離地分布于整個(gè)培養(yǎng)基中的引物上。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
對(duì)于通過SDA的突變inhA基因的擴(kuò)增，正向引物是AGTCGGTTACTTGTTGACACACCCAATCGAATTGCCACAC；反向引物是ACCGACTATTGTTGACACTGCGATGAACCCCGGAGGTTCC。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
實(shí)施例4可以通過利用本發(fā)明的技術(shù)檢測(cè)和量化的另一個(gè)有機(jī)體是HBV。用于檢測(cè)HBV的靶分析物基因是pX基因，其功能是轉(zhuǎn)錄。用于通過PCR擴(kuò)增pX基因的正向引物是GGTGAAGCGAAGTGCACACGGACCGGC；反向引物是GCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGG。
這些引物擴(kuò)增在HBV中的pX基因的196堿基對(duì)區(qū)。如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。基于寡核苷酸的LASM不應(yīng)互補(bǔ)于前述正向或反向引物，但是互補(bǔ)于靶分子的一部分。這一作用特異地集中可檢測(cè)試劑于分子菌落上，而不是集中于可游離地分布于整個(gè)培養(yǎng)基中的引物上。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
對(duì)于通過SDA的HBV pX基因的擴(kuò)增，正向引物是
AGTCGGTTACTTGTTGACACGGTGAAGCGAAGTGCACACG；反向引物是ACCGACTATTGTTGACACTGGCTGGGGGAGGAGATTAG。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
實(shí)施例5可以利用本發(fā)明的技術(shù)檢測(cè)和量化的另一個(gè)有機(jī)體是Pneumocystiscarinii。用于檢測(cè)Pneumocystis carinii的靶分析物基因是線粒體rRNA，其功能是蛋白質(zhì)合成。用于Pneumocystis carinii線粒體rRNA基因擴(kuò)增的正向引物是GATGGCTGTTTCCAAGCCCA；反向引物是GTGTACGTTGCAAAGTACTC。
這些引物擴(kuò)增在Pneumocystis carinii中的線粒體rRNA基因的344個(gè)堿基對(duì)區(qū)。如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。基于寡核苷酸的LASM不應(yīng)互補(bǔ)于前述正向或反向引物，但是互補(bǔ)于靶分子的一部分。這一作用特異地集中可檢測(cè)試劑于分子菌落上，而不是集中于可游離地分布于整個(gè)培養(yǎng)基中的引物上。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
對(duì)于通過SDA的Pneumocystis carinii線粒體rRNA基因的擴(kuò)增，正向引物是AGTCGGTTACTTGTTGACACGATGGCTGTTTCCAAGCCCA；反向引物是ACGTGTACGTTGCAAAGTACGTGTACGTTGCAAAGTACTC。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
實(shí)施例6可以利用本發(fā)明的技術(shù)檢測(cè)和量化的另一個(gè)有機(jī)體是甲氧西林抗性的S.aureus。用于檢測(cè)甲氧西林抗性的S.aureus的靶分析物基因是青霉素結(jié)合蛋白。通過PCR擴(kuò)增mecA基因的正向引物是AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC；反向引物是AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC。
這些引物擴(kuò)增mecA基因的533堿基對(duì)區(qū)。如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)?；诠押塑账岬腖ASM不應(yīng)互補(bǔ)于前述正向或反向引物，但是互補(bǔ)于靶分子的一部分。這一作用特異地集中可檢測(cè)試劑于分子菌落上，而不是集中于可游離地分布于整個(gè)培養(yǎng)基中的引物上。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
對(duì)于通過SDA的mecA基因的擴(kuò)增，正向引物是AGTCGGTTACTTGTTGACACAAAATCGATGGTAAAGGTTG；反向引物是GCTGGGGGAGGAGATTAGACAGTTCTGCAGTACCGGATTT。
如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。培養(yǎng)基與LASM制備過程基本上與實(shí)施例1提出的相同，引入方法也是這樣。
應(yīng)該認(rèn)識(shí)到如果利用獨(dú)立的LASM，它互補(bǔ)于前述正向或反向引物之間的某一區(qū)。可以借助于本發(fā)明分析的樣品包括組織、血液、生物體液(如用于呼吸靶分析物的痰，用于腸靶分析物的糞便。實(shí)質(zhì)上任何生命形式的存在或缺乏以及量化(包括但不限于原生動(dòng)物、細(xì)菌、病毒、真菌等)可以通過利用本發(fā)明的技術(shù)在基本上任何樣品中進(jìn)行檢測(cè)。同樣，不同的生命形式(如病毒和細(xì)菌)可以在一個(gè)試驗(yàn)中檢測(cè)和量化，該試驗(yàn)可通過按照本發(fā)明的方案在普通樣品上進(jìn)行。呼吸疾病、腹瀉、生殖疾病以及許多其它疾病的完全不同的原因可以利用本發(fā)明的方法在單一試驗(yàn)中弄清楚。
