專利名稱：具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源重組蛋白的表達(dá)和純化，具體涉及到一種可抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)
生機(jī)理的人源糖蛋白其中一個(gè)功能域的原核表達(dá)、純化及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗磷脂綜合癥(antiphospholipid syndrome ;APS)是1986年新確立的一種隸屬 于系統(tǒng)性紅斑狼瘡癥(systemic lupus erythematosus ;SLE)的一種難治性自身免疫性疾 病，臨床表現(xiàn)為動(dòng)靜脈血栓和習(xí)慣性流產(chǎn)以及血小板減少等癥狀。抗心磷脂抗體由于與血 栓形成、血小板減少、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、習(xí)慣性流產(chǎn)等凝血系統(tǒng)改變等密切相關(guān)，所以抗心 磷脂抗體可作為抗磷脂綜合癥診斷依據(jù)之一，也可作為臨床上預(yù)測(cè)血栓形成趨勢(shì)的標(biāo)志。
抗心磷脂抗體(aCL)的真正抗原并不是心磷脂Cardiolipin，而是存在于血清中 的一種糖蛋白^-glycoprotein I(P2-GPI))。所以抗心磷脂抗體也被稱為抗P 2_糖蛋 白I(P2-glycoproteinI ; P 2_GPI)抗體。P 2_GPI又稱為載脂蛋白H(即olipoprotein H， 即oH)，是血漿中的一種糖蛋白，由含有326個(gè)氨基酸殘基的一條多肽鏈組成，13 2-GPI分子 中存在5個(gè)特殊功能的結(jié)構(gòu)域[Q. Liu， K. Kobayashi， J. Furukawa， J. Inagaki， N. Sakairi， A. Iwado， T. Yasuda， T.Koike， D. R. Voelker， andE. Matsuura， Omega—carboxyl variants of 7_ketocholesteryl esters are ligands forbeta(2)-glycoprotein I and mediate antibody—dependent uptake of oxidized U)L by macrophages.幾ipid Res 43 : 1486-95,2002]。 在體內(nèi)P2-GPI通過(guò)oxLDL上的配體同oxLDL結(jié)合形成復(fù)合物，在此情況下 13 2-GPI上潛藏的抗原決定簇凸現(xiàn)出來(lái)，并被人自身抗13 2_GPI抗體識(shí)別。13 2-GPI-oxLDL 的復(fù)合體與抗P2-GPI抗體特異性結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的膽固醇的吞噬攝取和泡 沫化是抗磷脂綜合癥動(dòng)脈硬化和血栓形成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵事件和環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為 P2-GPI的第五結(jié)構(gòu)域參與其與oxLDL存在的配體(oxLig-1)結(jié)合，而抗P 2_GPI抗體識(shí) 別P2-GPI的抗原決定簇在其第四結(jié)構(gòu)域，并且，此隱藏的抗原決定簇需要在P2-GPI與 oxLDL結(jié)合后才被展現(xiàn)并被識(shí)別，因此，把P2-GPI的第五結(jié)構(gòu)域單獨(dú)表達(dá)出來(lái)，作為藥 物競(jìng)爭(zhēng)性的與oxLDL結(jié)合，但不能被自身抗P2-GPI抗體識(shí)別，從而可達(dá)到預(yù)防減緩甚至 治療動(dòng)脈硬化[K. Kobayashi， E. Mats皿ra， Q. Liu， J. Furukawa， K. Kaihara， J. Inagaki， T. Ats咖i， N. Sakairi， T. Yasuda， D. R. Voelker， and T. Koike， Aspecific ligand for beta (2)-glycoprotein I mediates autoantibody-d印endent uptake of oxidized lowdensity lipoprotein by macrophages. J Lipid Res 42(2001)697-709]。
|3 2-GPI的第五結(jié)構(gòu)域的獲得須通過(guò)體外表達(dá)的方式，而要得到大量的并且具有 活性的P2-GPI Domain V，那么原核表達(dá)為最佳選擇表達(dá)方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種重組蛋白13 2_GPI Domain V的原核表達(dá)方法；并驗(yàn)證重組蛋白P2-GPI Domain V在動(dòng)脈硬化致病機(jī)理與人自身P 2_GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig-l (存 在與oxLDL上并可結(jié)合e廠GPI的一個(gè)配體)的應(yīng)用，以及重組蛋白P2-GPI Domain V作 為預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化疾病藥物的應(yīng)用。