專利名稱：(1s,4r)－或(1r,4s)－4－(2－氨基－6－氯－9h－嘌呤－9－基)－2－環(huán)戊烯－1－甲醇 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用式I或II表示的(1S，4R)-或(1R，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環(huán)戊烯-1-甲醇或其鹽的新穎制備方法
以及用通式XVI或XVII表示的光學(xué)活性化合物的新穎制備方法。
(1S，4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環(huán)戊烯-1-甲醇是制備2-氨基嘌呤核苷的重要中間體，例如制備(1S，4R)-4-(2-氨基-6-環(huán)丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-環(huán)戊烯-1-甲醇(WO/95/21 161)或制備1592U89(J.Org.Chem.，1996，61，4192-4193；J.Org.Chem.，1996，61，7963-7966)。
WO/95/21 161中描述了一種由(1S，4R)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-甲醇制備(1S，4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環(huán)戊烯-1-甲醇的方法。該方法的缺點(diǎn)是前體(1S，4R)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-甲醇只能通過被貴重的BOC保護(hù)基(叔丁氧羰基保護(hù)基)取代的(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮制得(J.Org.Chem.，1995，60，4602-4616)。
本發(fā)明的目的是提供(1S，4R)-或(1R，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環(huán)戊烯-1-甲醇或其鹽的簡(jiǎn)單、低成本和更經(jīng)濟(jì)的制備方法。
本發(fā)明的目的已由權(quán)利要求1所述的新穎方法達(dá)到。
本新穎方法的第一步是將用式III表示的(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮?；?，
產(chǎn)生用通式IV表示的(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物，
式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基。
C1-4烷基可被取代或未被取代。下文中，取代的C1-4烷基是指被鹵原子取代的C1-4烷基。鹵原子可用F、Cl、Br或I。C1-4烷基的實(shí)例是甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、叔丁基、異丙基、氯甲基、溴甲基、二氯甲基、二溴甲基。用作C1-4烷基的較好是甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基或氯甲基。
可以用作C1-4烷氧基的例如是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基或異丁氧基。優(yōu)選使用的C1-4烷氧基是叔丁氧基。
可以用作芳基的例如是苯基或芐基，較好是苯基。芐氧基或苯氧基例如可用作芳氧基。
前體(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮可按EP-A 0508352中揭示的方法制備。
酰化可用通式XI表示的羰基鹵化物(carbonyl halide)
或用通式XII表示的羧酸酐進(jìn)行，
式中R1具有上述的含義，X表示鹵原子。氟、氯、溴或碘可用作鹵原子。較好使用氯或氟。
羰基鹵化物的實(shí)例是乙酰氯、氯乙酰氯、丁酰氯、異丁酰氯、苯基乙酰氯、氯甲酸芐酯(Cbz-Cl)、丙酰氯、苯甲酰氯、氯甲酸烯丙酯或叔丁氧羰基氟。羧酸酐的實(shí)例是過二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)、丁酸酐、乙酸酐或丙酸酐。
所述的?；稍跊]有溶劑或加入非質(zhì)子傳遞溶劑的條件下進(jìn)行。
?；嗽诜琴|(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。合適的非質(zhì)子傳遞溶劑的實(shí)例是二異丙醚、吡啶、乙腈、二甲基甲酰胺、三乙胺、四氫呋喃、甲苯、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮或它們的混合物。
?；嗽?80-50℃，較好0-25℃的溫度下進(jìn)行。
在本新穎方法的第二步中，將用通式IV表示的(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物還原產(chǎn)生用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物，
式中R1具有上述的含義。
還原宜用堿金屬硼氫化物或堿土金屬硼氫化物、堿金屬鋁氫化物或堿土金屬鋁氫化物或Vitride(氫化二(2-甲氧基乙氧基鋁)鈉)進(jìn)行。氫化鋁鈉或氫化鋁鉀可用作堿金屬鋁氫化物。硼氫化鈉或鉀可用作堿金屬硼氫化物。硼氫化鈣可用作堿土金屬硼氫化物。氮化鋁例如可用作氮化物。
還原宜在質(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。可以使用的質(zhì)子傳遞溶劑是低級(jí)脂肪醇，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇、異丁醇或水，或這些醇與水的混合物。
還原宜在-40-40℃，較好為0-20℃的溫度下進(jìn)行。
本新穎方法的第三步用微生物、具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶或青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶將用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物轉(zhuǎn)化為用式VI或VII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯，
。這種生物轉(zhuǎn)化將?；?1S，4R)或(1R，4S)-氨基醇衍生物轉(zhuǎn)化成(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯(通式VI、VII)。
所有能將通式V表示的環(huán)戊烯衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物都適合于該生物轉(zhuǎn)化。這些微生物可用常規(guī)的微生物學(xué)技術(shù)從土壤樣品、污泥或廢水中分離。通過用常規(guī)方法在含用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物
式中R1具有上述的含義，· 作為唯一碳源和氮源· 作為唯一氮源和合適碳源或· 作為唯一碳源和合適氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些微生物而進(jìn)行分離。
用通式V表示的合適環(huán)戊烯衍生物的實(shí)例是N-乙酰-、N-丙酰-、N-異丁酰-、N-叔丁氧羰基-(N-BOC)、N-丁酰-或N-苯基乙酰-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯。
所述的微生物例如可將銨、硝酸鹽、氨基酸或脲繁殖基質(zhì)用作合適的氮源。所述的微生物例如可將糖、糖醇、C2-C4-羧酸或氨基酸繁殖基質(zhì)用作合適的碳源。葡萄糖之類的己糖或戊糖可用作糖。甘油例如可用作糖醇。乙酸或丙酸例如可用作C2-C4-羧酸。亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺例如可用作氨基酸。
可以使用的選擇基和培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員常用的培養(yǎng)基(如表1中所述的培養(yǎng)基)或完全培養(yǎng)基(含酵母提取液的培養(yǎng)基)(如營(yíng)養(yǎng)酵母湯(NYB)，較好使用表1中所述的酵母湯)。
在培養(yǎng)和選擇過程中，方便地誘導(dǎo)了微生物的活性酶。用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物可用作酶的誘導(dǎo)物。
培養(yǎng)和選擇一般在20-40℃，較好在30-38℃的溫度和在5.5-8，較好在6.8-7.8的pH值的條件下進(jìn)行。
該生物轉(zhuǎn)化宜用將環(huán)戊烯衍生物的(1R，4S)異構(gòu)體用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物進(jìn)行。
