專利名稱：一組抗菌肽衍生物及其應(yīng)用的制作方法
一組抗菌肽衍生物及其應(yīng)用本發(fā)明涉及抗菌肽衍生物，具體地說涉及一類有抗菌作用的蛙皮抗菌肽衍生物。抗菌肽(antimicrobial ρ印tides)是一類具有抗菌活性的天然小分子蛋白。自 瑞典科學(xué)家Boman等從蠶蛹身上分離得到第一個抗菌肽天蠶素(Cecropin)以來，人們又在 昆蟲、兩棲類、水產(chǎn)動物，以及包括人在內(nèi)的哺乳動物甚至植物及細菌等廣泛的生物譜中發(fā) 現(xiàn)了 1000余種抗菌肽。這種內(nèi)源性的抗菌肽經(jīng)誘導(dǎo)而合成，在機體抵抗病原入侵方面起著 重要的作用，是機體非特異性免疫的重要組成部分?？咕牡目剐宰V十分廣泛。大多數(shù)對細菌尤其對耐藥性細菌有較強的殺滅作用， 有些則對某些真菌、原生動物也有殺滅作用。近年研究還發(fā)現(xiàn)，某些抗菌肽還能抑制病毒的 復(fù)制，從而引起了人們更大的關(guān)注?？咕牡淖饔脵C理特殊，目前流行的觀點是首先，帶正 電荷的抗菌肽分子與帶負電荷的靶細胞膜相接觸，隨后通過靶細胞膜所產(chǎn)生的電動勢將形 成疏水面的抗菌肽二聚體注入細胞膜，最后多個二聚體或多聚體在一起形成跨膜的離子通 道，從而擾亂細胞膜的通透性及細胞能量狀態(tài)，導(dǎo)致細胞膜去極化，呼吸作用受到抑制以及 細胞ATP含量嚴重下降，最終使靶細胞死亡?？咕牡目共《咀饔脛t是通過與病毒外殼蛋 白結(jié)合而導(dǎo)致病毒失去生物活性。這一特殊作用機理使微生物不易對其產(chǎn)生抗性。蛙皮抗菌肽Magainin是一類天然的從蛀皮中提取的有抗菌作用而又得到廣泛研 究的抗菌肽。它具有易合成，成本低，溶血性低等特點。美國專利USP 5589364公開了如何利用基因工程技術(shù)制備天然蛙皮抗菌肽 Magainin II (23個氨墓酸)的方法。蛙皮抗菌肽Magainin II是天然蛙皮抗菌肽Magainin 的一種，其氨基酸序列如下Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-G Iy-Glu-Ile-Met-Asn-Ser-OH美國專利USP 6183992公開了利用基因工程技術(shù)制備蛙皮抗菌肽衍生物 MSI-78(22個氨基酸)的方法，MSI-78的氨基酸序列如下Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-L ys~IIe-Leu-Lys-Lys—NH2美國Harriet Μ. lamb等人在《Adis New Drug Profile》雜志上報導(dǎo)蛀皮抗菌肽 衍生物MSI-78應(yīng)用在治療外傷感染及糖尿病足等方面有明顯療效。本發(fā)明的目的是提供一類蛙皮抗菌肽衍生物，擴大了蛙皮抗菌肽衍生物的種類， 它們易于用固相化學(xué)刺備，尤其易于用基因工程技術(shù)制備，從而為降低生產(chǎn)成本提供了可 能。它們具有與天然蛙皮抗菌肽相同或者更強的抗菌作用。本發(fā)明的內(nèi)容涉及一類如下結(jié)構(gòu)的蛙皮抗菌肽衍生物及其適用于藥用的鹽Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-G ly-X-Ile-Met-Asn-Y-Ser-OH，其中X為選自Gal，Ala的氨基酸殘基，Y為選自Ile5Leu的 氨基酸。本發(fā)明中所述結(jié)構(gòu)的蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸是L型或者D型異構(gòu)體。本發(fā)明中所述如下結(jié)構(gòu)的蛙皮抗菌肽衍生物的制備方法，
Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-G ly-X-Ile-Met-Asn-Y-Ser-OH，其中X為選自Gal，Ala的氨基酸殘基，Y為選自Ile5Leu的
氨基酸。該制備方法是基因工程方法，其步驟包括按蛙皮抗菌肽衍生物的氨基酸序列合 成基因片段，基因片段連接，質(zhì)粒構(gòu)建，克隆，發(fā)酵，分離純化及凍干的產(chǎn)品。本發(fā)明中所述如下結(jié)構(gòu)的蛙皮抗菌肽衍生物的制備方法，Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-G ly-X-Ile-Met-Asn-Y-Ser-OH，其中X為選自Gal，Ala的氨基酸殘基，Y為選自Ile，Leu的