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是 通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物在已保存有P廠GPI基因片段的T載體上進(jìn)行 Polymerase ChainReaction (PCR)反應(yīng)擴(kuò)增得到P 2_GPI Domain V基因片段，并克隆到表 達(dá)載體pET-32a-c (+)上，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a_DV，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta-gami 表達(dá)菌，然后經(jīng)過(guò)異丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并通過(guò)鎳離子親 和層析柱純化重組蛋白，western blot方法驗(yàn)證重組蛋白P 2_GPI Domain V表達(dá)，TLC-配 體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)P2-GPI Domain V蛋白活性，ELISA競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá) 13廠GPIdomain V蛋白可作為預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物的可行性。
上下游引物如下
上游引物 5' -CGG GGTACC GACGACGACGAC AAAGCATCTTGTAAAGTACCTGTG-3'
45bp
下游引物 5' -CG GAATTC TTAGCATGGCTTTACATCGGATGC-3，
32bp 其中上游引物中5'端含有Kpnl酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基、EK酶切位點(diǎn)以及P 2_GPI
Domain V5'端部分氨基酸編碼基因序列；下游引物中5'端含有EcoRI酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基
以及P廠GPIDomain V 3'端部分氨基酸編碼基因的互補(bǔ)序列。 具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化的過(guò)程如下 (1)重組人P2-GPI Domain V基因片段擴(kuò)增 選用上游引物和下游引物，以已保存有P2-GPI基因片段的T載體重組質(zhì)粒為模
板，PCR反應(yīng)擴(kuò)增P2-GPI Domain V目的基因； (2) P 2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a-DV的構(gòu)建 1) P 2-GPI Domain V目的基因T載體構(gòu)建 將步驟(1)中獲得的P2-GPI Domain V目的基因PCR產(chǎn)物純化回收并將其與 PMD19-Tsimple連接，獲得含有P2-GPI Domain V目的基因的T載體，并將其轉(zhuǎn)化至JM 109 大腸桿菌中，通過(guò)抗性篩選陽(yáng)性克隆挑選連接正確的T載體克隆，并通過(guò)菌體PCR、酶切、T 載體測(cè)序手段鑒定載體構(gòu)建正確性； 2) P 2-GPI Domain V目的基因與表達(dá)載體pET-32a-c (+)的連接構(gòu)建
根據(jù)上游引物和下游引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)分別對(duì)含有P2-GPI Domain V目的基 因的T載體和pET-32a-c (+)載體分別進(jìn)行雙酶切，通過(guò)對(duì)酶切得到的DNA片段進(jìn)行凝膠純 化回收，采用連接試劑盒對(duì)目的基因P2-GPI Domain V和酶切后的線性pET-32a-c (+)載體 進(jìn)行連接，構(gòu)建P2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a_DV，通過(guò)轉(zhuǎn)化JM109菌，進(jìn)行抗性篩選 挑選連接成功的菌株，并通過(guò)菌體PCR，雙酶切實(shí)驗(yàn)手段對(duì)表達(dá)載體pET32a-DV進(jìn)行鑒定， 其結(jié)果表明表達(dá)載體pET32a-DV構(gòu)建完成。 (3)將表達(dá)載體pET32a-DV轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株rosetta-gami (DE3):
取已經(jīng)確認(rèn)的100 ii g/ ii L表達(dá)載體pET32a-DV 0. 1 ii L_5 ii L轉(zhuǎn)化氯化鈣制備的 表達(dá)菌株rosetta-gami (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到特定抗性的LB平板上。挑選陽(yáng)性克隆 低溫冰箱內(nèi)甘油保存此菌種。 (4)重組P2-GPI Domain V誘導(dǎo)表達(dá)以及純化
1)重組P 2-GPI Domain V IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 對(duì)重組P 2-GPI Domain V蛋白的0_2mM不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)3-6小
時(shí)后，SDS-PAGE全蛋白電泳，確定P2-GPI DomainV蛋白是否成功表達(dá)。 2)重組P 2_GPI Domain V AKATA儀鎳離子親和層析柱純化 收集100-lOOOml的經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的rosetta-gami菌體，用PH :5-8，