該生物轉(zhuǎn)化較好用產(chǎn)堿桿菌/博代特氏桿菌屬、紅球菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、土壤桿菌/根瘤菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬或戈登氏菌屬微生物進(jìn)行，特別是產(chǎn)堿桿菌/博代特氏桿菌屬FB 188(DSM11172)、紅串紅球菌CB 101(DSM10686)、節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10328)、紅球菌屬FB 387(DSM1 1291)、木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)、土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2、惡臭假單胞菌K32或戈登氏菌屬CB 100(DSM 10687)以及它們功能等同的變異體和突變體。按布達(dá)佩斯條約，微生物DSM 10686和10687于20.05.1996保藏在德國微生物保藏和細(xì)胞培養(yǎng)股份公司(Mascheroderweg 1b，D38124Braunschweig)，微生物DSM 10328和10329于06.11.1995保藏于該公司，微生物DSM 11291于08.10.1996保藏于該公司，微生物DSM 11172于20.09.1996保藏于該公司。
“功能等同的變異體和突變體”是指具有與原微生物基本上相同的性質(zhì)和功能的微生物。這種變異體和突變體例如可用紫外輻射偶然產(chǎn)生。
產(chǎn)堿桿菌/博代特氏桿菌屬FB 188(DSM 11172)分類說明細(xì)胞形狀 桿菌寬度，微米0.5-0.6長(zhǎng)度，微米1.0-2.5能動(dòng)性+鞭毛突出 周毛的革蘭氏反應(yīng)-被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny) +芽胞 -氧化酶+過氧化氫酶+ADH(醇脫氫酶) -來源于NO3的NO2-反硝化作用-脲酶 -明膠的水解-由下列化合物產(chǎn)生的酸(OF試驗(yàn))葡萄糖-果糖 -阿拉伯糖 -己二酸酯(鹽) +癸二酸酯(鹽) +檸檬酸酯(鹽) +蘋果酸酯(鹽) +甘露糖醇 -紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)的分類說明1.菌落的形態(tài)和顏色短分支菌絲，老化時(shí)，它分裂成桿菌(rods)和球菌，菌落閃光和部分融合，帶淡粉紅色的原色，RAL 1001；2.從肽聚糖中檢出的氨基酸內(nèi)消旋-二氨基庚二酸；3.霉菌酸紅球菌屬霉菌酸；測(cè)定霉菌酸的鏈長(zhǎng)(C32-C44)和將該數(shù)據(jù)與DSM霉菌酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)登記項(xiàng)比較，發(fā)現(xiàn)與紅串紅球菌菌株圖譜(pattern)有很大的相似性(相似性0.588)。
4.脂肪酸圖譜直鏈、飽和和不飽和脂肪酸和結(jié)核硬脂酸。
5.菌株的16SrDNA部分測(cè)序時(shí)，發(fā)現(xiàn)與紅串紅球菌特定區(qū)域的序列高度一致(100％)。
這種鑒定結(jié)果是明確的，因?yàn)槿N相互獨(dú)立的方法(霉菌酸、脂肪酸、16SrDNA)已確定該菌株是紅串紅球菌。
戈登氏菌屬sp.CB 100(DSM 10687)的分類說明1.菌落的形態(tài)和顏色短分支菌絲，老化時(shí)，它分裂成桿菌和球菌，菌落為淡橙黃色，(RAL 2008)；2.從肽聚糖中檢出的氨基酸內(nèi)消旋-二氨基庚二酸；3.甲基萘醌類圖譜MK-9(H2)100％；4.霉菌酸戈登氏菌屬霉菌酸；用高溫氣相色譜測(cè)定霉菌酸的鏈長(zhǎng)(C50-C60)。該圖譜相當(dāng)于在戈登氏菌屬樣本中發(fā)現(xiàn)的圖譜。
5.脂肪酸圖譜直鏈、飽和和不飽和脂肪酸和結(jié)核硬脂酸。
6.菌株的16S rDNA部分測(cè)序時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)與深紅戈登氏菌特定區(qū)域的序列較低的一致性(98.8％)。
根據(jù)這些可得的結(jié)果(甲基萘醌類圖譜、霉菌酸、脂肪酸、16S rDNA)，雖然可明確地將此分離物確定為戈登氏菌屬，但不能根據(jù)這些結(jié)果確定它是已知的戈登氏菌屬。因此，將菌株DSM10687假定為新的，未曾描述過的戈登氏菌屬物種。
木糖氧化產(chǎn)堿菌反硝化亞種HSZ17(DSM 10329)的分類說明該菌株的性質(zhì)細(xì)胞形狀桿菌寬度，微米 0.5-0.6長(zhǎng)度，微米 1.5-3.0能動(dòng)性 +鞭毛突出周毛的革蘭氏反應(yīng) -
被3％ KOH溶解+氨肽酶(Cerny)+芽胞 -氧化酶 +過氧化氫酶 +厭氧生長(zhǎng) -ADH(醇脫氫酶)+來源于NO3的NO2+反硝化作用 +脲酶 -明膠的水解 -Tween 80的水解 -由下列化合物產(chǎn)生的酸(OF試驗(yàn))葡萄糖需氧 -木糖80 -基質(zhì)利用葡萄糖 -果糖 -阿拉伯糖 -檸檬酸酯(鹽) +蘋果酸酯(鹽) +甘露糖醇 -節(jié)細(xì)菌屬HSZ5(DSM 10328)的分類說明表征鑒定 具有顯著桿菌-球菌生長(zhǎng)循環(huán)的革蘭氏陽性不規(guī)則桿菌；嚴(yán)格需氧；在葡萄糖中沒有形成酸或氣體。能動(dòng)性 -芽胞 -過氧化氫酶 +細(xì)胞壁中的內(nèi)消旋-二氨基庚二酸 無肽聚糖類型 A3α，L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala16SrDNA序列相似性 用滋養(yǎng)節(jié)桿菌，分枝節(jié)桿菌和氧化節(jié)桿菌對(duì)變異性最大的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)的最大值為98.2％土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30的分類說明細(xì)胞形狀 多型桿菌寬度(微米)0.6-1.0長(zhǎng)度(微米)1.5-3.0革蘭氏反應(yīng)-被3％KOH溶解 +氨肽酶+芽胞 -氧化酶+過氧化氫酶+能動(dòng)性+厭氧生長(zhǎng) -由硝酸鹽產(chǎn)生的亞硝酸鹽-反硝化作用-脲酶 +明膠的水解-從如下物質(zhì)中產(chǎn)生酸L-阿拉伯糖+半乳糖-松三糖-巖藻糖+阿糖醇-甘露糖醇 -赤蘚醇-石蕊汁的堿化 +酮乳糖-16S rDNA的部分測(cè)序揭示與土壤桿菌屬和根瘤菌屬的樣本具有較大的相似性，約為96％。明確地將其確定為這些屬內(nèi)物種是不可能的。單純桿菌K2的分類說明細(xì)胞形狀 桿菌寬度(微米) 0.8-1.0長(zhǎng)度(微米) 3.0-5.0芽胞 -橢圓體 -圓形體 -孢子囊 -過氧化氫酶 +厭氧生長(zhǎng) -VP反應(yīng) n.g.最大溫度正生長(zhǎng)時(shí)溫度，℃ 40負(fù)生長(zhǎng)時(shí)溫度，℃ 45在pH為5.7培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)-NaCl2％+5％-7％-10％ -溶菌酶培養(yǎng)基 +由下列物質(zhì)產(chǎn)生酸(ASS)D-葡萄糖 +L-阿拉伯糖 +D-木糖 -D-甘露糖醇 +D-果糖 +由果糖產(chǎn)生的氣體 -卵磷脂酶 -下列物質(zhì)的水解淀粉 +明膠 +酪蛋白 -Tween 80 +七葉苷-利用下列物質(zhì)檸檬酸鹽 +丙酸鹽-由硝酸鹽產(chǎn)生的亞硝酸鹽+吲哚 -苯丙氨酸脫氨基酶 -精氨酸脫羥基酶-對(duì)細(xì)胞脂肪酸的分析確定它是芽胞桿菌屬。16SrDNA部分測(cè)序表明與單純芽胞桿菌的相似性為100％。惡臭假單胞菌K32的分類說明細(xì)胞形狀 桿菌寬度(微米)0.8-0.9長(zhǎng)度(微米)1.5-4.0能動(dòng)性+鞭毛突出 極性＞1革蘭氏反應(yīng)-被3％KOH溶解 +氨肽酶(Cerny) +芽胞 -氧化酶+過氧化氫酶+厭氧生長(zhǎng) -色素?zé)晒庑缘? +膿青素-ADH +來源于硝酸鹽的亞硝酸鹽-反硝化-脲酶 -明膠的水解-
基質(zhì)利用己二酸酯(或鹽)-檸檬酸酯(或鹽)+蘋果酸酯(或鹽)+D-扁桃酸酯(或鹽) +苯基乙酸酯(或鹽) +D-酒石酸酯(或鹽) -D-葡萄糖 +海藻糖酶 -甘露糖醇 -苯甲酰甲酸酯(或鹽)-丙二醇+丁胺 +芐胺 +色胺 -乙酰胺+馬尿酸鹽(或酯)+細(xì)胞脂肪酸的分布型是惡臭假單胞菌屬特有的。
16S rDNA的部分測(cè)序表明與門多薩假單胞菌和產(chǎn)堿假單胞菌的相似性約為98％。與惡臭假單胞菌的相似性為97.4％。
紅球菌屬sp.FB 387(DSM 11291)的分類說明1.菌落的形態(tài)和顏色短分支菌絲，老化時(shí)，它分裂成桿菌(rods)和球菌，菌落無光澤，淡粉橙紅色RAL 2008；2.從肽聚糖中檢出的氨基酸內(nèi)消旋-二氨基庚二酸；3.霉菌酸紅球菌屬霉菌酸；測(cè)定霉菌酸的鏈長(zhǎng)(C32-C44)和將該數(shù)據(jù)與DSMZ霉菌酸數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)登記項(xiàng)比較表明與紅球菌屬紅菌株圖譜僅有很小的相似性(相似性0.019)。這個(gè)相關(guān)系數(shù)太小，不能用于物種鑒定。
4.脂肪酸圖譜直鏈、飽和和不飽和脂肪酸和結(jié)核硬脂酸。
該脂肪酸圖譜對(duì)于所有紅球菌屬樣本及其緊密相關(guān)物(如分支桿菌屬、諾卡氏菌屬和戈登氏菌屬)的判斷是有價(jià)值的。為了區(qū)分到物種水平，通過計(jì)入脂肪酸圖譜的定性和定量差別作了嘗試。用數(shù)值方法將紅球菌屬sp.FB 387的脂肪酸圖譜與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)登記項(xiàng)進(jìn)行比較。由于與上述的紅球菌屬物種只有小的相似性(0.063)，用這種方法無法確認(rèn)紅球菌屬sp.FB 387。
5.菌株的16S rDNA部分測(cè)序時(shí)，96-818由于相關(guān)性為97.9％而確認(rèn)為混濁紅球菌。這種順序一致性遠(yuǎn)低于分類時(shí)明確確定物種所需的99.5％。
根據(jù)所得結(jié)果，可以假定菌株紅球菌屬sp.FB 387是一種新的、未曾描述過的紅球菌屬物種。
