專利名稱：干酪乳桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)酸發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種干酪乳桿菌及生產(chǎn)L-乳酸或其 鹽的方法。
背景技術(shù)：
乳酸(Lactic acid)又名 a-羥基丙酸(a-hydrxy-propioricacid)，分子式: C2H5OCOOH,相對分子量為90. 08，是一種簡單的羥基酸。分子中有一個不對稱碳原子，具有 旋光性，因此有L-乳酸與D-乳酸兩種旋光異構(gòu)體。L-乳酸為右旋性，D-乳酸為左旋性， DL-乳酸為消旋性，理化性質(zhì)除旋光性外基本相同。乳酸是一種重要的多用途有機(jī)酸之一，廣泛存在于人體、動植物和微生物體中。 L-乳酸及其鹽在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。尤其是以它作為單體用于制 備生物可降解塑料-聚L-乳酸，能夠很好的緩解環(huán)境和能源問題，因此，引起了世界的廣泛 關(guān)注，應(yīng)用前景非常廣闊。乳酸的光學(xué)純度對聚乳酸的物理性質(zhì)有著重要的影響，發(fā)酵法是目前獲得高光學(xué) 純度L-乳酸的理想方法，但是在發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸過程中，由于菌種、培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝的 千差萬別，導(dǎo)致L-乳酸的生產(chǎn)效率和成本相差甚遠(yuǎn)。因此適宜的菌種和低成本L-乳酸發(fā) 酵工藝是促進(jìn)聚乳酸產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展的關(guān)鍵所在。發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的菌種主要是根霉屬、乳桿菌屬、芽孢乳桿菌屬。乳酸菌對葡萄糖的 發(fā)酵可以分為同型發(fā)酵和異型發(fā)酵。同型發(fā)酵只形成乳酸一種代謝產(chǎn)物，乳桿菌屬和芽孢 乳桿菌屬屬于同型發(fā)酵；而異型發(fā)酵除形成乳酸外，還有乙醇、乙酸、二氧化碳等，根霉屬屬 于異型發(fā)酵。目前國內(nèi)外主要對乳桿菌屬、芽孢乳桿菌屬發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸進(jìn)行研究。普拉克生化公司在CN03814886. 2提出用凝結(jié)芽孢桿菌、熱噬淀粉芽孢桿菌、史氏 芽孢桿菌、嗜熱脂肪地芽孢桿菌或其混合物，在最佳PH 5. 50 5. 60條件下采用淀粉同時 糖化發(fā)酵生產(chǎn)乳酸或其鹽，得到的產(chǎn)物對映體純度大于99%，殘?zhí)切∮?g/L，同時認(rèn)為乳 桿菌屬等乳酸菌在它們生長溫度30 50°C影響乳酸的對映體純度，不適于乳酸工業(yè)生產(chǎn)， 且這些微生物的生長溫度范圍不適宜采用同時糖化發(fā)酵。上海新立工業(yè)微生物科技有限公司在CN02145142. 7中提出用嗜熱乳酸桿菌并行 厭氧發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，在pH 5. 0 6. 5和溫度45 55°C條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，加 入無機(jī)和有機(jī)氮源給菌種提供營養(yǎng)，增加了發(fā)酵成本，且由于這些氮源的加入使得產(chǎn)品提 取過程更加復(fù)雜。吉林大學(xué)在CN200510119041. 3中提出用干酪乳桿菌厭氧生產(chǎn)L-乳酸的方法，使 用的原料為葡萄糖等單糖或乳糖，氮源為無機(jī)和有機(jī)氮，眾所周知葡萄糖或乳糖的價格遠(yuǎn) 大于含淀粉的物質(zhì)，必然會增加發(fā)酵和提取成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種干酪乳桿菌及生產(chǎn)L-乳酸或其鹽的方法，以降低生產(chǎn)成本，獲得高光學(xué)純度L-乳酸產(chǎn)品，滿足聚乳酸生產(chǎn)的需要。本發(fā)明用于生產(chǎn)L-乳酸的微生物是一種干酪乳桿菌(LactcAacillus casei)的 突變菌株FY-04。該菌種有如下特點本發(fā)明提供的干酪乳桿菌Lactobacillus casei FY-04已于2009年9月11日保 藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(簡稱CGMCC)，其保藏號為CGMCCNO. 3洸9。本發(fā)明的干酪乳桿菌屬Lactobacillus casei FY-04具有如下性質(zhì)1、形態(tài)特征桿狀細(xì)菌，不運動，無芽孢，常排列為短鏈。2、生理特征過氧化氫酶陰性，乳酸消旋酶陰性，格蘭氏染色顯陰性，兼性好氧。本發(fā)明的干酪乳桿菌FY-04種子的培養(yǎng)過程為(1)將菌種FY-04接入種子培養(yǎng)基中于40 45°C活化M 48小時，鏡檢無異常 形態(tài)細(xì)胞和雜菌，菌體生長旺盛。(2)取步驟(1)培養(yǎng)好的種子移入三角瓶，在搖床上于40 45°C下培養(yǎng)M 48 小時。