10-lOOmM的Tris-HCL超聲裂解液重懸菌體，50-300W功率進(jìn)行超聲破碎，lOOOOrpm以上速
度離心后，取全部上清液用AKATA儀通過(guò)鎳離子親和層析柱純化蛋白，最后通過(guò)對(duì)純化的
蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測(cè)定純度。 (5)用western blot方法檢測(cè)目的蛋白: 選取10-lOOml經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的rosetta-gami菌體進(jìn)行超聲破碎后，取 1-30 L上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，孵育小鼠抗His抗 體，HRP山羊抗鼠二抗，最后通過(guò)ECL顯色液顯色，底片曝光顯示結(jié)果。 [OO34] (6) TLC-配體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)P 2-GPI Domain V蛋白活性
將心磷脂和oxLig-1各按1-50 y g量分別點(diǎn)樣TLC板，展開劑氯仿甲醇體 積比為8 : 1-10 : 1， 3 % (w/v)的gelatin封閉，分別孵育P 2_GPI/ P 2_GPI Domain V，并分別孵育WB-Cal-l抗體/Anti-His Antibody。孵育HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體，經(jīng) 4-methoxy-l-n即hto1顯色成像，重組P 2_GPI Domain V同P 2_GPI均可與CL， oxlig-1結(jié) 合。 (7) P 2-GPI Domain V， P 2_GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig-1實(shí)驗(yàn): 將0. l-50ii g的oxLig-1包被到96孔板上，通過(guò)加入0. 5ii g-3ii g P 2_GPI和 0. 5 ii g-10. 5 ii g的相應(yīng)濃度梯度的重組P 2-GPI Domain V，從而實(shí)現(xiàn)P 2_GPI Domain V， P 2_GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig-1 ，通過(guò)孵育WB-Cal-l抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，最后用酶 標(biāo)儀在400-600nm波長(zhǎng)下檢測(cè)0D并記錄其結(jié)果。 本發(fā)明通過(guò)獲得oxLDL上的一個(gè)介導(dǎo)oxLDL與P 2_GPI結(jié)合的配體oxLig-l，用其 代替oxLDL，構(gòu)建通過(guò)與P2-GPI抑制性酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)原核表達(dá)的P2-GPI Domain V的生物活性，同時(shí)也證實(shí)了 P 2_GPI Domain V可以有效的競(jìng)爭(zhēng)性抑制P 2_GPI與 oxLig-1 (oxLDL)的結(jié)合作用，從而抑制了人自身抗P2-GPI抗體識(shí)別1^-GPI，進(jìn)而抑制 oxLDL被巨噬細(xì)胞所吞噬發(fā)生泡沫化。起到預(yù)防并預(yù)防治療動(dòng)脈硬化的作用。
本發(fā)明獲得的蛋白，包括一個(gè)Trx融合標(biāo)簽與目的蛋白序列融合表達(dá)，在29KD左 右，其中Trx標(biāo)簽與目的蛋白之間含有EK酶切位點(diǎn)，在必要時(shí)可對(duì)其進(jìn)行切除。本發(fā)明還 對(duì)菌體表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化回收，通過(guò)AKATA儀鎳離子親和層析柱對(duì)其純化，最后目的蛋 白純度可在85%以上。 本發(fā)明的有益效果是表達(dá)重組蛋白P2-GPI Domain V能夠有效競(jìng)爭(zhēng)性抑制 oxLig-l與P 2-GPI的結(jié)合，也就是P 2-GPI Domain V間接的消耗了抗P2-GPI抗體，減少 巨噬細(xì)胞對(duì)P廠GPI/oxLDL/抗P廠GPI抗體三體復(fù)合物的攝入從而使動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防
6治療成為可能。


圖1為重組|3 2-GPI Domain V基因片段PCR瓊脂糖電泳圖。 泳道1 :DL2000marker ;泳道2 : P 2_GPI Domain V基因(287bp)PCR結(jié)果; 圖2為目的基因13 2_GPI Domain V與T載體連接的PCR鑒定結(jié)果圖。 泳道1 :DL2000marker ;泳道2 :1號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道3 :2號(hào)菌PCR結(jié)果 圖3為T載體目的基因13 2_GPI DomainV片段測(cè)序結(jié)果圖。 圖4為目的基因P 2_GPI DomainV表達(dá)載體pET32a_DV菌體PCR電泳圖。 泳道1 :DL2000marker ;泳道2 :1號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道3 :2號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道4 :3