在這些微生物的常規(guī)初始培養(yǎng)后，生物轉(zhuǎn)化可用休眠細(xì)胞(不再需要碳源和能源的非生長(zhǎng)細(xì)胞)或生長(zhǎng)細(xì)胞進(jìn)行。這種生物轉(zhuǎn)化較好用休眠細(xì)胞進(jìn)行。
適于這種生物轉(zhuǎn)化的具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶例如可用本領(lǐng)域中常用的破裂法從上述的微生物細(xì)胞中分離出來。為此例如可用超聲法或弗氏壓榨法。較好從紅串紅球菌CB101(DSM 10686)微生物中分離這些酶。
合適的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶可從許多微生物中得到，如細(xì)菌和放線菌綱；具體地可從如下微生物中得到大腸桿菌ATCC 9637、巨大芽胞桿菌、淡紫鏈霉菌ATCC 13664、諾卡氏菌屬sp.ATCC 13635、雷氏普羅威登斯菌ATCC 9918、粘性節(jié)細(xì)菌屬ATCC 15294、藤黃紅球菌ATCC 12975、產(chǎn)裼色鏈霉菌ATCC21289、無色桿菌屬ATCC 23584和玫瑰色微球菌ATCC 416。特別地使用市售的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，如來源于大腸桿菌(Boehringer Mannheim)或巨大芽胞桿菌的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶EC 3.5.1.11。
在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用固定化的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶。
所述的生物轉(zhuǎn)化可在本領(lǐng)域中常用的培養(yǎng)基中進(jìn)行，如低摩爾濃度的磷酸鹽、檸檬酸鹽或Hepes緩沖液、水、營(yíng)養(yǎng)酵母汁之類或表中所示的完全培養(yǎng)基。該生物轉(zhuǎn)化較好在表1所示的培養(yǎng)基或低摩爾濃度磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。
該生物轉(zhuǎn)化宜在一次或連續(xù)加入環(huán)戊烯衍生物(式V)使其濃度不超過10％重量，較好不超過2％重量的條件下進(jìn)行。
生物轉(zhuǎn)化時(shí)的pH可以為5-9，較好為6-8。該生物轉(zhuǎn)化時(shí)的溫度宜為20-40℃，較好為25-30℃。
在第四步中，用式VIII表示的N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺
將環(huán)戊烯衍生物(式VI或VII)轉(zhuǎn)化為用通式IX或X表示的(1S，4R)-或(1R，4S)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-環(huán)戊烯1-甲醇。
N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺可按WO95/21161中揭示的方法制備。
第四步的反應(yīng)宜在堿的存在下進(jìn)行?？梢允褂糜袡C(jī)堿或無機(jī)堿。三烷基胺可用作有機(jī)堿。所用三烷基胺的實(shí)例是三乙胺、三丁胺、三芐胺、吡啶或N-甲基吡咯烷酮。可用無機(jī)堿的實(shí)例是堿金屬碳酸鹽或堿土金屬碳酸鹽、或堿金屬碳酸氫鹽或堿土金屬碳酸氫鹽，如碳酸鉀和碳酸氫鈉。
第四步中的反應(yīng)宜在質(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。低級(jí)烷基醇可用作質(zhì)子傳遞溶劑，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或異丁醇。
進(jìn)行第四步反應(yīng)的溫度宜為0-150℃，較好為20-100℃。
在第五步中，按WO 95/21161中揭示的已知方法將(1R，4S)-或(1S，4R)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-環(huán)戊烯1-甲醇(式IX、X)環(huán)化，產(chǎn)生用式I或II表示的最終產(chǎn)物。
環(huán)化一般在濃的含水酸(aqueous acid)存在下溶解在原甲酸三烷基酯中進(jìn)行?？梢允褂玫脑姿崛榛ナ窃姿崛柞セ蛟姿崛阴ァ＠琨}酸、硫酸或甲磺酸可用作含水酸。
本發(fā)明還涉及用通式XVI或XVII表示的光學(xué)活性化合物的制備方法，
式中R1具有上述的含義。這些化合物可通過用上述的微生物、N-酰氨基醇水解酶或青霉素G?；D(zhuǎn)移酶將用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物
式中R1具有上述的含義，轉(zhuǎn)化成用式VI或VII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯，
后者被酰化成用式XVI或XVII表示的化合物。
微生物轉(zhuǎn)化和酰化都在與上述相同的條件下進(jìn)行。
酰化時(shí)的溫度宜為20-100℃，較好為0-80℃。
用本方法制備的光學(xué)活性化合物的實(shí)例是對(duì)映體過量為98％的(1R，4S)-N-叔丁氧羰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯、對(duì)映體過量為98％的(1R，4S)-N-乙?；?1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯、對(duì)映體過量為98％的(1R，4S)-N-丁?；?1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯以及光學(xué)活性的(1S，4R)-N-乙酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯和光學(xué)活性的(1S，4R)-N-丁?；?1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯。
在這些化合物中，光學(xué)活性的(1R，4S)-N-丁?；?1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯是文獻(xiàn)中還未報(bào)道過的化合物。因此，本發(fā)明也涉及對(duì)映體過量大于0％，較好至少為80％、90％或95％，特別至少為98％的光學(xué)活性N-丁?；?1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯。這些光學(xué)活性的化合物可用本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的方法外消旋化，產(chǎn)生文獻(xiàn)中還未報(bào)道過的外消旋-N-丁酰基-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯。
用通式XIII表示的外消旋或光學(xué)活性的4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯衍生物的制備方法如下
式中R1具有上述的含義，在第一步中用通式XI表示的羰基鹵化物
式中R1和X具有上述的含義，將用通式XIV表示的環(huán)戊烯-4-羧酸外消旋體或其光學(xué)活性異構(gòu)體之一
?；纬捎猛ㄊ絏V表示的外消旋或光學(xué)活性的環(huán)戊烯-4-羧酸衍生物，
第二步中將后者還原產(chǎn)生用通式XIII表示的所需產(chǎn)物。
光學(xué)活性的4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯衍生物(通式XIII)和光學(xué)活性的環(huán)戊烯-4-羧酸衍生物(通式XV)是指相應(yīng)的(1R，4S)或(1S，4R)異構(gòu)體。
本方法的第一步(?；?用通式XI表示的羰基鹵化物進(jìn)行?？梢允褂玫聂驶u化物與上述的相同。優(yōu)選使用叔丁氧羰基氟。
進(jìn)行第一步反應(yīng)的pH宜為8-14，較好為12-14，溫度宜為0-50℃，較好為15-25℃。
合適的溶劑是水與醚的混合物?？梢允褂玫拿咽嵌f烷、四氫呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚或乙二醇二乙醚。
本方法的第二步(還原)可用堿金屬鋁氫化物、硼烷/二C1-4烷基硫醚加成物或硼烷/四氫呋喃加成物進(jìn)行。氫化鋁鋰、氫化鋁鈉或氫化鋁鉀可用作堿金屬鋁氫化物。優(yōu)先使用氫化鋁鋰。硼烷/二甲硫、硼烷/二乙硫、硼烷/二丙硫或硼烷/二丁硫加成物可用作硼烷/二C1-4烷基硫醚。優(yōu)選使用硼烷/二甲硫加成物。
第二步中，宜將上述無水醚之一用作溶劑。
第二步反應(yīng)的溫度可為-50-5℃，較好-25至-10℃。
實(shí)施例實(shí)施例1(±)-2-乙?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮?dú)夥障聦?00克(±)-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(800毫升)和吡啶(161.26毫升)中。12℃時(shí)，滴加104.5克乙酰氯，歷時(shí)2小時(shí)。然后在室溫下將該混合物攪拌4.5小時(shí)。在此混合物中加入800毫升水，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次400毫升。合并的有機(jī)相用1N HCl(400毫升)、水(400毫升)、飽和氯化鈉(400毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，蒸發(fā)至干。將殘余物溶解在二氯甲烷中，用硅膠過濾。將濾液濃縮，蒸餾純化產(chǎn)物。得到107.76克透明液體產(chǎn)物。產(chǎn)率為71％。