(3)將步驟( 培養(yǎng)好的種子接入種子罐中，于40 45°C下培養(yǎng)M 48小時， 采用逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的方式直至種子用量滿足發(fā)酵需求為止。步驟⑴中所述的種子培養(yǎng)基為葡萄糖2%，酵母膏0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏l(xiāng)%，NaCl 1 %，醋酸鈉0. 5%，檸檬 酸銨0.2%，MgSO4. 7H20 0. 02%，碳酸鈣2%，自來水配置，自然pH值，121°C滅菌20分鐘。本發(fā)明的干酪乳桿菌FY-04用于發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉、除油后的藻粉、木薯粉、大米粉等含淀粉物質(zhì)的一種或幾種混合物，同時 加入適量的自來水配制。本發(fā)明利用FY-04發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，包括(1)將60 200目的淀粉質(zhì)粉體加水配制成10% 30% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的溶液， 加入淀粉酶20 40U/g淀粉，在50 110°C液化1 池，然后加入糖化酶80 200U/g淀 粉，40 50°C保溫0. 5 乩，進(jìn)行預(yù)糖化；(2)當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到20g/L 70g/L時，加入中和劑，同時接入培養(yǎng)好的干酪乳 桿菌FY-04種子培養(yǎng)液，接種量為5 % 20 % (V/V)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)50 300rpm，發(fā)酵溫度40 50°C，發(fā)酵全程通入空氣，體積空速(每小時進(jìn)入發(fā)酵罐的空氣與發(fā)酵體積之比稱為空間 速度，簡稱空速)為2. Oh—1 60. Oh—1。本發(fā)明方法中，所述的淀粉質(zhì)原料粉體目數(shù)為60 200目，優(yōu)選為80 100目， 這樣在液化時可以減少酶的用量，同時避免高目數(shù)的淀粉質(zhì)原料在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的 泡沫而影響發(fā)酵。本發(fā)明方法中，所選用淀粉質(zhì)原料為玉米粉、除油后的藻粉、木薯粉、大米粉等含 淀粉物質(zhì)的一種或幾種混合物。本發(fā)明方法中，進(jìn)行預(yù)糖化的溫度為40 50°C，時間為0. 5 他，優(yōu)選預(yù)糖化溫 度為40 45°C，時間為3 4h。本發(fā)明方法中，當(dāng)預(yù)糖化的葡萄糖濃度達(dá)到20g/L 70g/L，優(yōu)選50g/L 60g/L 時，此時接入FY-04菌種既可以保證充足的碳源，又可避免高葡萄糖濃度對菌體產(chǎn)生抑制，從而獲得高產(chǎn)酸速率。本發(fā)明方法中，發(fā)酵溫度優(yōu)選40 45°C。本發(fā)明方法中，所述的中和劑為堿土金屬氫氧化物和/或堿土金屬碳酸鹽、或氨 水。本發(fā)明方法中優(yōu)選碳酸鈣作為中和劑。中和劑加入方式為一次性加入或分批或流加。本發(fā)明利用FY-04發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法中，發(fā)酵全程通入空氣，通空氣的體積 空速為2. Oh-1 60. Oh-1，優(yōu)選10. Oh-1 20. Oh-1。因為本發(fā)明所用的干酪乳桿菌FY-04為 兼性好氧菌種，這與現(xiàn)有公開工藝中的菌種及發(fā)酵工藝是有著顯著區(qū)別的，眾所周知兼性 好氧菌種增殖期，微量的氧氣可以促進(jìn)菌體增殖生長，同時空氣的通入可以攜帶二氧化碳 從發(fā)酵體系中逸出，保發(fā)酵體系中PH的穩(wěn)定利于菌種生長，與厭氧菌種(需要向發(fā)酵體系 中通入惰性氣體如氮氣置換氧氣)發(fā)酵工藝相比PH更穩(wěn)定，產(chǎn)酸效率高。生物材料保藏說明本發(fā)明提供的Lactobacillus casei FY-04菌株，保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心(CGMCC)；地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究 所；保藏編號=CGMCC No. 3269 ；保藏日期:2009年9月11日。


圖1是本發(fā)明實施例1用干酪乳桿菌FY-04發(fā)酵玉米粉試驗中，在通入空氣情況 下，糖和乳酸濃度隨發(fā)酵時間變化的情況。圖2是本發(fā)明比較例1用干酪乳桿菌FY-04發(fā)酵玉米粉試驗，在未通入空氣情況 下，糖和乳酸濃度隨發(fā)酵時間變化的情況。