號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道5 :4號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道6 :5號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道7 :6號(hào)菌PCR結(jié)果； 泳道8 :7號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道9 :8號(hào)菌PCR結(jié)果；泳道10 :9號(hào)菌PCR結(jié)果。 圖5為目的基因P 2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a_DV酶切鑒定圖。
泳道1 :DL2000marker ;泳道2 :pET32a+表達(dá)載體酶切結(jié)果。
圖6為DV全蛋白IPTG誘導(dǎo)SDS-PAGE電泳。 泳道1 :蛋白marker ;泳道2 :無(wú)IPTG誘導(dǎo)；泳道3 :0. OlmM IPTG誘導(dǎo)；泳道4 :
0. 05mM IPTG誘導(dǎo)；泳道5 :0. lmM IPTG誘導(dǎo)；泳道6 :0. 5mM IPTG誘導(dǎo)；泳道7 :lmMIPTG誘 導(dǎo)；泳道8 :2mM IPTG誘導(dǎo)。 圖7為P 2-GPIDomainV蛋白可溶表達(dá)與純化SDS-PAGE電泳圖。 泳道1 :蛋白marker ;泳道2 :純化后P 2_GPI Domain V重組蛋白。 圖8為P 2-GPI Domain V的Western Blot方法檢測(cè)結(jié)果圖。 圖9為TLC板P 2-GPI Domain V/oxLig_l， CL結(jié)合活性驗(yàn)證圖。 1 :CL點(diǎn)樣，孵育P2-GPI，WB-Cal-1抗體;2 :CL點(diǎn)樣，孵育P 2_GPI，抗His-taq抗
體；3 :oxLig-l點(diǎn)樣，孵育P2-GPI， WB-Cal-1抗體；4 :孵育P2-GPI，抗His-taq抗體。 圖10為P 2-GPI Domain V， P 2_GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig-1實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖(oxLig-1包
被板)。 縱坐標(biāo)為492nm波長(zhǎng)0D值，橫坐標(biāo)依次為1 P 2_GPI (1. 5 y g) DV (0 y g); 2 P 2_GPI (1. 5 ii g) ， DV(l. 5 ii g) ;3 P 2_GPI (1. 5 ii g)DV(4. 5 ii g) ;4 P 2_GPI (1. 5 ii g) DV(9 ii g) ;5 P 2-GPI (1. 5 ii g)DV(15 y g) ;6陰性對(duì)照組Control 1 (無(wú)P 2_GPI，力口 DV
1. 5ii g) ，7Contro1 2(1.5iig P 2-GPI，無(wú)oxLig-1包被)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化的過(guò)程如下
(1)重組P 2-GPI Domain V基因片段擴(kuò)增 該擴(kuò)增體系選用上游引物和下游引物，以本實(shí)驗(yàn)室保存CTA727-1重組質(zhì)粒為模 板，反應(yīng)條件如下
94°C lmin ; (98°C 10s ;57。C 30s ;72。C 30s) X30 ;
72 °C 10min。 重組|3 2-GPI Domain V基因PCR產(chǎn)物大小為287bp，如圖1所示經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖
凝膠電泳，可見(jiàn)目的片段大小與預(yù)期一致。 (2) P 2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a_DV的構(gòu)建 1) P 2-GPI Domain V目的基因T載體構(gòu)建 (a)將50ii L Domain V目的基因PCR產(chǎn)物上樣，1. 5%膠瓊脂糖電泳，用膠回收試
劑盒將目的基因回收； 連接反應(yīng)體系 PMD19-T simple vector : 1u L (50u g)
P 2-GPI Domain V : 3 ii L (150 ii g) dH20 : 1 ii L 用TaKaRa連接試劑盒，加入solution I， 16。C連接45min。 (b) PCR鑒定T載體與|3 2-GPI Domain V目的基因是否連接成功 將帶有|3 2-GPI Domain V目的基因的T_載體轉(zhuǎn)入JM109菌中，隨機(jī)挑去3個(gè)單
菌落進(jìn)行菌體PCR鑒定，鑒定目的基因P2-GPI Domain V是否連接或正確連接到T載體。 I)分別用槍頭隨機(jī)挑取l，2，3號(hào)單菌于5iiL dH20中，置于PCR管中，標(biāo)號(hào)1， 2， 3
號(hào)管； II)建立PCR反應(yīng)體系 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2，在287bp左右，1， 2， 3號(hào)菌中均有特異性目的條帶，說(shuō)明在T載體 中存在Domain V目的基因，選3號(hào)特異性條帶最強(qiáng)菌落進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