核苷酸序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人(A)Levine,Robert A.；(B)Wardlaw,Stephen C.(ⅱ)發(fā)明名稱利用空間定域的靶分析物復(fù)制檢測(cè)和量化在樣品中核苷酸序列靶分析物(ⅲ)序列數(shù)24(ⅳ)通信地址(A)收信人William W.Jones(B)街道6 Juniper Lane(C)城市Madison(D)州CT(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵區(qū)代碼06443(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)Macintosh Performa 637CD(C)操作系統(tǒng)Macintosh7.5(D)軟件ClarisWorks 2.1(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?8/841,267(B)申請(qǐng)日期1997年4月29日(C)分類號(hào)435類(ⅶ)現(xiàn)有申請(qǐng)數(shù)據(jù)N/A(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名William W.Jones(B)注冊(cè)號(hào)24,607(C)參考/檔案號(hào)UFB-001
(ⅸ)電訊信息(A)電話(203)2452418(B)傳真(203)2459294(2)關(guān)于SEQ ID No.1的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度25個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HIV-1(C)個(gè)體分離物聚合酶基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述GCACTTTAAA TTTTCCCATT AGT CC(3)關(guān)于SEQ ID No.2的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型(A)描述基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無
(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HIV-1(C)個(gè)體分離物聚合酶基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述CCTGCGGGAT GTGGTATTCC(4)關(guān)于SEQ ID No.3的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HIV-1(C)個(gè)體分離物聚合酶基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACACTCGG CACTTTAAAT(5)關(guān)于SEQ ID No.4的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HIV-1(C)個(gè)體分離物聚合酶基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述ACCGACTATT GTTGACACTG CCTGCGGGAT GTGGTATTCC(6)關(guān)于SEQ ID No.5的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度 24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述ACCCAATCGA ATTGCCACAC CCC G(7)關(guān)于SEQ ID No.6的信息；
(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述GGCGCGCGAG GCCGGCAAGT ACG G(8)關(guān)于SEQ ID No.7的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置
(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述AGTCGGTTAC TTGTTGACAC TCGACCCAAT CGAATTGCCA(9)關(guān)于SEQ ID No.8的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述ACCGACTATT GTTGACACTG CGCGAGGCCG GCAAGTACGG(10)關(guān)于SEQ ID No.9的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源
(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述ACCCAATCGA ATTGCCACAC CCC G；(11)關(guān)于SEQ ID No.10的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株INH-抗性M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物突變的inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述GCCGATCGAT GAACCCCGGA GGT TCC(12)關(guān)于SEQ ID No.11的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型
