專利名稱：一種微流控芯片及其研究非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及將微流控芯片技術應用于生物醫(yī)學研究領域，具體提供了一種微流 控芯片及其研究非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法。
背景技術：
細胞相互作用是當今醫(yī)學和生物學界研究的研究熱點。細胞并不是一個孤立 的生命單位，細胞與細胞之間也不是簡單的機械連接，而是存在各種形式的相互交流從 而構(gòu)成一個完整的個體并協(xié)調(diào)完成各種生命活動。探索細胞間相互作用及相應的信號通 路，對疾病治療等有著重要作用。
目前，細胞共培養(yǎng)是最為常用的研究細胞相互作用的方法。傳統(tǒng)上研究細胞共 培養(yǎng)方法一般分為三類混合共培養(yǎng)、微載體共培養(yǎng)和Tnmswell共培養(yǎng)?；旌鲜焦才?養(yǎng)，無法將兩種或多種細胞區(qū)分開；微載體共培養(yǎng)，細胞相互作用時間受限，一般小于 4小時；而對于采用Tnmswell這種套皿式的共培養(yǎng)方法，無法實時監(jiān)測細胞響應，只能 獲得最終結(jié)果，有可能缺失大量的生物學信息。以上三種方法均存在試劑消耗量大，細 胞用量多，無法實現(xiàn)流體控制等諸多缺點。
微流控芯片實驗室又稱芯片實驗室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片 (Microfluidic),指的是把化學和生物等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測、 細胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的 芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡，以可控流體貫穿整個系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學或生物實驗 室的各種功能的一種技術。微流控芯片技術正逐步向生物醫(yī)學領域滲透，并顯示了廣闊 的應用前景。其特有的微尺寸特征與細胞大小相匹配，加之芯片靈活的設計和規(guī)模集成 特征，非常適合進行細胞功能研究。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種微流控芯片及其研究非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法。 利用該微流控芯片可為非接觸式細胞共培養(yǎng)提供良好的微環(huán)境，并在細胞遷移區(qū)域形成 穩(wěn)定的濃度梯度，能夠?qū)崟r觀測細胞遷移過程，并進行轉(zhuǎn)分化研究。
本發(fā)明提供了一種微流控芯片，該微流控芯片由進樣口(1)、細胞培養(yǎng)室O)、 細胞遷移區(qū)域C3)及廢液池(4)組成；細胞培養(yǎng)室的上端與進樣口相連，下端連接廢液 池；三個平行的細胞培養(yǎng)室通過細胞遷移區(qū)域相連，細胞培養(yǎng)室高度高于細胞遷移區(qū) 域。
本發(fā)明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下兩層可逆封接而成，上層材 料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。
本發(fā)明還提供了基于所述微流控芯片研究非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，方法過 程如下
(1)濃度梯度表征將異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒光染料包埋在BME中，通過進樣口將其加入細胞培養(yǎng)室C，其余細胞培養(yǎng)室只加入等量α-MEM培養(yǎng)液；
( 細胞加樣通過右側(cè)進樣口將第一種細胞加入細胞培養(yǎng)室C，放置于(02培 養(yǎng)箱內(nèi)；待細胞貼壁6-24h后，通過中間進樣口將第二種細胞加入細胞培養(yǎng)室B;作為 空白對照左側(cè)培養(yǎng)室A不加入細胞，細胞培養(yǎng)液每天更換一次；
(3)活性考察用H0eChst33342和碘化丙啶表征培養(yǎng)兩天后細胞的生長狀態(tài)及活性。
本發(fā)明提供的非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，所述BME為基底膜樣物質(zhì)，低溫時 為液態(tài)，室溫時凝固成膠態(tài)；所述細胞遷移區(qū)域的濃度梯度用異硫氰酸熒光素標記的葡 聚糖分子(FITC-dextran)(分子量為10000D)表征。
