一種微流控芯片及基于微流控芯片的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)儀器，具體的說(shuō)是一種微流控芯片及基于微流控芯片的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明通過(guò)在微流控芯片設(shè)置并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進(jìn)樣口和出樣口以及多個(gè)捕獲細(xì)胞的微腔室；在進(jìn)樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。在細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中，通過(guò)事先將微通道抽成負(fù)壓狀態(tài)，使細(xì)胞樣品自動(dòng)進(jìn)入微通道。本發(fā)明具有制作簡(jiǎn)單，體積小、便于使用、樣品消耗量少、計(jì)數(shù)方便且通量高等特點(diǎn)，可以很好的滿(mǎn)足臨床需求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種微流控芯片及基于微流控芯片的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)儀器，具體的說(shuō)是一種微流控芯片及基于微流控芯片的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞計(jì)數(shù)在生物領(lǐng)域的科學(xué)研究和日常醫(yī)學(xué)診斷過(guò)程中都具有重要意義。在癌癥治療藥物的研發(fā)中，常需考察治癌藥物對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的作用效果，需定量對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；醫(yī)院內(nèi)為對(duì)病人進(jìn)行疾病的排查，需進(jìn)行血常規(guī)的檢查，所以需要對(duì)血液中各類(lèi)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)與分類(lèi)；為考察癌癥病人是否存在癌細(xì)胞擴(kuò)散，也需對(duì)其血液內(nèi)的癌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)；有些感染了結(jié)核的病人并無(wú)癥狀顯示，為了確診其是否被感染，也需對(duì)其血液中結(jié)核桿菌的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)于白血病患者顯得尤為重要，為準(zhǔn)確得知化療過(guò)程中患者體內(nèi)的造血骨細(xì)胞的數(shù)量以隨時(shí)對(duì)治療方案進(jìn)行修正，醫(yī)生需多次對(duì)患者血液中的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。據(jù)以上所述，細(xì)胞尤其是與疾病或癌癥有關(guān)的細(xì)胞的計(jì)數(shù)顯得異常重要，而發(fā)展出能量高、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確且易于操作的便攜式細(xì)胞計(jì)數(shù)器顯得尤為重要。
[0003]目前已有一些細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置，比如流式細(xì)胞儀，通過(guò)細(xì)胞的熒光信號(hào)或非熒光的散射信號(hào)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選和計(jì)數(shù)，這種方法能量大，且能自動(dòng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，但是儀器體積大，價(jià)格高，專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)，所以它的通用性受到很大的限制。除了流式細(xì)胞儀，還有細(xì)胞計(jì)數(shù)板也可用作細(xì)胞計(jì)數(shù)，但是這種方法計(jì)數(shù)速度很慢，消耗人力資源大。因此，目前已有的這些細(xì)胞計(jì)數(shù)方法難以滿(mǎn)足當(dāng)下各領(lǐng)域特別是臨床領(lǐng)域的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)【背景技術(shù)】的不足，本發(fā)明通過(guò)在微流控芯片設(shè)置并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進(jìn)樣口和出樣口以及多個(gè)捕獲細(xì)胞的微腔室；在進(jìn)樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。在細(xì)胞計(jì)數(shù)過(guò)程中，通過(guò)事先將微通道抽成負(fù)壓狀態(tài)，使細(xì)胞樣品自動(dòng)進(jìn)入微通道。本發(fā)明具有制作簡(jiǎn)單，體積小、便于使用、樣品消耗量少、計(jì)數(shù)方便且通量高等特點(diǎn)，可以很好的滿(mǎn)足臨床需求。