(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株INH-抗性M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物突變的inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述AGTCGGTTAC TTGTTGACAC ACCCAATCGA ATTGCCACAC(13)關(guān)于SEQ ID No.12的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株INH-抗性M.tubercle bacilus(C)個(gè)體分離物突變的inhA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述ACCGACTATT GTTGACACTG CGATGAACCC CGGAGGTTCC(14)關(guān)于SEQ ID No.13的信息；(ⅰ)序列特征
(A)長(zhǎng)度27個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HBV(C)個(gè)體分離物pX基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述GGTGAAGCGA AGTGCACACG GAC CGG C(15)關(guān)于SEQ ID No.14的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度26個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HBV(C)個(gè)體分離物pX基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物
(ⅹⅰ)序列描述GCTGGGGGAG GAGATTAGGT TAA AGG(16)關(guān)于SEQ ID No.15的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒(B)菌株HBV(C)個(gè)體分離物pX基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GGTGAAGCGA AGTGCACACG(17)關(guān)于SEQ ID No.16的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度38個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體病毒
(B)菌株HBV(C)個(gè)體分離物pX基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述ACCGACTATT GTTGACACTG GCTGGGGGAG GAG ATT AG(18)關(guān)于SEQ ID No.17的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組RNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體原生動(dòng)物(B)菌株P(guān)neumocystis carinii(C)個(gè)體分離物線粒體rRNA(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述GATGGCTGTT TCCAAGCCCA(19)關(guān)于SEQ ID No.18的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組RNA
(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體原生動(dòng)物(B)菌株P(guān)neumocystis carinii(C)個(gè)體分離物線粒體rRNA(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述GTGTACGTTG CAAAGTACTC(20)關(guān)于SEQ ID No.19的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組RNA(ⅲ )假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體原生動(dòng)物(B)菌株P(guān)neumocystis carinii(C)個(gè)體分離物線粒體rRNA(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GATGGCTGTT TCCAAGCCCA(21)關(guān)于SEQ ID No.20的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組RNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體原生動(dòng)物(B)菌株P(guān)neumocystis carinii(C)個(gè)體分離物線粒體rRNA(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述ACGTGTACGT TGCAAAGTAC GTGTACGTTG CAAAGTACTC(22)關(guān)于SEQ ID No.21的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株甲氧西林-抗性S.aureus(C)個(gè)體分離物mecA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述