沸點(diǎn)(0.07乇)51℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400HHz 2.25(AB syst.，2H)2.8(s，3H)3.42(m，1H)5.30(m，1H)6.89(m，1H)6.92(m，1H)實(shí)施例2(±)-2-丁?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮?dú)夥障聦?00.3克(±)-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(720毫升)和吡啶(142毫升)中。12℃時(shí)，滴加141.8克丁酰氯，歷時(shí)1小時(shí)。然后在室溫下將該混合物攪拌3小時(shí)。在此混合物中加入720毫升水并分相，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次300毫升。合并的有機(jī)相用1N HCl(350毫升)、飽和氯化鈉(500毫升)和水(400毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，完全蒸發(fā)。蒸餾純化產(chǎn)物。得到107.76克透明液體產(chǎn)物。產(chǎn)率為85％。
沸點(diǎn)(0.05乇)70℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400HHz 0.98(t，J＝8.5Hz，3H)1.58-1.65(2H)2.23(AB syst.，2H)2.82-2.90(23H)3.42(m，1H)5.30(m，1H)6.62(m，1H)6.90(m，1H)實(shí)施例3(±)-2-苯乙酰基-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮?dú)夥障聦?3.4克(±)-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(240毫升)和吡啶(48.3毫升)中。12℃時(shí)，滴加68.6克苯乙酰氯，歷時(shí)30分鐘。然后在室溫下將該混合物攪拌3.5小時(shí)。在此混合物中加入240毫升水，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次150毫升。合并的有機(jī)相用1N HCl(150毫升)、飽和氯化鈉(150毫升)和水(150毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，完全蒸發(fā)。粗產(chǎn)物用硅膠過濾(己烷∶乙酸乙酯＝1∶1)。得到78.34克黃色油粗產(chǎn)物。
實(shí)施例4(±)-2-丙酰基-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮?dú)夥障聦?7克(±)-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(325毫升)和吡啶(41毫升)中。12℃時(shí)，滴加43.9克丙酰氯，歷時(shí)1小時(shí)。然后在室溫下將該混合物攪拌5小時(shí)。在此混合物中加入145毫升水，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次，每次115毫升。合并的有機(jī)相用1N HCl(140毫升)、飽和碳酸氫鈉(40毫升)和氯化鈉溶液(40毫升)洗滌，用硫酸鈉干燥，完全蒸發(fā)。蒸餾純化殘余物。得到55.8克標(biāo)題產(chǎn)物。放置時(shí)固化。產(chǎn)率為81.6％。
沸點(diǎn)(2.8毫巴)75-80℃熔點(diǎn)54-56℃1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400HHz0.95(t，3H)；2.10(quart.1H)；2.28(quart.1H)；2.64(m，2H)；3.42(s，1H)；5.16(s，1H)；6.78(m，1H)；6.96(m，1H).
實(shí)施例5(±)-2-異丁?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備在氮?dú)夥障聦?5.1克(±)-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(310毫升)和吡啶(39毫升)中。10℃時(shí)，滴加54.1克異丁酰氯，歷時(shí)1小時(shí)。然后在室溫下將該混合物攪拌5小時(shí)。在此混合物中加入140毫升水并分相，真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取四次，每次120毫升。合并的有機(jī)相用1N HCl(50毫升)、碳酸氫鈉飽和溶液(50毫升)和氯化鈉(50毫升)洗滌，用硫酸鎂干燥，完全蒸發(fā)。將殘余物放在已加入活性炭的正己烷(240毫升)中回流沸騰，濾去活性碳，將濾液冷卻到0℃，過濾標(biāo)題化合物。得到54.5克產(chǎn)物。產(chǎn)率為76％。
熔點(diǎn)41-42℃1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400HHz 0.92(d，3H)1.06(d，3H)2.10(m，1H)2.28(m，1H)3.40(m，2H)5.16(s，1H)6.78(m，1H)7.92(m，1H)實(shí)施例6(±)-2-氯乙?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制備10℃時(shí)，在氮?dú)夥障聦?0.1克(±)-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在二氯甲烷(10毫升)、吡啶(8.4毫升)和0.22克4-N，N-二甲氨基吡啶的混合物中。滴加13.5克氯乙酰氯，歷時(shí)1小時(shí)。將溫度升至44℃。然后在室溫下將該混合物再攪拌2小時(shí)。在此溶液中加入100毫升水。分相后，水相用100毫升二氯甲烷萃取。合并的有機(jī)相用硫酸鈉干燥，完全蒸發(fā)。在1克活性炭存在下將殘余物放在100毫升異丙醚中回流沸騰10分鐘。熱過濾后，將濾液冷卻至室溫，過濾出固體并加以干燥。得到10.35克標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)率為60％。
熔點(diǎn)為86-88℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400HHz 2.28(d，1H)；2.40(d，1H)；3.48(s，1H)；4.56(d，2H)；5.30(s，1H)；6.70(d，1H)；6.94(m，1H).
實(shí)施例7(±)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的制備氮?dú)夥障聦?9.56克(±)-2-乙酰基-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450毫升)中，冷卻到-10℃。分批加入19.8克硼氫化鈉，歷時(shí)45分鐘。
在0℃攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后用濃硫酸將pH調(diào)節(jié)到1.8。在此混合物中加入乙酸乙酯(200毫升)，過濾掉固體。然后完全蒸發(fā)。將殘余物放在水中，用二氯甲烷洗滌，并蒸發(fā)。粗產(chǎn)物用硅膠過濾提純。得到51.83克白色固體產(chǎn)物。按所用的(±)-2-乙?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮計(jì)，產(chǎn)率為64％。1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.18(m，1H)；1.78(s，3H)；2.29(m，1H)；2.66(m，1H)；3.25(s，2H)；4.58(s，1H)；4.72(m，1H)；5.61(d，1H)；5.85(d，1H)；7.83(d，1H).
實(shí)施例8(±)-1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的制備氮?dú)夥障聦?3.87克(±)-2-丁酰基-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(400毫升)中，冷卻到-10℃。分批加入15.68克硼氫化鈉，歷時(shí)45分鐘。在0℃攪拌反應(yīng)3小時(shí)，然后用濃硫酸將pH調(diào)節(jié)到1.5。在此混合物中加入乙酸乙酯(200毫升)，過濾掉固體。然后完全蒸發(fā)。將殘余物放在水中，用二氯甲烷洗滌，并在真空下蒸發(fā)干燥。得到60.55克產(chǎn)物。按所用的(±)-2-丁?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮計(jì)，產(chǎn)率為80％。熔點(diǎn)71-72℃1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400MHz 0.98(t，J＝8.5Hz，3H)；1.40-1.50(1H)；1.58-1.68(2H)；2.10-2.18(2H)；
2.42-2.55(1H)；2.85(m，1H)；3.62(AB syst.，2H)；4.98(m，1H)；5.78-5.82(2H)；6.38(m，1H).