(c)T載體測(cè)序鑒定 T載體質(zhì)粒由大連寶生物公司測(cè)序，用Bioedit軟件將測(cè)定基因的核苷酸序列以 及推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank發(fā)表的序列進(jìn)行對(duì)比分析。 GGCTTTTTGGAAAACTGATGCATCCGATGTAAAGCCATGCTAAGAATTCCG
如圖3，經(jīng)過(guò)比對(duì)與NCBI給出的序列完全吻合。 2) P2-GPI Domain V目的基因與表達(dá)載體pET-32a-c (+)的連接構(gòu)建 通過(guò)對(duì)酶切得到的DNA片段進(jìn)行凝膠純化回收，采用連接試劑盒對(duì)目的基因
P2-GPIDomain V和酶切后的線性pET-32a-c (+)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建P 2_GPI Domain V
表達(dá)載體pET32a-DV，通過(guò)轉(zhuǎn)化JM109菌，進(jìn)行抗性篩選挑選連接成功的菌株，并通過(guò)菌體
PCR，雙酶切實(shí)驗(yàn)手段對(duì)表達(dá)載體pET32a-DV進(jìn)行鑒定，其結(jié)果表明表達(dá)載體pET32a-DV構(gòu)
建完成。 (a)用BBI公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取T載體質(zhì)粒。并對(duì)T載體以及pET-32a-c (+) 載體進(jìn)行雙酶切，采用限制性內(nèi)切酶EcoR 1、Kpn I。雙酶切體系如下(50iU)
pET-32a-c (+)雙酶切 T載體 10 XM buffer: 5 ii L 5 ii L
8
EcoRI : Kpnl :2ii 1 pET32a+表達(dá)載體/ T載體/ dH20 :11 ii L11 ii L 反應(yīng)條件37°C，4h。 酶切結(jié)束后分別上樣跑1. 5%瓊脂糖凝膠并用膠回收試劑盒回收目的基因。并按照載體目的基因=1 : 3 10的比例進(jìn)行定:直； (b)連接表達(dá)載體，采用Takara 1igation kit，取3yL pET32a_DV轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中。 (c)PCR鑒定目的基因P 2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a_DV : 用菌體PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)入JM109菌中P 2_GPI Domain V連接表達(dá)載體進(jìn)行鑒定目
的基因是否與表達(dá)載體連接。 a)隨機(jī)用槍頭挑取單菌落l，2，3，4，5，6，7，8，9號(hào)于含有5iiL c^0的PCR管中， 并在PCR管上標(biāo)相應(yīng)序列號(hào)。
0104]b)建立PCR反應(yīng)體系
0105]94°C lmin ; (98°C 10s ;57。C 30s 72°C 30s) X30 ;72。C lOmin。0106]結(jié)果如圖4， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9號(hào)菌中均有特異性條帶。0107]3)酶切鑒定目的基因132-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a_DV :
0108]酶切體系(50 y L)
0109]10XMbuffer :5 li L
0110]EcoRI :
0111 ]Kpnl :
0112]pET32a+表達(dá)載體
0113]dH20 : 21iiL
0114]結(jié)果如圖5，酶切后結(jié)果存在287bp條帶，說(shuō)明目的基因已經(jīng)正確連接表達(dá)載體。0115](3)將表達(dá)載體pET32a--DV轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株rosetta-gami (DE3):
0116]用BBI質(zhì)粒提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化陽(yáng)性菌株質(zhì)粒。取2 L質(zhì)粒轉(zhuǎn)化氯化鈣制備的表達(dá)菌株rosetta-gami (DE3)感受態(tài)細(xì)胞100iiL。涂布到LB (氨節(jié)青霉素、四環(huán)素、卡那霉 素抗性)平板上，37t:倒置培養(yǎng)。挑選陽(yáng)性克隆體積比20%甘油保存。將菌種-8(TC保存。
(4)重組P 2-GPI Domain V誘導(dǎo)表達(dá)以及純化 對(duì)P2-GPI Domain V蛋白的不同濃度IPTG 6h誘導(dǎo)表達(dá)，(目的蛋白前段加Trx 標(biāo)簽后的蛋白約30KD。) 用無(wú)IPTG ;0. OlmM IPTG ;0. 05mM IPTG ;0. ImM IPTG ;0. 5mM IPTG ;lmM IPTG ;2mM IPTG ;6小時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE全蛋白電泳，如圖6，在30KD左右可以看到清晰特異性蛋 白條帶，在25KD到34KD Marker之間，在無(wú)IPTG誘導(dǎo)和存在IPTG誘導(dǎo)對(duì)比顯示，P 2_GPI DomainV蛋白已經(jīng)成功表達(dá)。 