AAAATCGATG GTAAAGGTTG GC(23)關(guān)于SEQ ID No.22的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株甲氧西林-抗性S.aureus(C)個(gè)體分離物mecA基因(ⅷ )在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述AGTTCTGCAG TACCGGATTT GC(24)關(guān)于SEQ ID No.23的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株甲氧西林-抗性S.aureus
(C)個(gè)體分離物mecA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段正向引物(ⅹⅰ)序列描述AGTCGGTTAC TTGTTGACAC AAAATCGATG GTAAAGGTTG(25)關(guān)于SEQ ID No.24的信息；(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度40個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ⅱ)分子類型基因組DNA(ⅲ)假設(shè)無(ⅳ)反義無(ⅵ)原始來源(A)有機(jī)體細(xì)菌(B)菌株甲氧西林-抗性S.aureus(C)個(gè)體分離物mecA基因(ⅷ)在基因組中的位置(A)染色體節(jié)段反向引物(ⅹⅰ)序列描述GCTGGGGGAG GAGATTAGAC AGTTCTGCAG TACCGGATTT因?yàn)楸景l(fā)明的公開的實(shí)施方案的許多變化與改變可以在不背離本發(fā)明構(gòu)思的情況下進(jìn)行，不打算以其它方式限制所附的權(quán)利要求要求的本發(fā)明。
權(quán)利要求
1．用于確定在樣品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的裝配，所說的裝配包含a)樣品可以引入的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可操作地支持把靶分析物擴(kuò)增至需要由此產(chǎn)生其菌落的程度，而同時(shí)限制在培養(yǎng)基之內(nèi)形成的任何擴(kuò)增的靶分析物菌落的遷移；b)在所說的培養(yǎng)基中的靶分析物特異性擴(kuò)增試劑，所說的擴(kuò)增試劑可操作地有選擇擴(kuò)增并形成可在樣品中存在的任何靶分析物的菌落；和c)標(biāo)記的分析物特異性的物質(zhì)(LASM)，該物質(zhì)結(jié)合所說的靶分析物，所說的LASM能夠通過所說的培養(yǎng)基遷移至有差別地突出可在所說的培養(yǎng)基中形成的任何擴(kuò)增的靶分析物菌落必要的程度。
2．權(quán)利要求1的裝配，其中所說的LASM本質(zhì)上均質(zhì)地分布在整個(gè)所說的培養(yǎng)基中，并且在所說的培養(yǎng)基中是充分可動(dòng)的以便能夠在所說的培養(yǎng)基中形成高強(qiáng)度標(biāo)記的靶分析物菌落區(qū)，該區(qū)由在所說的培養(yǎng)基中的較低強(qiáng)度標(biāo)記的區(qū)圍繞。
3．權(quán)利要求1的裝配，其中所說的LASM是與所說的靶分析物互補(bǔ)的人工靶分析物特異性核苷酸序列。
4．權(quán)利要求1的裝配，其中所說的LASM是插層劑，該插層劑可以插入所說的靶分析物。
5．權(quán)利要求1的裝配，其中所說的擴(kuò)增試劑是聚合酶鏈反應(yīng)試劑。
6．權(quán)利要求1的裝配，其中所說的擴(kuò)增試劑是鏈置換擴(kuò)增試劑。
7．用于確定在樣品中兩個(gè)或多個(gè)不同靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的裝配，所說的裝配包含a)樣品可以引入的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可操作地支持把靶分析物擴(kuò)增至需要由此產(chǎn)生其菌落的程度，而同時(shí)限制在培養(yǎng)基之內(nèi)形成的任何擴(kuò)增的靶分析物菌落的遷移；b)在所說的培養(yǎng)基中的靶分析物特異性擴(kuò)增試劑，所說的試劑可操作地有選擇擴(kuò)增并形成可包含在樣品中的任何靶分析物的菌落；和c)標(biāo)記的分析物特異性的物質(zhì)(LASMs)，該物質(zhì)有選擇地結(jié)合所說的靶分析物，所說的LASMs能夠有差別地標(biāo)記并能夠通過所說的培養(yǎng)基遷移至突出可在所說的培養(yǎng)基中形成的任何擴(kuò)增的靶分析物菌落必要的程度，由此形成的靶分析物之一的任何菌落與在所說的培養(yǎng)基中形成的另一個(gè)靶分析物的任何菌落區(qū)別開。
8．權(quán)利要求7的裝配，其中所說的LASMs本質(zhì)上均質(zhì)地分布在整個(gè)所說的培養(yǎng)基中，并且在所說的培養(yǎng)基中是充分可動(dòng)的以便能夠在所說的培養(yǎng)基中形成高強(qiáng)度標(biāo)記的靶分析物菌落區(qū)，該區(qū)由在所說的培養(yǎng)基中的較低強(qiáng)度標(biāo)記的區(qū)圍繞。
9．權(quán)利要求7的裝配，其中所說的LASMs分別包含與所說的靶分析物之一各自互補(bǔ)的標(biāo)記的人工核苷酸序列。
10．權(quán)利要求7的裝配，其中所說的擴(kuò)增試劑是聚合酶鏈反應(yīng)試劑。
11．權(quán)利要求7的裝配，其中所說的擴(kuò)增試劑是鏈置換擴(kuò)增試劑。