本發(fā)明提供的非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，在加入細胞時，細胞不會串流到遷 移區(qū)域；待細胞貼壁后才進入遷移區(qū)域。
本發(fā)明提供的非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，在芯片上可以同時進行兩種細胞共 培養(yǎng)的遷移和轉(zhuǎn)分化檢測；該微流控芯片具有三個細胞培養(yǎng)室，可以分別加入不同種類 的細胞，進行三種細胞共培養(yǎng)的遷移和轉(zhuǎn)分化檢測。
總之，本發(fā)明可在一塊幾平方厘米的芯片上，為非接觸式細胞共培養(yǎng)研究提供 良好的微環(huán)境，在細胞遷移區(qū)域生成穩(wěn)定的濃度梯度，在一種細胞分泌的細胞因子的作 用下，可誘導另一種細胞發(fā)生定向移動及轉(zhuǎn)分化。本發(fā)明具有操作簡單、制作簡單和樣 品用量少等特點。具有重要的生物醫(yī)學研究價值和經(jīng)濟價值。


圖1本發(fā)明微流控芯片示意圖，其中(a)芯片上層；(b)芯片下層，(c)芯片整 體結(jié)構(gòu)圖；(1)進樣口、(2)細胞培養(yǎng)室、(3)細胞遷移區(qū)域、(4)廢液池；
圖2顯示細胞培養(yǎng)遷移區(qū)域內(nèi)的熒光信號；
圖3細胞遷移區(qū)域生成的穩(wěn)定熒光濃度梯度；
圖4成纖維細胞HFL-I，胃黏膜上皮細胞GES_1，肝癌細胞HepG-2在微流控芯 片上生長狀態(tài)及活性檢測；
圖5成纖維細胞HFL-I在空白對照，胃黏膜上皮細胞GES-1，肝癌細胞HepG-2 誘導下發(fā)生遷移；
圖6成纖維細胞HFL-I在胃黏膜上皮細胞GES_1的誘導下發(fā)生的遷移面積；
圖7成纖維細胞HFL-I在肝癌細胞HepG-2的誘導下發(fā)生的遷移面積；
圖8成纖維細胞HFL-I在口腔癌細胞ACC-2誘導下發(fā)生的遷移面積；
圖9成纖維細胞HFL-I在口腔癌細胞ACOM的誘導下發(fā)生的遷移面積；
圖10成纖維細胞HFL-I單獨培養(yǎng)環(huán)境下α -SMA的表達；
圖11成纖維細胞HFL-I在胃黏膜上皮細胞GES_1的誘導下α -SMA的表達；
圖12成纖維細胞HFL-I在肝癌細胞HepG_2的誘導下α -SMA的表達。
具體實施方式
下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
實施例14
所用微流控芯片為本實驗室自行設計及制備。芯片由上下兩層可逆封接而成， 上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。如圖1所示，三個平行的細胞培養(yǎng)室尺寸 為長6mm，寬1mm，高50 μ m，細胞遷移區(qū)域尺寸為長1mm，寬500 μ m，高50 μ m。 通過右側(cè)進樣口將肝癌細胞HepG-2加入細胞培養(yǎng)室C，輕輕放置于37°C的CO2培養(yǎng)箱 內(nèi)；待細胞貼壁后，通過中間進樣口將成纖維細胞HFL-I加入細胞培養(yǎng)室B;作為空白 對照左側(cè)培養(yǎng)室A不加入細胞，加入與B，C等量的細胞培養(yǎng)液。
采用Hoechst33342和PI聯(lián)合檢測三種細胞(HepG-2、GES-U HFL-I)的活性， 結(jié)果顯示三種細胞在該芯片上的成活率均大于90% (圖4)。
與空白對照側(cè)HFL-I細胞遷移相比，《!和48h時，HFL_I細胞遷移更趨向于肝 癌細胞HepG-2 (圖5)。而在正常細胞GES-I誘導下實驗側(cè)的HFL-I細胞遷移面積與對 照側(cè)沒有顯著差異(圖6)。在肝癌細胞HepG-2誘導下實驗側(cè)的HFL-I細胞遷移面積與 對照側(cè)存在顯著差異。
實施例2
將異硫氰酸熒光素(FITC)標記的熒光染料包埋在BME中，通過進樣口將其加 入細胞培養(yǎng)室C，其余細胞培養(yǎng)室加入等量α-MEM培養(yǎng)液，一段時間后，細胞遷移區(qū) 域出現(xiàn)熒光信號(圖幻，數(shù)據(jù)分析顯示細胞遷移區(qū)域形成穩(wěn)定的熒光濃度梯度(圖3)。
通過右側(cè)進樣口將正常細胞GES-I加入細胞培養(yǎng)室C，輕輕放置于37°C的CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)；待細胞貼壁后，通過中間進樣口將成纖維細胞HFL-I加入細胞培養(yǎng)室B;作 為空白對照左側(cè)培養(yǎng)室A不加入細胞，加入與B，C等量的細胞培養(yǎng)液。與空白對照側(cè) HFL-I細胞遷移相比，《!和48h時，HFL-I細胞遷移數(shù)目及面積與空白對照下基本相同 (圖5)。在正常細胞GES-I誘導下實驗側(cè)的HFL-I細胞遷移面積與對照側(cè)沒有顯著差異 (圖 7)。