具體實施例方式本發(fā)明利用FY-04發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，具體步驟包括將60 200目的淀粉質(zhì)粉體加水配置成10% 30 %的溶液，加入淀粉酶20 40U/g淀粉，在50 110°C液化1 2h，然后加入糖化酶80 200U/g淀粉，40 50°C保溫 0. 5 Mi，進(jìn)行預(yù)糖化；當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到20g/L 70g/L時加入中和劑，同時接入培養(yǎng)好的干酪乳桿菌 FY-04種子，接種量為5% 20% (V/V)，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)50 300rpm，發(fā)酵溫度40 50°C。下面通過具體實施例提供本發(fā)明的Lactobacillus casei FY-04菌株在發(fā)酵淀粉 生產(chǎn)L-乳酸中的具體應(yīng)用。實施例1本實施例為通入空氣情況下的發(fā)酵試驗2. 4kg玉米粉加入自來水配置成17. 1 %的溶液，加入輕質(zhì)碳酸鈣1kg，2. OmL高溫 淀粉酶，98°C液化lh，降溫到42°C，加入7. 2mL淀粉糖化酶，保溫預(yù)糖化3h，測定葡萄糖濃度 為 55g/L。干酪乳桿菌FY-04經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，加入發(fā)酵罐，于42°C，150rpm, pH 6. 0 條件下發(fā)酵，以空速10. Oh-1通入空氣，發(fā)酵42h，乳酸濃度達(dá)到最大值為160g/L，葡萄糖 0.5g/L。比較例1
比較例為未通入空氣情況下的發(fā)酵試驗。2. 4kg玉米粉加入自來水配置成17. 1 %的溶液，加入輕質(zhì)碳酸鈣1kg，2. OmL高溫 淀粉酶，98°C液化lh，降溫到42°C，加入7. 2mL淀粉糖化酶，保溫預(yù)糖化3h，測定葡萄糖濃度 為 55g/L。干酪乳桿菌FY-04經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，加入發(fā)酵罐，于42°C，150rpm, pH 6. 0 條件下發(fā)酵，發(fā)酵52h，乳酸濃度達(dá)到最大值為146g/L，葡萄糖14g/L。實施例1和比較例1的試驗結(jié)果如表1。表 權(quán)利要求
1.一種干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)FY_04，CGMCC No. 3269。
2.按照權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌，其特征在于，所述的干酪乳桿菌具有如下性質(zhì)(1)形態(tài)特征桿狀細(xì)菌，不運動，無芽孢，常排列為短鏈；(2)生理特征過氧化氫酶陰性，乳酸消旋酶陰性，格蘭氏染色顯陰性，兼性好氧。
3.權(quán)利要求1或2所述的干酪乳桿菌(LactcAacilluscasei) FY-04在生產(chǎn)L-乳酸中 的應(yīng)用。
4.按照權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述發(fā)酵方法包括如下步驟(1)將60 200目的淀粉質(zhì)粉體加水配制成10% 30%的溶液，加入淀粉酶20 40U/g淀粉，在50 110°C液化1 2h，然后加入糖化酶80 200U/g淀粉，40 50°C保溫 0. 5 Mi，進(jìn)行預(yù)糖化；(2)當(dāng)步驟(1)中葡萄糖濃度達(dá)到20g/L 70g/L時，加入中和劑，同時接入培養(yǎng)好的 干酪乳桿菌FY-04種子培養(yǎng)液，接種量為5 % 20 %，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)50 300rpm，發(fā)酵溫度40 50°C，發(fā)酵全程通入空氣，體積空速為2. Oh—1 60. Oh—1。
5.按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的中和劑為為堿土金屬氫氧化物、堿 土金屬碳酸鹽或氨水中的一種或幾種。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述中和劑的加入方式為一次性加 入、分批加入或流加加入。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)L-乳酸的干酪乳桿菌及其應(yīng)用。該菌株為干酪乳桿菌Lactobacillus casei FY-04，于2009年09月11日保藏于CGMCC，保藏號為CGMCC No.3269。該菌株格蘭氏染色呈陰性，兼性好氧。本發(fā)明的菌株用于淀粉發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸時，在發(fā)酵過程中通入空氣，微量的氧氣可以促進(jìn)菌體增殖生長，同時空氣的通入可以攜帶二氧化碳從發(fā)酵體系中逸出，確保發(fā)酵體系中pH值的穩(wěn)定利于菌種生長，與厭氧菌種發(fā)酵工藝相比pH值更穩(wěn)定，產(chǎn)酸效率更高。
文檔編號C12R1/245GK102051336SQ200910188108
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者佟明友, 劉樹臣, 宋喜軍, 張霖, 袁毅, 高大成, 黎元生 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院