12．用于確定在樣品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所說的方法包括以下步驟a)提供將要分析的樣品；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)從靶有機(jī)體釋放任何所說的靶分析物，所說的靶有機(jī)體可包含在樣品中；d)使任何釋放的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；和e)使任何釋放的靶分析物與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASM)反應(yīng)(該物質(zhì)結(jié)合在所說的培養(yǎng)基中任何形成的靶分析物菌落中的擴(kuò)增靶分析物單位)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的靶分析物菌落。
13．權(quán)利要求12的方法，其中所說的LASM在與所說的擴(kuò)增靶分析物單位反應(yīng)之前本質(zhì)上均質(zhì)地分布在所說的培養(yǎng)基中。
14．用于確定在樣品中兩個(gè)或多個(gè)不同靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所說的方法包括以下步驟a)提供將要分析的樣品；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)，該物質(zhì)對(duì)每個(gè)所說的靶分析物是選擇性地特異的；c)從靶有機(jī)體釋放任何所說的靶分析物，所說的靶有機(jī)體可包含在樣品中；d)使任何釋放的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；和e)使在所說的菌落中的任何擴(kuò)增靶分析物與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASMs)反應(yīng)(該物質(zhì)有選擇地與在所說的培養(yǎng)基中形成的菌落中的任何靶分析物結(jié)合)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的形成的靶分析物菌落，由此，由所說的靶分析物之一組成的任何擴(kuò)增靶分析物菌落將從由另一個(gè)靶分析物組成的擴(kuò)增靶分析物菌落有差別地突出。
15．權(quán)利要求14的方法，其中所說的LASMs包含分別有差別地標(biāo)記的人工核苷酸序列，該人工核苷酸序列與所說的各自的靶分析物之一互補(bǔ)。
16．用于量化在樣品中的靶核苷酸序列(靶分析物)的方法，所說的方法包含以下步驟a)提供固定體積的將要分析的樣品；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)從靶生命形式釋放任何所說的靶分析物，所說的生命形式可包含在所說的固定體積樣品中；d)使任何釋放的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；e)使任何擴(kuò)增靶分析物單位與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASMs)反應(yīng)(該物質(zhì)與在所說的培養(yǎng)基中形成的菌落中的任何靶分析物結(jié)合)以在所說的培養(yǎng)基中形成有差別地突出的靶分析物菌落；和f)計(jì)算在培養(yǎng)基中突出的擴(kuò)增靶分析物菌落區(qū)的數(shù)量以獲得每單位體積樣品濃度的靶分析物。
17．權(quán)利要求16的方法，該方法包括以下步驟確定在樣品中的核酸序列的擴(kuò)增的菌落的百分比和/或在含有所說的靶分析物的樣品中原位溶解的有機(jī)體或細(xì)胞的百分比。
18．用于量化在樣品中的兩個(gè)或多個(gè)靶核苷酸序列(靶分析物)的方法，所說的方法包含以下步驟a)提供固定體積的將要分析的樣品；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)從靶生命形式釋放任何所說的靶分析物，所說的生命形式可包含在所說的固定體積樣品中；d)使任何釋放的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；e)使在所說的菌落中的任何擴(kuò)增靶分析物單位與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASMs)反應(yīng)(該物質(zhì)與在所說的培養(yǎng)基中形成的菌落中的任何靶分析物有選擇地結(jié)合)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的靶分析物菌落，由此，由所說的靶分析物之一組成的任何擴(kuò)增靶分析物菌落將從由另一個(gè)靶分析物組成的擴(kuò)增靶分析物菌落有差別地突出；和f)計(jì)算在培養(yǎng)基中每個(gè)有差別地突出的擴(kuò)增靶分析物菌落區(qū)的數(shù)量以獲得在培養(yǎng)基中出現(xiàn)的每種靶分析物的每單位體積樣品濃度的靶分析物。
19．用于確定在樣品中靶核苷酸序列(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所說的方法包括以下步驟a)提供將要分析的樣品，所說的樣品可能包含游離的靶分析物；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)使任何游離的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；和e)使任何靶分析物與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASM)反應(yīng)(該物質(zhì)與在所說的培養(yǎng)基中任何形成的靶分析物菌落中的擴(kuò)增靶分析物單位結(jié)合)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的靶分析物菌落。