1)全蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟如下a)取4iiL菌液(表達(dá)菌甘油保存菌)加入5mLLB(amp抗性)培養(yǎng)基，160rpm 37°C過(guò)夜搖菌； b)取lmL菌液，1 : 50比例加LB(amp抗性)培養(yǎng)基至50mL，錐形瓶中170rpm 37°C 搖菌； c)測(cè)0D600至0. 5時(shí)，分裝菌液，5mL每管，共8管并標(biāo)號(hào)0， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7 ; d)并加IPTG濃度按編號(hào)依次如為無(wú)IPTG ;0. OlmM ;0. 05mM ;0. ImM ;0. 5mM ;lmM ; 2mM ; e) 170rpm 37。C搖菌6小時(shí)； f)取出菌液，5000rpm 5min離心去上清； g)力卩入80 ii L TE (1 X) ， 20 ii L 5 X loading buffer ; h) IO(TC煮沸5min ; i)配置12%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳； j)考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像系統(tǒng)成像； 2)重組P2-GPI Domain VAKATA儀經(jīng)過(guò)鎳親和層析柱純化 在33t:條件下培養(yǎng)6h 2L表達(dá)菌，超聲破碎后取上清上AKATA儀經(jīng)過(guò)鎳親和層析 柱純化后，收集純化Domain V蛋白做15% SDS-PAGE電泳，如圖7，經(jīng)過(guò)BAND SCAN軟件分 析，用鎳親和層析柱純化Domain V蛋白后純度可達(dá)85%以上。
(5)用western blot方法檢測(cè)目的蛋白: 用抗His抗體檢測(cè)表達(dá)蛋白中是否含有P2-GPI Domain V蛋白，實(shí)驗(yàn)步驟如下 1)選取20ml經(jīng)過(guò)0. ImM IPTG誘導(dǎo)37。C培養(yǎng)的rosetta-gami菌體進(jìn)行超聲破碎
后，取10iiL破碎后的上清液； 2)體積比12%聚丙烯酰胺膠配制； 3) 10 ii L每孔上樣，SDS-PAGE電泳100V 2h ; 4)轉(zhuǎn)膜，冰上100V lh ; 5)5% (w/v) BSA封閉lh ; 6) 1 : 3000稀釋his-antibody 4。C搖擺平臺(tái)過(guò)夜； 7) HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體(1 : 5000稀釋)搖擺平臺(tái)孵育lh ; 8)ECL顯色(Amersham ECL Plus western Blotting petction Reagents); 9)暗室中曝光IO分鐘在顯影液中顯影，定影液中定影，取出底片； 10)凝膠成像系統(tǒng)下顯影。 用western的方法對(duì)菌株表達(dá)全蛋白檢測(cè)是否含有目的蛋白。如圖8所示，用抗
his抗體作為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗鼠標(biāo)記二抗，有目的條帶出現(xiàn)。 (6)TLC-配體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)P2-GPI Domain V蛋白活性 鎳離子親和層析柱純化P2-GPI Domain V蛋白后對(duì)85%純度Domain V蛋白活性
采用TLC-配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定 將心磷脂、oxLig-l各lOiig分別點(diǎn)樣TLC板，展開劑氯仿甲醇=8 : 1，3% (w/v) gelatin封閉，分別孵育P 2_GPI/P 2_GPI Domain V，并分別孵育WB-Cal-1抗體/ Anti-His Antibody。孵育HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體，經(jīng)4-methoxy-l-n即hto1顯色成像，結(jié) 果如圖9，重組P 2-GPIDomain V同P 2_GPI均可與CL， oxlig-1結(jié)合。
(7) P 2-GPI Domain V， P 2_GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig—1實(shí)驗(yàn):
1)將濃度為50 ii g/mL oxLig-1每孔包被50 P L，包被過(guò)夜； 2)1% gelatin-PBS(150ii L)每孔封閉1小時(shí); 3) 180 li L/well PBS-O. 05% Tween-20，洗3次; 4)按梯度加入Domain V并加入1. 5 y g P 2-GPI ， PBS補(bǔ)足180 u L，孵育40分鐘 5)加入單克隆抗體anti-p2-GPI抗體WB-CAL-l(50iig/mL)，50uL/well。孵育1 小時(shí)。 6) 180 ii L/well PBS-O. 05% Tween-20，洗3次； 7)孵育HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗體，1小時(shí)； 8) 180 li l/well PBS-O. 05% Tween-20，洗3次； 9)0PD顯色； 10) 2N濃硫酸，100 ii L/well終止; 11)492nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀檢測(cè)數(shù)據(jù)。 如圖10結(jié)果所示，重組f3廠GPI Domain V蛋白起到了與oxLig-l結(jié)合的作用， 并且在P2-GPI的存在下，重組P2-GPI Domain V起到了顯著的與GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 oxLig-l的作用。