氨基酸。該制備方法是固相化學(xué)合成法，其步驟包括以HMP樹脂為固相載體，氨基酸的 a_氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基團保護，用固相多肽合成儀合成，經(jīng)分離提純及凍干得
女口
廣 PFt ο本發(fā)明中所述如下結(jié)構(gòu)的蛙皮抗菌肽及其適用于藥用的鹽用作抗菌的藥物。Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-G ly-X-Ile-Met-Asn-Y-Ser-OH，其中X為選自Gal，Ala的氨基酸殘基，Y為選自Ile5Leu的
氨基酸。該抗菌藥物中含有蛙皮抗菌肽及其適用于藥用的鹽，或其組合物。本發(fā)明獲得的抗菌肽衍生物具有抗菌生物活性。此抗菌肽衍生物在50ug/ml時即 能抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病細菌。因此，本發(fā)明的抗菌肽衍生物可應(yīng)用于制 備抗病菌類產(chǎn)品，抗病菌類產(chǎn)品包括飼料添加劑、獸藥、防腐劑、醫(yī)藥產(chǎn)品如抗菌藥物等?，F(xiàn)結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步說明。附

圖1是本發(fā)明實施例1所得的蛙皮抗菌肽衍生物重組表達時的SDS-PAGE實驗 結(jié)果圖。附圖2是本發(fā)明實施例1所得的蛙皮抗菌肽衍生物對大腸桿菌的殺菌效果圖(標 示A的抑菌圈代表50ug/ml本發(fā)明實施例1所得的蛙皮抗菌肽衍生物，標示+的抑菌圈代 表50ug/ml天然蛙皮抗菌肽Magainin II)。附圖3是本發(fā)明實施例1所得的蛙皮抗菌肽衍生物對金黃色葡萄球菌的殺菌效果 圖(標示A的抑菌圈代表50ug/ml本發(fā)明實施例1所得的蛙皮抗菌肽衍生物，標示+的抑 菌圈代表50ug/ml天然蛙皮抗菌肽Magainin II)。下面實施例是對本發(fā)明的進一步闡述而不是對本發(fā)明的限制。實施例一基因工程法制備抗菌肽衍生物，其中X為Gal，Y為Ile本實驗采用組氨酸缺陷型畢赤酵母GS115作為宿主菌，采用分泌性表達載體 PPICZ α A構(gòu)建重組表達系統(tǒng)。選擇SacI內(nèi)切酶線性化重組載體pPICZ α Α，然后將通過分 子克隆手段使之帶有相應(yīng)酶切位點的抗菌肽衍生物基因通過T4DNA連接酶與線性化載體 連接，再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中，利用Zeocin抗性的低鹽LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。 挑單菌落接種培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進行酶切驗證和測序。整個實驗的詳細方法參見Sam brook J.編著的《分子克隆試驗室手冊》。制備畢赤酵母菌株GSl 15的感受態(tài)細胞。取80ml感受態(tài)細胞與IOug SacI單酶 切線性化的重組表達質(zhì)粒混勻，進行電擊轉(zhuǎn)化.30°C溫育Ih后，將菌液涂在含有l(wèi)OOug/mlZeocin抗生素的YPD固體培養(yǎng)基平板上.30°C恒溫培養(yǎng)2 4天，篩選出陽性菌落。同時， 將Sacl線性化的pPICZ α A空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GSl 15菌株作為空白對照。將鑒定得到的陽性重組酵母菌分別加入到IOml YPDA培養(yǎng)基中，在30°C恒溫培 養(yǎng)，進而利用甲醇作為誘導(dǎo)物，對重組目的蛋白進行誘導(dǎo)表達。圖1顯示了分別取未誘導(dǎo)、 誘導(dǎo)表達產(chǎn)物和誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的上清進行SDS-PAGE實驗的結(jié)果圖。