實(shí)施例9(±)-1-苯乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的制備氮?dú)夥障聦?7克粗的(±)-2-苯乙?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450毫升)中，冷卻到-10℃。分批加入13.2克硼氫化鈉，歷時(shí)1小時(shí)。室溫下攪拌反應(yīng)3.5小時(shí)，然后用濃硫酸將pH調(diào)節(jié)到1.8。該混合物用硅膠過濾法純化(己烷∶乙酸乙酯＝2∶8)。用乙酸乙酯重結(jié)晶后，得到15.89克白色固體。按所用的(±)-2-苯乙酰基-2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮計(jì)，產(chǎn)率為80％。
1H-NMR(CDCl3)δ[ppm]400MHz 1.28-1.35(1H)；1.40(m，1H)；2.38-2.45(1H)；2.79(m，1H)；3.50(AB syst.，2H)；3.52(s，3H)；4.98(m，1H)；5.75(m，2H)；5.98(m，1H)；7.20-7.38(5H).
實(shí)施例10(±)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的制備(BOC＝叔丁氧羰基)室溫時(shí)，在氮?dú)夥障聦?5克粗的(±)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽(按J.Org.Chem.1981，46，3268中所述的方法制備)溶解在150毫升水和150毫升二噁烷的混合物中。用1N NaOH將該溶液的pH調(diào)節(jié)到14，然后加入叔丁氧羰基氟(BOC-F，20％過量)的乙醚溶液，讓該混合物在室溫下攪拌3小時(shí)(BOC-F按Synthesis 1975，599中所述的方法制備)。用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)到2。蒸餾掉有機(jī)溶劑后，在殘余物中加入50毫升水，用乙酸乙酯對(duì)該混合物萃取3次，每次100毫升。將合并的有機(jī)相完全蒸發(fā)。殘余物放在100毫升二異丙醚和80毫升正己烷的混合物中結(jié)晶。得到11.95克標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)率為56％。熔點(diǎn)68-70℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.18(m，1H)；1.38(s，9H)；2.26(m，1H)；2.65(m，1H)；3.33(t，2H)；4.45(m，1H)；4.55(t，1H)；5.62(m，1H)；5.79(m，1H)；6.73(d，1H).
實(shí)施例11(±)-1-丙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的制備氮?dú)夥障聦?6.6克(±)-2-丙?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(140毫升)和2-丁醇(66毫升)中，冷卻到-5℃。分批加入3克硼氫化鈉，歷時(shí)2小時(shí)。在10℃將此混合物攪拌2.5小時(shí)，然后用濃鹽酸和水的混合物(1∶1)將pH調(diào)節(jié)到2.2。將此溶液蒸發(fā)至40克，用2N NaOH將pH調(diào)節(jié)至6.2。該混合物用二氯甲烷萃5次，每次50毫升。將合并的有機(jī)相完全蒸發(fā)，殘余物放在甲苯(150毫升)中重結(jié)晶。得到11.1克標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)率為65％。
熔點(diǎn)67-68℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 0.96(t，3H)；1.16(quint.，1H)；2.04(quart.，2H)；2.26(m，1H)；2.66(m，1H)；3.34(m，2H)；
4.58(t，1H)；4.72(m，1H)；5.61(m，1H)；5.84(m，1H)；7.72(d，1H).
實(shí)施例12(±)-1-異丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的制備氮?dú)夥障聦?克(±)-2-異丁?；?2-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(32毫升)和2-丁醇(84毫升)中，冷卻到0℃。分批加入1.37克硼氫化鈉，歷時(shí)3.5小時(shí)。在20℃將此混合物再攪拌3小時(shí)，然后用濃鹽酸和水的混合物(1∶1)將pH調(diào)節(jié)到2.5，然后用2N NaOH中和。將此溶液蒸發(fā)至40克。殘余物用二氯甲烷萃3次，每次80毫升。將合并的有機(jī)相完全蒸發(fā)，將產(chǎn)生的固體放在甲苯(25毫升)中結(jié)晶。得到6.8克標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)率為73.6％。
熔點(diǎn) 80-81℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 0.98(d，3H)；1.16(quint.，1H)；2.30(m，2H)；2.68(m，1H)；3.32(t，2H)；4.58(t，1H)；4.70(m，1H)；5.61(m，1H)；5.82(m，1H)；7.68(d，1H).
實(shí)施例13用青霉素G?；D(zhuǎn)移酶制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯來源于大腸桿菌的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶EC 3.5.1.11(Boehringer Mannheim)165U(單位)/克或來源于巨大芽胞桿菌的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶3.5.1.11被用于生物轉(zhuǎn)化。
為此，在37℃用1％重量非外消旋的1-苯基乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯和400毫克合適的青霉素G?；D(zhuǎn)移酶在50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH5-9，4毫升)中溫育。
在一定的時(shí)間間隔后取樣，用薄層色譜(硅膠60，丁醇∶水∶冰醋酸＝3∶1∶1；茚三酮檢測(cè))、氣相色譜(毛細(xì)管柱，HP-5，5％苯基甲基硅氧烷)或高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行分析。該酶高活性地除去苯基乙?；?，從而釋放出高達(dá)40％的相應(yīng)氨基醇。得到對(duì)映體過量為80％的游離氨基醇。
實(shí)施例14用微生物制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯14.1 37℃和搖動(dòng)下將來自Visp的ASA水處理廠的污泥培育在含0.5％重量1-乙酰、1-丙酰、1-異丁?；?-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的A+N培養(yǎng)基中(參見表1)。用薄層色譜跟蹤(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的生成。
用1％的富集物進(jìn)行1-3轉(zhuǎn)移，在固體培養(yǎng)基(表1中所示培養(yǎng)基中的平板計(jì)數(shù)瓊脂；20克/升)上進(jìn)行分離。用這種方法分離微生物產(chǎn)堿桿菌屬/博代特氏桿菌屬FB 188(DSM 1172)、紅球菌屬erythropolis CB 101(DSM 10686)、戈登氏菌屬sp.CB 100(DSM 10687)和紅球菌屬sp.FB 387(DSM 11291)。
14.2將用這種方法分離得到的微生物培養(yǎng)在在含0.5％重量1-乙酰、1-丙酰、1-異丁酰或1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的培養(yǎng)基中(參見表1)。在24-36小時(shí)內(nèi)它們生長(zhǎng)到光學(xué)密度(OD)為2-3。將用這種方法獲得的細(xì)胞在后指數(shù)生長(zhǎng)期中收集，并用10mM磷酸鹽緩沖溶液洗滌。
在含1％重量1-乙酰、1-異丁?；?-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的50mM磷酸鹽緩沖溶液中(pH4.5-9)進(jìn)行隨后的生物轉(zhuǎn)化。用薄層色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，50％的底物被水解成(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯。高壓液相色譜分析揭示的對(duì)映體過量為80-93％。
當(dāng)1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯用作底物時(shí)，并在A+N培養(yǎng)基上進(jìn)行培育時(shí)，菌株DSM 10686的生物轉(zhuǎn)化速率為0.14(g/l/h/OD)，當(dāng)在含1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的NYB(酵母營(yíng)養(yǎng)汁)培養(yǎng)基上進(jìn)行培育時(shí)，其生物轉(zhuǎn)化速率為0.03(g/l/h/OD)。
當(dāng)在底物(1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯)濃度為200mM的條件下用菌株DSM 10687進(jìn)行相同的轉(zhuǎn)化時(shí)，生物轉(zhuǎn)化速率為0.161(g/l/h/OD).