權(quán)利要求
具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化，其特征在于，通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物在已保存有β2-GPI基因片段的T載體上進(jìn)行Polymerase Chain Reaction(PCR)反應(yīng)擴(kuò)增得到β2-GPI Domain V基因片段，并克隆到表達(dá)載體pET-32a-c(+)上，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a-DV，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta-gami表達(dá)菌，然后經(jīng)過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并通過(guò)鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，western blot方法驗(yàn)證重組蛋白β2-GPI Domain V表達(dá)，TLC-配體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)β2-GPI Domain V蛋白活性，ELISA競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)β2-GPIdomain V蛋白可作為預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物的可行性；上下游引物如下上游引物5’-CGG GGTACCAAAGCATCTTGTAAAGTACCTGTG-3’45bp下游引物5’-CG GAATTC TTAGCATGGCTTTACATCGGATGC-3’32bp其中上游引物中5’端含有KpnI酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基、EK酶切位點(diǎn)以及β2-GPI Domain V5’端部分氨基酸編碼基因序列；下游引物中5’端含有EcoRI酶切位點(diǎn)、保護(hù)堿基以及β2-GPIDomain V 3’端部分氨基酸編碼基因的互補(bǔ)序列；具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化的步驟如下(1)重組人β2-GPI Domain V基因片段擴(kuò)增選用上游引物和下游引物，以已保存有β2-GPI基因片段的T載體重組質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)擴(kuò)增β2-GPI Domain V目的基因；(2)β2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a-DV的構(gòu)建1)β2-GPI Domain V目的基因T載體構(gòu)建將步驟(1)中獲得的β2-GPI Domain V目的基因PCR產(chǎn)物純化回收并將其與PMD19-Tsimple連接，獲得含有β2-GPI Domain V目的基因的T載體，并將其轉(zhuǎn)化至JM 109大腸桿菌中，通過(guò)抗性篩選陽(yáng)性克隆挑選連接正確的T載體克隆，并通過(guò)菌體PCR、酶切、T載體測(cè)序手段鑒定載體構(gòu)建正確性；2)β2-GPI Domain V目的基因與表達(dá)載體pET-32a-c(+)的連接構(gòu)建根據(jù)上游引物和下游引物設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)分別對(duì)含有β2-GPI Domain V目的基因的T載體和pET-32a-c(+)載體分別進(jìn)行雙酶切，通過(guò)對(duì)酶切得到的DNA片段進(jìn)行凝膠純化回收，采用連接試劑盒對(duì)目的基因β2-GPI Domain V和酶切后的線性pET-32a-c(+)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建β2-GPI Domain V表達(dá)載體pET32a-DV，通過(guò)轉(zhuǎn)化JM109菌，進(jìn)行抗性篩選挑選連接成功的菌株，并通過(guò)菌體PCR，雙酶切實(shí)驗(yàn)手段對(duì)表達(dá)載體pET32a-DV進(jìn)行鑒定，其結(jié)果表明表達(dá)載體pET32a-DV構(gòu)建完成；(3)將表達(dá)載體pET32a-DV轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株rosetta-gami(DE3)取已經(jīng)確認(rèn)的100μg/μL表達(dá)載體pET32a-DV 0.1μL-5μL轉(zhuǎn)化氯化鈣制備的表達(dá)菌株rosetta-gami(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布到特定抗性的LB平板上，挑選陽(yáng)性克隆低溫冰箱內(nèi)甘油保存此菌種；(4)重組β2-GPI Domain V誘導(dǎo)表達(dá)以及純化1)重組β2-GPI Domain V IPTG誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)重組β2-GPI Domain V蛋白的0-2mM不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)3-6小時(shí)后，SDS-PAGE全蛋白電泳，確定β2-GPI