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高通量的細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)芯片，具有樣品消耗量少、通量高且操作簡(jiǎn)易的特點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS與基片鍵合在一起，其特征在于:所述的PDMS上包含有并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進(jìn)樣口和出樣口以及多個(gè)捕獲細(xì)胞的微腔室；在進(jìn)樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。
[0007]如上所述的微流控芯片，其特征在于:所述的微流控芯片經(jīng)真空過(guò)程后將整個(gè)產(chǎn)品?封。
[0008]如上所述的微流控芯片，其特征在于:所述的基片為玻璃基片。
[0009]本發(fā)明還公開(kāi)了一種基于微流控芯片的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，包括以下步驟:
步驟一、為目標(biāo)細(xì)胞做熒光標(biāo)記；步驟二、制作細(xì)胞樣品；
步驟三、細(xì)胞進(jìn)樣；
步驟四、圖片獲取及細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)；
其特征在于:所述步驟三細(xì)胞進(jìn)樣的過(guò)程為:將細(xì)胞樣品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成負(fù)壓狀態(tài)，因此細(xì)胞會(huì)自動(dòng)進(jìn)樣至微通道中，大部分細(xì)胞會(huì)停留在微通道的微腔室中。
[0010]如上所述的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述的制作細(xì)胞樣品具體為:采用離心的方法去除上清液，再在離心管中加入磷酸緩沖液，充分吹打后離心，去除上清液，再加入少量磷酸緩沖液即可制得細(xì)胞樣品
如上所述的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述的步驟一是通過(guò)連接有熒光染料的抗體與細(xì)胞表面抗原反應(yīng)后，離心去除過(guò)量的抗體；此處針對(duì)不同細(xì)胞可以選擇不同抗體，且樣品細(xì)胞有多類(lèi)時(shí)，可以同時(shí)選擇幾種帶熒光標(biāo)記的抗體。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)效果體現(xiàn)在:本發(fā)明的微流控芯片具有制作簡(jiǎn)單，體積小、便于使用等特點(diǎn)。本發(fā)明的方法用連接有熒光染料的抗體對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行選擇性標(biāo)記，特異性強(qiáng)；細(xì)胞進(jìn)樣時(shí)，由于微通道已被抽成真空狀態(tài)，因此進(jìn)樣口的細(xì)胞樣品會(huì)自動(dòng)進(jìn)樣；微通道中體積小，所樣品消耗非常少；CCD拍照后可通過(guò)軟件對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)效率高；通過(guò)不同熒光標(biāo)記的抗體可以同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類(lèi)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1微流控芯片掩膜示意圖，白色部分為透光區(qū)域，黑色部分為不透光區(qū)域；
圖2 (A)為微流控芯片陽(yáng)模加工勻膠前烘步驟示意圖；
圖2 (B)為微流控芯片陽(yáng)模加工曝光步驟示意圖；
圖2 (C)為微流控芯片陽(yáng)模加工后烘步驟示意圖；
圖2 (D)為微流控芯片陽(yáng)模加工堅(jiān)模步驟示意圖；
圖3為微流控芯片示意圖；
圖4 (A)所拍細(xì)胞明場(chǎng)圖；
圖4 (B)所拍細(xì)胞暗場(chǎng)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]名稱(chēng)解釋:PDMS為聚二甲基硅氧烷的英文縮寫(xiě) PGMEA為丙二醇甲醚醋酸酯的英文縮寫(xiě)
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明。
[0014]本發(fā)明所述的高通量細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)方法，包括以下步驟:
第一步、為目標(biāo)細(xì)胞做熒光標(biāo)記。將一種或多種連接有熒光染料的抗體加至含有一種或多種目標(biāo)細(xì)胞懸液的離心 管中，充分混合均勻，常溫下孵育10分鐘。
[0015]第二步、采用離心的方法去除上清液，再在離心管中加入磷酸緩沖液，充分吹打后離心，去除上清液，再加入少量磷酸緩沖液即可制得細(xì)胞樣品。本步驟中的離心方法為:離心時(shí)間5分鐘，每分鐘轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)，后續(xù)步驟中將離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速在離心步驟中用括號(hào)標(biāo)注。[0016]第三步、將細(xì)胞樣品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成負(fù)壓狀態(tài)，因此細(xì)胞會(huì)自動(dòng)進(jìn)樣至微通道中，大部分細(xì)胞會(huì)停留在微通道的微腔室中，即細(xì)胞完成進(jìn)樣。
[0017]微流控芯片的PDM S具有透氣性，如果將整個(gè)PDM S放在真空干燥器，抽成真空后，整個(gè)PDMS層一直處于負(fù)壓狀態(tài)。拿出該產(chǎn)品放置在一般的環(huán)境中，該產(chǎn)品還能保持5分鐘至10分鐘的負(fù)壓，只要此時(shí)將細(xì)胞樣品滴加至微流控芯片的入口，細(xì)胞便會(huì)自動(dòng)進(jìn)樣至微通道中。
[0018]第四步、進(jìn)樣后，將芯片靜置約10分鐘，即可在顯微鏡下用C⑶進(jìn)行熒光照片的拍攝。目標(biāo)細(xì)胞帶有熒光，在熒光照片上體現(xiàn)為亮點(diǎn)，而非目標(biāo)細(xì)胞不會(huì)呈現(xiàn)亮點(diǎn)；若同時(shí)存在多類(lèi)目標(biāo)細(xì)胞，則可通過(guò)選取不同濾片組對(duì)相應(yīng)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行熒光照片的采集。最后采用軟件例如Image Pro Plus對(duì)目標(biāo)細(xì)胞(即圖片中的亮點(diǎn))進(jìn)行自動(dòng)計(jì)數(shù)，然而根據(jù)成像區(qū)域的體積和成像區(qū)域內(nèi)的目標(biāo)細(xì)胞數(shù)目即可算出目標(biāo)細(xì)胞的濃度。
[0019]下面通過(guò)一個(gè)具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0020]實(shí)例1:檢測(cè)人血中自免細(xì)胞的數(shù)目。
[0021]人血中含有的白細(xì)胞內(nèi)有部分是自免細(xì)胞，且人與人之間自免細(xì)胞所占白細(xì)胞比例有較大差異，對(duì)自免細(xì)胞數(shù)目的測(cè)定非常重要。自免細(xì)胞表面有CD4抗體，可用連接有熒光素的CD4抗體對(duì)其自免細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)記，然后根據(jù)熒光場(chǎng)下圖片中的亮點(diǎn)個(gè)數(shù)對(duì)自免細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0022]1.細(xì)胞樣品制備
將取到的血液樣本去除紅細(xì)胞，用磷酸緩沖液緩沖液(pH 7.4)懸浮剩下的白細(xì)胞。取出200微升細(xì)胞液，離心(1000轉(zhuǎn)每分鐘，離心5分鐘)，去除上清液；加入50微升磷酸緩沖液緩沖液，加入10微升標(biāo)記物(熒光素連接的⑶4抗體),混勻,常溫孵育15分鐘后，離心(1200轉(zhuǎn)每分鐘，離心10分鐘)，去除上清液；加入I毫升磷酸緩沖液緩沖液，輕輕混勻，離心(1200轉(zhuǎn)每分鐘，離心10分鐘)，去除上清液；再加入200微升磷酸緩沖液緩沖液制得最后的細(xì)胞樣品。
[0023]2.微流控芯片及其制作工藝。
[0024]本發(fā)明的微流控芯片包括PDMS和玻璃基片，PDMS與玻璃基片鍵合在一起，所述的PDMS上包含有并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進(jìn)樣口和出樣口以及多個(gè)捕獲細(xì)胞的微腔室；在進(jìn)樣孔口處打孔，出樣口處不打孔；在進(jìn)樣前將陣列式微通道抽成真空狀態(tài)；進(jìn)樣時(shí)，滴加于進(jìn)樣口的細(xì)胞即可自動(dòng)進(jìn)入微通道中。
[0025]為了便于微流控芯片的使用，在產(chǎn)品制作完成后，將其放置在真空干燥器中，抽成真空后，使整個(gè)PDM S層一直處于負(fù)壓狀態(tài)，然后將整個(gè)產(chǎn)品密封。使用時(shí)，只要撕開(kāi)密封袋，將細(xì)胞樣品滴加至微流控芯片的入口，細(xì)胞便會(huì)自動(dòng)進(jìn)樣至微通道中。
[0026]2.1掩膜制作