20．用于確定在樣品中兩個(gè)或多個(gè)不同靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所說的方法包括以下步驟a)提供將要分析的樣品，所說的樣品可能包含游離的靶分析物；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)，該物質(zhì)對(duì)每個(gè)所說的靶分析物是選擇性地特異的；c)使任何游離的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；和d)使在所說的菌落中的任何擴(kuò)增靶分析物與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASMs)反應(yīng)(該物質(zhì)有選擇地與在所說的培養(yǎng)基中形成的菌落中的任何靶分析物結(jié)合)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的形成的靶分析物菌落，由此，由所說的靶分析物之一組成的任何擴(kuò)增靶分析物菌落將從由另一個(gè)靶分析物組成的擴(kuò)增靶分析物菌落有差別地突出。
21．用于量化在樣品中的靶核苷酸序列(靶分析物)的方法，所說的方法包含以下步驟a)提供將要分析的樣品，所說的樣品可能包含游離的靶分析物；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)使任何游離的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；e)使任何擴(kuò)增靶分析物單位與標(biāo)記的分析物特異性物質(zhì)(LASM)反應(yīng)(該物質(zhì)與在所說的培養(yǎng)基中形成的菌落中的任何靶分析物結(jié)合)以在所說的培養(yǎng)基中形成有差別地突出的靶分析物菌落；和f)計(jì)算在培養(yǎng)基中突出的擴(kuò)增靶分析物菌落區(qū)的數(shù)量以獲得每單位體積樣品濃度的靶分析物。
22．用于確定在樣品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的裝配，所說的裝配包含a)樣品可以引入的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可操作地支持把靶分析物擴(kuò)增至需要由此產(chǎn)生其菌落的程度，而同時(shí)限制在培養(yǎng)基之內(nèi)形成的任何擴(kuò)增的靶分析物菌落的遷移；b)在所說的培養(yǎng)基中的靶分析物特異性擴(kuò)增試劑，所說的擴(kuò)增試劑可操作地有選擇擴(kuò)增并形成可在樣品中存在的任何靶分析物的菌落；和c)可檢測(cè)的物質(zhì)，該物質(zhì)能夠通過所說的培養(yǎng)基遷移至有差別地突出在所說的培養(yǎng)基中形成的任何擴(kuò)增的靶分析物菌落必要的程度。
23．用于確定在樣品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所說的方法包括以下步驟a)提供將要分析的樣品；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)從靶有機(jī)體釋放任何所說的靶分析物，所說的靶有機(jī)體可包含在樣品中；d)使任何釋放的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；和e)使任何釋放的靶分析物與可檢測(cè)物質(zhì)反應(yīng)(該物質(zhì)與在所說的培養(yǎng)基中任何形成的靶分析物菌落中的擴(kuò)增靶分析物單位結(jié)合)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的靶分析物菌落。
24．用于確定在樣品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所說的方法包括以下步驟a)提供將要分析的樣品，所說的樣品可能包含游離的靶分析物；b)提供適于樣品引入的試驗(yàn)培養(yǎng)基，所說的試驗(yàn)培養(yǎng)基包含靶分析物特異性擴(kuò)增物質(zhì)；c)使任何游離的靶分析物在所說的培養(yǎng)基中與所說的靶分析物擴(kuò)增物質(zhì)反應(yīng)以便在所說的培養(yǎng)基中形成所說的靶分析物的本質(zhì)上穩(wěn)定的擴(kuò)增菌落；和e)使任何釋放的靶分析物與可檢測(cè)物質(zhì)反應(yīng)(該物質(zhì)與在所說的培養(yǎng)基中任何形成的靶分析物菌落中的擴(kuò)增靶分析物單位結(jié)合)以從所說的培養(yǎng)基的其余部分有差別地突出所說的靶分析物菌落。
全文摘要
通過用物質(zhì)(如生物學(xué)或環(huán)境物質(zhì))樣品接種培養(yǎng)基測(cè)定可在該物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的靶分析物。靶分析物是可疑有機(jī)體的RNA或DNA的單一核苷酸序列或任何核苷酸靶或其核苷酸序列的組合,該有機(jī)體可在該物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)。培養(yǎng)基含有選擇的靶分析物擴(kuò)增物,該擴(kuò)增物導(dǎo)致存在于該物質(zhì)中的任何靶分析物的擴(kuò)增。
文檔編號(hào)C12R1/92GK1209546SQ9810777
公開日1999年3月3日 申請(qǐng)日期1998年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月29日
發(fā)明者羅伯特·A·利費(fèi)恩, 史戴芬·C·瓦德羅 申請(qǐng)人:羅伯特·A·利費(fèi)恩, 史戴芬·C·瓦德羅