表1A+N培養(yǎng)基
MgCl20.4克/升CaCl20.014克/升FeCl30.8毫克/升Na2SO40.1克/升KH2PO41克/升Na2HPO42.5克/升NaCl 3克/升維生素溶液 1毫升/升微量元素溶液 1毫升/升pH7.514.3 30℃時(shí)，在6升發(fā)酵桶中的將乙酸銨(3克/升)用作碳源和氮源的最低培養(yǎng)基(參見表2)上把紅串紅球菌DSM 10686培養(yǎng)到OD650＞25的細(xì)胞密度。在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，連續(xù)加入50％乙酸，作為附加碳源。然后為了誘導(dǎo)酶活性，加入60克(+/-)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯，繼續(xù)培養(yǎng)幾小時(shí)。最后再加入40克(+/-)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯，然后再培養(yǎng)10小時(shí)。生物轉(zhuǎn)化過程用線上高壓液相色譜跟蹤。當(dāng)按所用的外消旋底物計(jì)算分析產(chǎn)率為40％，對(duì)映體過量達(dá)85％時(shí)，加入酸使發(fā)酵停止。
表2培養(yǎng)基組成組分 濃度酵母萃取物 0.5克/升胨M66 0.5克/升KH2PO44.0克/升Na2HPO42H2O 0.5克/升K2SO42.0克/升乙酸銨 3.0克/升CaCl20.2克/升MgCl2·6H2O 1.0克/升微量元素溶液 1.5毫升/升(見下)PPG(聚丙二醇) 0.1克/升微量元素溶液KOH15.1克/升EDTA·Na2·2H2O 100.0克/升ZnSO4·7H2O 9.0克/升MnCl2·4H2O 4.0克/升H3BO32.7克/升CoCl2·6H2O 1.8克/升CuCl2·2H2O 1.5克/升NiCl2·6H2O 0.18克/升Na2MoO4·2H2O 0.27克/升14.4按類似于實(shí)施例14.3的方法，在含或不含1-乙酰、1-丙酰、1-異丁酰或1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯(下文中縮寫為氨基醇)的培養(yǎng)基(表1)中的乙酸鈉上培養(yǎng)微生物節(jié)細(xì)菌屬sp.HSZ 5(DSM 10328)、紅球菌屬sp.FB 387(DSM11291)、木糖氧產(chǎn)堿桿菌反硝化亞種HSZ 17(DSM 10329)，土壤桿菌/根瘤菌屬HSZ30、單純桿菌K2和惡臭假單胞菌K32。
用沒有氨基醇存在下培養(yǎng)的指數(shù)細(xì)胞得到如下結(jié)果(高壓液相色譜分析)菌株 速度[mmol/OD.h] ee/轉(zhuǎn)化(％)HSZ5(DSM 10328) 0.05 88.7/16HSZ17(DSM10329) 0.005 95/23K32 0.05 54/1CB101(DSM 10686) 0.1 84/39培養(yǎng)和收集菌株K2和K17，并進(jìn)行60小時(shí)生物轉(zhuǎn)化。
菌株 速度[mmol/OD.h] ee/轉(zhuǎn)化K2 - 92/10HSZ30- 93/3.5收集各批的指數(shù)細(xì)胞(exponential cell)和靜態(tài)細(xì)胞(stationary cell)，并用作生物轉(zhuǎn)化的休眠細(xì)胞(quiescent cell)。根據(jù)薄層色譜分析，用氨基醇誘導(dǎo)或不用氨基醇誘導(dǎo)的細(xì)胞的初始速度沒有明顯的區(qū)別。
實(shí)施例15從紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)中提純N-乙酰氨基-醇水解酶按下述方法提純酶，直到SDS-PAGE(Pharmacia Phast凝膠，10-15％梯度)只有一個(gè)分子量為50 kD的蛋白帶為止。
紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)細(xì)胞用50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH6.2)洗滌，然后濃縮到光學(xué)密度OD650nm為190。加入苯基甲磺酰氟(PMSF)到最后濃度為1mM及DNA酶后，用弗氏壓榨機(jī)處理細(xì)胞，以獲得粗的提取液。離心產(chǎn)生蛋白濃度為4.8毫克毫升-1的不含細(xì)胞的提取液。
將960毫克無細(xì)胞提取液裝入一根HiLoad 26/10 Q-Sepharose離子交換色譜柱(Pharmacia)中。該色譜柱已用含1mM二硫蘇糖醇(DTT)的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.0)平衡。
該柱用相同的緩沖液洗滌后，蛋白質(zhì)用線性緩沖液梯度洗脫(linear buffergradient)(1500毫升；梯度含1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.0)-含1mM DDT和1M NaCl的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH7.0)。該酶在370-430mM NaCl間和pH為7.6處從柱中洗脫。收集活性部分，并濃縮到9毫升。蛋白含量為41毫克。
為進(jìn)一步提純，將該蛋白溶液裝在HiLoad 26/60 Superdex 75凝膠過濾色譜柱(Pharmacia)中。該柱已用含50mM NaCl和1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液平衡。合并活性部分，總的蛋白含量為10.9毫克。
將該蛋白溶液裝在Mono Q HR5/5柱(Pharmacia)中。該柱已用含1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.5)平衡。蛋白質(zhì)用含1mM DTT的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH 8.5)-含1mM DDT和1M NaCl的50mM三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.5)線性梯度(40毫升)洗脫。該酶在390-440mM NaCl間洗脫?；钚圆糠趾?.4毫克蛋白。
在最后的提純步驟中，使用用相同緩沖液平衡后的相同柱。所用的洗脫梯度是含0-500mM NaCl和pH為7.0-8.5的相同緩沖液。用這種方法可以分離430微克純酶。
從蛋白印跡直接確定酶的N-末端順序。得到如下20個(gè)氨基酸的順序Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn。
這種順序與已知的蛋白沒有同源性。
實(shí)施例16酶的表征用純化的酶和已用Sephadex G-25柱(PD-10，Pharmacia)脫鹽的無細(xì)胞提取液進(jìn)行酶特性表征。
無細(xì)胞提取液中蛋白濃度為7.3毫克毫升-1，純化酶中的蛋白濃度為135微克毫升-1。在無細(xì)胞提取液中不加入PMSF。
16.1Km測(cè)定在無細(xì)胞提取液中進(jìn)行Km測(cè)定。底物1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯在pH為7.0和溫度為30℃的條件下的反應(yīng)Km為22.5mM。
16.2最佳pH值在如下緩沖溶液中，用純化的酶和無細(xì)胞提取液在pH為6.2-9.0的范圍內(nèi)測(cè)定1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯(25mM)水解時(shí)的最佳pH值。
三羥甲基氨基甲烷緩沖液100mM pH9.0；8.5；8.0；7.5；7.0檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液100mM pH7.0；6.55；6.2活性測(cè)量進(jìn)行24小時(shí)。
制備1R，4S和1S，4R對(duì)映體的反應(yīng)的最佳pH值為pH7.0-7.5。
無細(xì)胞提取液活性的最佳pH值為pH7.0。然而在pH為6.0至7.0之間，選擇性更好。


圖1表示從紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)提取的N-乙酰氨基醇水解酶(無細(xì)胞的提取液)的活性與pH的關(guān)系。實(shí)施例16.2所示的反應(yīng)最佳溫度為25-30℃。
圖2表示從紅串紅球菌CB 101(DSM 10686)提取的N-乙酰氨基醇水解酶(無細(xì)胞的提取液)的活性與溫度的關(guān)系。
16.4用SDS-PAGE測(cè)得的分子量為50kD。
16.5將如下底物水解1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯、1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯、1-丙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯、1-異丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯。
實(shí)施例17制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽將374.1克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯溶液(按與實(shí)施例14相似的方法制備)蒸發(fā)至123.7克。用30％強(qiáng)度的NaOH將含60.2毫摩爾上述化合物(高壓液相色譜)的溶液從pH2調(diào)節(jié)到pH11.7。然后用異丁醇萃取三次，每次70毫升。用氯化氫氣體將合并的異丁醇萃取液調(diào)節(jié)到pH為1，濃縮到65克，過濾(除去固體雜質(zhì))。20℃時(shí)，在激烈攪拌的濾液中滴加60毫升丙酮。在混濁的混合物中加入標(biāo)題化合物的晶種，在5℃攪拌1小時(shí)。過濾和干燥后得到5.2克產(chǎn)物，產(chǎn)率為58％。
熔點(diǎn)125-127℃對(duì)映體過量為98％(校準(zhǔn)的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400Mhz 1.44(m，1H)2.35(m，1H)；2.83(m，1H)p3.42(m，2H)；4.10(s，1H)；4.80(d，1H)；5.80(d，1H)；6.06(d，1H)；8.13(s，3H).