DomainV蛋白是否成功表達(dá)；2)重組β2-GPI Domain V AKATA儀鎳離子親和層析柱純化收集100-1000ml的經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的rosetta-gami菌體，用PH5-8，10-100mM的Tris-HCL超聲裂解液重懸菌體，50-300W功率進(jìn)行超聲破碎，10000rpm以上速度離心后，取全部上清液用AKATA儀通過(guò)鎳離子親和層析柱純化蛋白，最后通過(guò)對(duì)純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測(cè)定純度；(5)用western blot方法檢測(cè)目的蛋白選取10-100ml經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的rosetta-gami菌體進(jìn)行超聲破碎后，取1-30μL上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，孵育小鼠抗His抗體，HRP山羊抗鼠二抗，最后通過(guò)ECL顯色液顯色，底片曝光顯示結(jié)果；(6)TLC-配體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)β2-GPI Domain V蛋白活性將心磷脂和oxLig-1各按1-50μg量分別點(diǎn)樣TLC板，展開劑氯仿∶甲醇體積比為8∶1-10∶1，3％(w/v)的gelatin封閉，分別孵育β2-GPI/β2-GPI Domain V，并分別孵育WB-Cal-1抗體/Anti-His Antibody。孵育HRP標(biāo)記山羊抗鼠抗體，經(jīng)4-methoxy-1-naphtol顯色成像，重組β2-GPI Domain V同β2-GPI均可與CL，oxlig-1結(jié)合；(7)β2-GPI Domain V，β2-GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig-1實(shí)驗(yàn)將0.1-50μg的oxLig-1包被到96孔板上，通過(guò)加入0.5μg-3μg β2-GPI和0.5μg-10.5μg的相應(yīng)濃度梯度的重組β2-GPI Domain V，從而實(shí)現(xiàn)β2-GPI Domain V，β2-GPI競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合oxLig-1，通過(guò)孵育WB-Cal-1抗體，HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，最后用酶標(biāo)儀在400-600nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD并記錄其結(jié)果。F2009101879439C00011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化，其特征在于，表達(dá)重組蛋白P2-GPI Domain V能夠有效競(jìng)爭(zhēng)性抑制oxLig-1與P 2_GPI的結(jié)合，減少巨噬細(xì)胞對(duì)P廠GPI/oxLDL/抗P廠GPI抗體三體復(fù)合物的攝入，從而使動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防治療成為可能。
全文摘要
本發(fā)明涉及人源重組蛋白的表達(dá)和純化，具體涉及到一種具有預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化作用的重組蛋白表達(dá)與純化。通過(guò)設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物在已保存有β2-GPI基因片段的T載體上進(jìn)行Polymerase Chain Reaction(PCR)反應(yīng)擴(kuò)增得到β2-GPI Domain V基因片段，并克隆到表達(dá)載體pET-32a-c(+)上，構(gòu)建表達(dá)載體pET32a-DV，并將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta-gami表達(dá)菌，然后經(jīng)過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并通過(guò)鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，western blot方法驗(yàn)證重組蛋白β2-GPI Domain V表達(dá)，TLC-配體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)β2-GPI Domain V蛋白活性，ELISA競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)驗(yàn)證重組表達(dá)β2-GPIdomain V蛋白可作為預(yù)防治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物的可行性。
文檔編號(hào)C12N15/70GK101775406SQ20091018794
公開日2010年7月14日 申請(qǐng)日期2009年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日
發(fā)明者劉慶平, 張英彪, 李文哲, 遲彥 申請(qǐng)人:大連大學(xué)