實施例3
通過右側(cè)進樣口將口腔癌細胞ACC-2/ACC-M加入細胞培養(yǎng)室C，輕輕放置于 37°C的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待細胞貼壁后，通過中間進樣口將成纖維細胞HFL-I加入細胞培 養(yǎng)室B;作為空白對照左側(cè)培養(yǎng)室A不加入細胞，加入與B，C等量的細胞培養(yǎng)液。與 空白對照側(cè)HFL-I細胞遷移相比，在口腔癌細胞ACC-2/ACC-M誘導下實驗側(cè)的HFL-I 細胞遷移面積與對照側(cè)沒有顯著差異(圖8，圖9)。
實施例4
共培養(yǎng)一段時間后，揭掉上層PDMS芯片，對玻璃底片的細胞進行免疫熒光測 定，檢測HFL-I細胞內(nèi)平滑肌肌動蛋白α-SMA的表達。成纖維細胞HFL-I單獨培養(yǎng)環(huán) 境下α -SMA的表達量很少(圖10)，在胃黏膜上皮細胞GES-I的誘導下表達量也較少 (圖11)，但是成纖維細胞HFL-I在肝癌細胞HepG-2的誘導下α -SMA的表達量明顯增 多(圖1幻。
權(quán)利要求
1.一種微流控芯片，其特征在于該微流控芯片由進樣口(1)、細胞培養(yǎng)室(2)、細 胞遷移區(qū)域(3)及廢液池(4)組成；細胞培養(yǎng)室的上端與進樣口相連，下端連接廢液池，三個平行的細胞培養(yǎng)室通過細 胞遷移區(qū)域相連。
2.按照權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下兩層可逆 封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。
3.按照權(quán)利要求1所述微流控芯片，其特征在于所述細胞培養(yǎng)室高度高于細胞遷 移區(qū)域。
4.基于權(quán)利要求1所述微流控芯片研究非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于 方法過程如下(1)濃度梯度表征將FITC標記的熒光染料包埋在BME中，通過進樣口將其加入細 胞培養(yǎng)室C，其余細胞培養(yǎng)室只加入等量α -MEM培養(yǎng)液；(2)細胞加樣通過右側(cè)進樣口將第一種細胞加入細胞培養(yǎng)室C，放置于CO2培養(yǎng)箱 內(nèi)；待細胞貼壁6-24h后，通過中間進樣口將第二種細胞加入細胞培養(yǎng)室B;作為空白 對照左側(cè)培養(yǎng)室A不加入細胞，細胞培養(yǎng)液每天更換一次；(3)活性考察用H0eChst33342和碘化丙啶表征培養(yǎng)兩天后細胞的生長狀態(tài)及活性。
5.按照權(quán)利要求4所述非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于所述BME為基底 膜樣物質(zhì)，低溫時為液態(tài)，室溫時凝固成膠態(tài)。
6.按照權(quán)利要求4所述非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于所述細胞遷移區(qū) 域的濃度梯度用FIEC-dextran分子表征。
7.按照權(quán)利要求4所述非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于在加入細胞時， 細胞不會串流到遷移區(qū)域；待細胞貼壁后才進入遷移區(qū)域。
8.按照權(quán)利要求6所述非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，其特征在于所述FIEC-dextnm 分子的分子量為10000D。
全文摘要
一種微流控芯片及其研究非接觸式細胞共培養(yǎng)的方法，該微流控芯片由進樣口、細胞培養(yǎng)室、細胞遷移區(qū)域及廢液池組成；細胞培養(yǎng)室的上端與進樣口相連，下端連接廢液池，三個平行的細胞培養(yǎng)室通過細胞遷移區(qū)域相連；利用該微流控芯片可為非接觸式細胞共培養(yǎng)提供良好的微環(huán)境，并在細胞遷移區(qū)域形成穩(wěn)定的濃度梯度，能夠?qū)崟r觀測細胞遷移過程，并進行轉(zhuǎn)分化研究；本發(fā)明具有操作方便、制作簡單和樣品用量少等特點。
文檔編號C12M3/00GK102021116SQ20091018756
公開日2011年4月20日 申請日期2009年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月23日
發(fā)明者林炳承, 秦建華, 馬慧朋 申請人:中國科學院大連化學物理研究所