實(shí)施例18制備(1R，4S)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯用30％強(qiáng)度的NaOH將75克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯(按與實(shí)施例14相似的方法制備；44.6毫摩爾化合物)溶液調(diào)節(jié)至pH為8，加入6克碳酸氫鈉。將混合物加熱至52℃。激烈攪拌下，加入60毫升二異丙醚，然后在2小時(shí)內(nèi)滴加11.12克叔丁氧羰基酸酐在18.2毫升二異丙醚中的溶液。用硅藻土(Celite)過濾該混合物，然后分相。水相用65毫升二異丙醚萃取。合并的有機(jī)相用45毫升水洗滌，然后蒸發(fā)至37.5克，加熱至50℃。在該溶液中滴加31毫升正己烷。然后慢慢冷卻到0℃(2小時(shí))，過濾出標(biāo)題產(chǎn)物，用12毫升正己烷/二異丙醚(1/1)洗滌，并干燥。得到6.75克產(chǎn)物。產(chǎn)率為71％。
熔點(diǎn)70-71℃對(duì)映體過量為98％(校準(zhǔn)的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400Mhz 1.18(m，1H)；1.27(s，9H)；2.28(m，1H)；2.63(m，1H)；
3.33(q，2H)；4.43(m，1H)；4.56(t，1H)；5.62(m，1H)；5.78(m，1H)；6.72(d，3H).
實(shí)施例19制備(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽將87.8克(1R，4S)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯溶解在270毫升2N鹽酸和1340毫升甲醇中。將此混合物加熱回流4.5小時(shí)。蒸餾掉甲醇后，將殘余物溶解在800毫升水中。該水溶液用乙酸乙酯萃取二次，每次340毫升。完全蒸發(fā)水相(50℃/60毫巴)。50℃時(shí)將固體真空干燥，將其懸浮在150毫升乙醚中，過濾，并用50毫升乙醚洗滌二次。干燥后產(chǎn)生標(biāo)題產(chǎn)物，產(chǎn)率為95％(58.4克)。
產(chǎn)物的物理數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)與實(shí)施例17中相同。
實(shí)施例20制備(1R，4S)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯將25克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽溶解在182毫升乙酸酐中，0℃時(shí)，加入18.25克三乙胺在60毫升乙酸酐中的溶液。80℃時(shí)，將此混合物攪拌3小時(shí)，然后冷卻至室溫。過濾掉三乙胺鹽酸鹽，用120毫升正己烷洗滌。將濾液蒸發(fā)。殘余物與300毫升甲苯混合，加入5.2克活性炭和13硅藻土后，在室溫下攪拌20分鐘。過濾和洗滌濾餅后(3×40毫升)甲苯，將溶劑完全蒸發(fā)掉。殘余物與180毫升甲醇和15.5克碳酸鉀混合，在室溫下攪拌10小時(shí)。過濾懸浮液，并蒸發(fā)濾液。將殘余物懸浮在750毫升乙酸異丙酯中，加入0.5克活性炭后加熱回流1.5小時(shí)。過濾掉活性炭后(70-80℃)，將濾液在0℃冷卻過夜。過濾出標(biāo)題化合物，用80毫升冷的乙酸異丙酯洗滌，真空干燥。得到17.2克產(chǎn)物。產(chǎn)率為66％。
熔點(diǎn)77-80℃對(duì)映體過量為98％(校準(zhǔn)的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.15(m，1H)1.78(s，3H)；2.25(m，1H)；2.66(m，1H)；3.35(m，2H)；4.58(t，1H)；4.70(m，1H)；5.62(m，1H)；5.85(m，1H)；7.80(d，3H).
實(shí)施例21制備(1S，4R)-1-乙酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯用25克(1S，4R)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽原料按實(shí)施例18的方法可以制備標(biāo)題對(duì)映體(產(chǎn)率為68％)。產(chǎn)物的光譜數(shù)據(jù)和物理數(shù)據(jù)與實(shí)施例20相同。
實(shí)施例22制備(1R，4S)-1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯將34.7克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽和2克4-N，N-二甲氨基吡啶溶解在600毫升二氯甲烷中。將溶液冷卻至0℃。然后滴加入52克三乙胺(5分鐘)。將此混合物再攪拌30分鐘。0℃時(shí)，將35.2克丁酰氯溶解在60毫升二氯甲烷中生成的溶液滴加到該混合物中，歷時(shí)1小時(shí)。在0-20℃，將混合物再攪拌1.5小時(shí)，然后加入600毫升水。分相后，用600毫升二氯甲烷萃取水相。合并的有機(jī)相用10％強(qiáng)度氫氧化鈉洗三次，每次500毫升。然后將其完全蒸發(fā)。將干燥的固體溶解在120毫升甲醇中。將此溶液與5克碳酸鉀混合，在室溫下再攪拌2小時(shí)。過濾掉無機(jī)鹽，用20毫升甲醇洗滌。濾液用2N鹽酸中和。過濾懸浮液，濾餅用20毫升甲醇洗滌。將濾液完全蒸發(fā)。將固體殘余物干燥，并放在150毫升甲苯中結(jié)晶。得到28.5克標(biāo)題化合物。產(chǎn)率為67％。
熔點(diǎn)71-72℃對(duì)映體過量為98％(校準(zhǔn)的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 0.85(t，3H)；1.15(m，1H)；1.50(q，2H)；2.03(d，2H)；2.28(m，1H)；2.67(m，1H)；3.35(d，2H)；4.62(s，1H)；4.76(m，1H)；5.63(m，1H)；5.85(m，1H)；7.77(d，1H).
實(shí)施例23制備(1S，4R)-1-丁酰氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯用34.7克(1S，4R)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽原料按實(shí)施例20的方法可以制備標(biāo)題對(duì)映體(產(chǎn)率為63％)。產(chǎn)物的光譜數(shù)據(jù)和物理數(shù)據(jù)與實(shí)施例22相同。
實(shí)施例24制備(1R，4S)-1-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)氨基]-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯在40毫升異丁醇中將2.07克N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺加熱到80℃(白色懸浮液)。在此混合物中加入1.97克(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯鹽酸鹽、3.8克三乙胺和15毫升異丁醇的溶液。將此混合物在80℃再攪拌13小時(shí)。20℃時(shí)在此透明溶液中加入10毫升1N氫氧化鈉，然后蒸發(fā)至干。對(duì)殘余物進(jìn)行閃蒸色譜(硅膠60柱、長(zhǎng)度8厘米、直徑為6.5厘米、洗脫劑為乙酸乙酯/甲醇95/5)。蒸發(fā)掉洗脫劑和干燥殘余物后，得到2.1克標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)率為74％。
熔點(diǎn)174-176℃對(duì)映體過量為98％(校準(zhǔn)的手性高壓液相色譜柱)1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.37(m，1H)；2.35(m，1H)；2.73(m，1H)；3.38(t，2H)；4.68(m，1H)；5.08(m，1H)；5.70(d，1H)；5.85(d，1H)；6.40；6.55和6.65(s，dd，共3H)；7.78和8.10(d和s，共1H)；8.55和8.95(d和s，共1H).
實(shí)施例25制備(1R，4S)-1-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)氨基]-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯將145.2毫升(1R，4S)-1-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯的溶液(按與實(shí)施例14相似的方法制備)濃縮到25.5毫升，用硅藻土過濾。濾餅用7.5毫升水洗滌。用濃鹽酸將含17.7毫摩爾上述的化合物(HPLC)的濾液的pH由6.6調(diào)節(jié)到1，然后用異丁醇萃取三次，每次20毫升。丟棄有機(jī)相。用30％強(qiáng)度的氫氧化鈉將水相的pH調(diào)節(jié)到12，用異丁醇萃取3次，每次10毫升。將合并的有機(jī)相蒸發(fā)至15毫升，加入2.53克三乙胺。按實(shí)施例24中的方法在此混合物中加入2.07克N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺在40毫升乙醇中的溶液。將此混合物在80℃攪拌16小時(shí)。按實(shí)施例22的方法進(jìn)行后處理，得到2.4克標(biāo)題產(chǎn)物。產(chǎn)率為85％。
產(chǎn)物的物理和光譜數(shù)據(jù)與實(shí)施例24相同。
實(shí)施例26制備(±)-1-BOC-氨基-2-環(huán)戊烯-4-羧酸在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下，室溫時(shí)將16.4克粗的(±)-1-氨基-2-環(huán)戊烯-4-羧酸鹽酸鹽(按J.Org.Chem.1981，46，3268中所述的方法制備)溶解在80毫升水和80毫升二噁烷的混合物中。用1N氫氧化鈉將此混合物的pH調(diào)節(jié)到14，然后加入叔丁氧羰基氟(BOC-F，20％過量)的乙醚溶液(BOC-F按Synthesis 1975，599中所述的方法制備)。室溫下將此混合物再攪拌5小時(shí)。用濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至2。蒸餾掉有機(jī)溶劑后，在殘余物中加入50毫升水。該混合物用乙酸乙酯萃取三次，每次100毫升。將有機(jī)相蒸發(fā)到50毫升，用25毫升甲苯稀釋。冷卻(0-10℃)后，過濾標(biāo)題產(chǎn)物，并加以干燥。得到14.3克產(chǎn)物。產(chǎn)率為63％。
熔點(diǎn)126-127℃1H-NMR(DMSO-d6)δ[ppm]400MHz 1.14(s，9H)；1.70(m，1H)；2.40(m，1H)；3.40(m，1H)；4.47(m，1H)；5.70(t，1H)；4.87(t，1H)；6.88(d，1H)；12.30(d，1H).