實施例二、固相化學(xué)合成法制備本發(fā)明結(jié)構(gòu)的抗菌肽衍生物(1)合成以0. 25mmol規(guī)模為例，稱取HMP樹脂0. 25g，置入多肽合成儀上的反應(yīng)器中，將各 種帶保護基氨基酸稱取Immol裝瓶，按該促胰島素分泌肽衍生物的氨基酸序列從C-端向 N-端排列在合成儀中，于25°C室溫條件下，由計算機程序控制自動進行脫Fmoc保護、活化、 連結(jié)，然后再進行下一輪循環(huán)，如此完成合成。合成結(jié)束后，將得到的帶側(cè)鏈保護基的多肽 樹脂在多肽合成儀上吹干后稱重即可。(2)脫保護基及切斷樹脂將帶保護基的多肽樹脂置于具塞三角燒瓶，加入裂解試劑如下表 然后在恒溫30°C條件下，電磁攪拌反應(yīng)6小時；過濾、收集濾液，樹脂用少量三氟 乙酸洗滌；合并收集液與洗滌液，加入乙醚產(chǎn)生沉淀，過濾，沉淀用少量乙醚洗滌后放入干 燥器中干燥，得到粗品。(3) HPLC分離純化、凍干將得到的粗品用制備型HPLC進行分離、提純，最后經(jīng)冷凍干燥后得到產(chǎn)品。經(jīng)色 質(zhì)聯(lián)用，該衍生物分子量實測值與理論值相符。實施例三蛙皮抗菌肽衍生物的抑菌活性實驗(1)在超凈臺中，將準備好的菌懸液稀釋1000倍，濃度約為105CfU/ml，用滅菌棉 拭子將菌懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面，要求涂布均勻致密。(2)以無菌操作將孔徑為3毫米滅菌的不銹鋼小管放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中 的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合(以防藥液滲漏，影響
結(jié)果)ο(3)加樣把抗菌肽發(fā)酵液和對照樣品加樣，樣品加至滿而不溢為止。將平皿培養(yǎng)基置于37°C溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。
權(quán)利要求
一種如下結(jié)構(gòu)的多肽或其適于藥用的鹽Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly X Ile Met Asn Y Ser OH，其中X為選自Gal，Ala的氨基酸殘基，Y為選自Ile，Leu的氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽或其適于藥用的鹽，其特征在于組成上述結(jié)構(gòu)的多肽 的氨基酸是L型或者D型異構(gòu)體。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述多肽的制備方法該制備方法是基因工程方法，其步驟包括按上述多肽的氨基酸序列合成基因片段，基 因片段連接，質(zhì)粒構(gòu)建，克隆，發(fā)酵，分離純化及凍干得產(chǎn)品。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽或其適于藥用的鹽用作抗菌的藥物該抗菌藥物中 含有上述多肽或其適于藥用的鹽，或其組合物。全文摘要
本發(fā)明涉及一類有抗菌作用的抗菌肽衍生物及其適用于藥用的鹽，其結(jié)構(gòu)式如下Gly-Ile-Gly-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys-Phe-Gly-Lys-Ala-Phe-Val-Gly-X-Ile-Met-Asn-Y-Ser-OH，其中X為選自Gal，Ala的氨基酸殘基，Y為選自Ile，Leu的氨基酸。該衍生物具有與天然蛙皮抗菌肽相同或更強的抗菌作用，且易于固相化學(xué)合成法制備，尤其易于用基因工程技術(shù)制備。
文檔編號C12R1/84GK101928340SQ20091018915
公開日2010年12月29日 申請日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者彭永鶴, 李永新, 皮燦輝, 黃毓茂 申請人:深圳市圣西馬生物技術(shù)有限公司