實(shí)施例27由(±)-1-BOC-氨基-2-環(huán)戊烯-4-羧酸制備(±)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯將250毫升四氫呋喃和10.02克(0.164摩爾)LiAlH4加入一個(gè)500毫升攪拌裝置中，在-10℃時(shí)，滴加30.0克(0.132摩爾)(±)-1-BOC-氨基-2-環(huán)戊烯-4-羧酸在75毫升四氫呋喃中的溶液，歷時(shí)1小時(shí)。然后加入10克水，10克15％強(qiáng)度氫氧化鈉溶液和20克水，再進(jìn)行過濾。殘余物用叔丁基甲醚洗兩次，每次100毫升，將合并的有機(jī)相蒸發(fā)至干。加入80毫升己烷和實(shí)施例10化合物的晶種后，分離出標(biāo)題化合物結(jié)晶固體。產(chǎn)率為15.84克(56％)。物理數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)與實(shí)施例10相同。
實(shí)施例28由(1R，4S)-1-BOC-氨基-2-環(huán)戊烯-4-羧酸制備(1R，4S)-1-BOC-氨基-4-羥甲基-2-環(huán)戊烯將80毫升四氫呋喃和11.38克(50.07毫摩爾)(1R，4S)-1-BOC-氨基-2-環(huán)戊烯-4-羧酸(按TetrahedronAsymmetry 1993，4，1117中所述的方法制備)加入500毫升攪拌裝置，在-15℃時(shí)，滴加5毫升硼烷/二甲硫加成物，歷時(shí)1小時(shí)。然后將此混合物在這溫度下攪拌3小時(shí)。加入4克氫氧化鈉溶解在60毫升水中生成的溶液，溫?zé)嶂潦覝?。用甲苯萃取，用硅膠過濾并隨后在乙酸乙酯/正己烷1∶1中結(jié)晶產(chǎn)生5.4克標(biāo)題產(chǎn)物白色結(jié)晶固體，相當(dāng)于產(chǎn)率57％。物理數(shù)據(jù)和光譜數(shù)據(jù)與實(shí)施例10中相同。對(duì)映體過量為99％(相同的手性高壓液相色譜柱)。
權(quán)利要求
1.用式I或II表示的(1S，4R)-或(1R，4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-環(huán)戊烯-1-甲醇或其鹽的制備方法，
其特征在于第一步中對(duì)用通式III表示的(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮進(jìn)行?；?，
產(chǎn)生用通式IV表示的(±)-2-氮雜-雙環(huán)[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物，
式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基，在第二步中將后者還原產(chǎn)生用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物，
式中R1具有上述的含義，在第三步中用能將通式V表示的環(huán)戊烯衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物、具有N-乙酰氨基醇水解酶活性的酶或青霉素G?；D(zhuǎn)移酶將后者轉(zhuǎn)化成用式VI或VII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯，
在第四步中用式VIII表示的N-(2-氨基-4，6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺
將后者轉(zhuǎn)化成用式IX或X表示的(1S，4R)-或(1R，4S)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-環(huán)戊烯1-甲醇，
在第五步中用已知的方法將后者環(huán)化產(chǎn)生用式I或II表示的最終產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于第一步中的?；猛ㄊ絏I表示的羰基鹵
式中R1具有上述的含義，X表示鹵原子，或用通式XII表示的羧酸酐進(jìn)行
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于第一步的?；诜琴|(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。
4.如權(quán)利要求1-3中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第二步中的還原用堿金屬或堿土金屬硼氫化物、堿金屬或堿土金屬鋁氫化物或Vitride進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求1-4中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第二步中的還原在質(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1-5中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第三步中的反應(yīng)用紅球菌屬、戈登氏菌屬、節(jié)細(xì)菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、土壤桿菌/根瘤菌屬、芽胞桿菌屬、假單胞菌屬或產(chǎn)堿桿菌/博代特氏桿菌屬微生物進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求1-6中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第三步中的反應(yīng)用來源于巨大芽胞桿菌或大腸桿菌物種的微生物的青霉素G酰基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1-7中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第三步中的生物轉(zhuǎn)化在溫度為20-40℃和pH為5-9的條件下進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1-8中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第四步中的反應(yīng)在堿存在下進(jìn)行。
10.如權(quán)利要求1-9中至少一項(xiàng)所述的方法，其特征在于第四步中的反應(yīng)在質(zhì)子傳遞溶劑中進(jìn)行。
11.用通式XVI或XVII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯衍生物的對(duì)映體的制備方法，
式中R1具有上述的含義，其特征在于在第一步中用能將通式V表示的環(huán)戊烯衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物、具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶或青霉素G?；D(zhuǎn)移酶將用通式V表示的環(huán)戊烯衍生物
式中R1具有上述的含義，轉(zhuǎn)化成用式VI或VII表示的(1R，4S)-或(1S，4R)-1-氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯，
第二步中將后者酰化產(chǎn)生用通式XVII或XVII表示的化合物。
12.用式XVIII表示的(1R，4S)-1-丁酰氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯對(duì)映體，
其特征在于對(duì)映體過量大于0％，可用權(quán)利要求11所述的方法制得。
13.如權(quán)利要求12所述的對(duì)映體，其特征在于對(duì)映體過量至少為80％，可用權(quán)利要求11所述的方法制得。
14.如權(quán)利要求12所述的對(duì)映體，其特征在于對(duì)映體過量至少為90％，可用權(quán)利要求11所述的方法制得。
15.如權(quán)利要求12所述的對(duì)映體，其特征在于對(duì)映體過量至少為95％，可用權(quán)利要求11所述的方法制得。
16.如權(quán)利要求12所述的對(duì)映體，其特征在于對(duì)映體過量至少為98％，可用權(quán)利要求11所述的方法制得。
17.外消旋的1-丁酰氨基-4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯。
18.用通式XIII表示的外消旋或光學(xué)活性的4-(羥甲基)-2-環(huán)戊烯衍生物的制備方法，
式中R1具有上述的含義，其特征在于在第一步中用通式XI表示的羰基鹵化物
式中R1和X具有上述的含義，將用式XIV表示的環(huán)戊烯-4-羧酸外消旋體或其光學(xué)活性異構(gòu)體之一
?；纬捎猛ㄊ絏V表示的外消旋或光學(xué)活性的環(huán)戊烯-4-羧酸衍生物，
第二步中將后者還原產(chǎn)生用通式XIII表示的所需產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用通式Ⅰ或Ⅱ表示的(1S,4R)－或(1R,4S)－4－(2－氨基－6－氯－9H－嘌呤－9－基)－2－環(huán)戊烯－1－甲醇或其鹽的制備方法。
文檔編號(hào)C12R1/01GK1201794SQ9810886
公開日1998年12月16日 申請(qǐng)日期1998年5月13日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月13日
發(fā)明者C·貝爾內(nèi)格爾, E·M·烏爾班, O·M·伯奇, K·伯格多爾夫, F·布魯克斯, K·S·埃特, P·博薩德, W·布列登, L·迪克, J·戈登, C·奧穆爾丘, Y·格吉斯伯格 申請(qǐng)人:隆薩股份公司