使用AutoCAD軟件對(duì)掩模圖形進(jìn)行設(shè)計(jì)，采用25400 dpi激光打印機(jī)將設(shè)計(jì)好的掩模圖形打印在菲林膠片上，本研究PDMS陣列式細(xì)胞檢測(cè)裝置使用的AutoCAD掩模圖形如圖1所示，圖中黑色部分為不透光區(qū)域，白色部分為透光區(qū)域即微通道區(qū)域，包括六條并列的微通道，每條微通道含有六個(gè)微腔室。掩膜的功能在于區(qū)分圖形區(qū)和非圖形區(qū)，在光照時(shí)實(shí)現(xiàn)光刻膠的局部曝光，從而將掩模設(shè)計(jì)的圖形轉(zhuǎn)移到光刻膠層。本實(shí)施例中的光刻膠選取SU-8光刻膠。
[0027]2.2基片清洗及勻膠
如附圖2 (A)所示，勻膠之前，預(yù)備涂光刻膠的硅片(直徑為3英寸)需先經(jīng)丙酮(除油月旨、手印等)、Piranha溶液(濃硫酸與過(guò)氧化氫體積比為3:1)和超純水的嚴(yán)格清洗，并采用高溫(150攝氏度I小時(shí)h或200攝氏度20分鐘)烘干以除去硅片上的吸附水。在硅片中心滴加3毫升的SU-8光刻膠，后置于勻膠機(jī)轉(zhuǎn)盤(pán)的中心位置，使硅片中心與轉(zhuǎn)盤(pán)中心重合，通過(guò)真空抽吸固定硅片，采用勻膠程序(600轉(zhuǎn)每分鐘18秒，然后1500轉(zhuǎn)每分鐘60秒)勻膠，其對(duì)應(yīng)SU-8膠厚度為50微米。勻膠后，涂覆光刻膠的硅片需要平整放置至少I(mǎi)小時(shí)以上進(jìn)行前置，利用SU-8光刻膠的自平整特性，消除勻膠過(guò)程中造成的細(xì)小坑洼或波紋，以使SU-8光刻膠層均勻、平整而無(wú)氣泡。
[0028]整個(gè)陽(yáng)模的制作過(guò)程(包括勻膠、前烘、曝光、后烘、堅(jiān)模五個(gè)工藝步驟)在裝有黃光特種燈管(濾除可見(jiàn)光中的藍(lán)光和紫外的波長(zhǎng))的百級(jí)超凈間(每立方英尺空氣中直徑大于等于0.5微米的塵粒數(shù)小于100個(gè))內(nèi)進(jìn)行。
[0029]2.3 前烘
如附圖圖2 (A)所示，采用以下加熱程序?qū)U-8光刻膠進(jìn)行前烘:從室溫以2攝氏度每分鐘的速度升溫至65攝氏度，在65攝氏度的溫度下保持15分鐘，再以2攝氏度每分鐘的速度升溫至95攝氏度，在95攝氏度的溫度下保持120分鐘后，以2攝氏度每分鐘的速度降溫至室溫。前烘是SU-8陽(yáng)模制作過(guò)程中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。前烘的作用是除去光刻膠內(nèi)的大部分溶劑，同時(shí)使光敏分子在垂直方向上獲得高斯分布，增加光刻膠在基片上的粘著力。前烘不足易導(dǎo)致光刻膠發(fā)軟，在曝光時(shí)粘附掩模，從而污染菲林膠片，且最終不能獲得精細(xì)圖形，甚至在顯影時(shí)漂膠；前烘過(guò)度則會(huì)導(dǎo)致顯影時(shí)間增長(zhǎng)，使得圖形在Z軸上有歧視效應(yīng)。一般來(lái)說(shuō)前烘應(yīng)該緩慢升溫，使膠內(nèi)分子能夠穩(wěn)定擴(kuò)散。
[0030]2.4 曝光
如附圖2 (B)所示，通過(guò)光刻可以將掩模上的圖形轉(zhuǎn)移至光刻膠上。光刻的原理為:經(jīng)過(guò)前置和前烘后，光敏分子均勻分布在光刻膠層，經(jīng)過(guò)紫外光i線(xiàn)(365納米)的照射后，光引發(fā)劑吸收光子發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，生成強(qiáng)酸，在后烘過(guò)程中作為酸性催化劑引發(fā)SU-8光刻膠的交聯(lián)反應(yīng)，每一個(gè)環(huán)氧基都能與同分子或不同分子的其他環(huán)氧基反應(yīng)。交聯(lián)形成的致密交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在其后的顯影過(guò)程中變得惰性而不能被顯影液溶解，微結(jié)構(gòu)部分由此在膠內(nèi)與非結(jié)構(gòu)部分區(qū)分開(kāi)來(lái)。本研究采用90 s的時(shí)間進(jìn)行光刻膠的曝光。
[0031]2.5 后烘
如附圖2 (C)所示，采用以下的加熱程序?qū)杵M(jìn)行后烘:從室溫以2攝氏度每分鐘的速度升溫至65攝氏度，在65攝氏度的溫度下保持15分鐘，再以2攝氏度每分鐘的速度升溫至95攝氏度，在95攝氏度的溫度下保持40分鐘后，以2攝氏度每分鐘的速度降溫至室溫。后烘是為了進(jìn)一步除去光刻膠中的溶劑，促進(jìn)化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，后烘充分能使曝光區(qū)域內(nèi)交聯(lián)反應(yīng)充分，從而在顯影中獲得垂直的微結(jié)構(gòu)。
[0032]2.6顯影和定影
顯影和定影是在硅片上生成圖形的關(guān)鍵步驟。顯影液為PGMEA，定影液為異丙醇，顯影時(shí)間為80秒。顯影和定影的具體操作為:輕輕搖動(dòng)顯影容器使硅片上的光刻膠被均勻溶解，采用異丙醇定影，若顯影不完全，在硅片上將會(huì)呈現(xiàn)白色沉淀物，將其用PGMEA沖洗掉，繼續(xù)顯影，直至再次用異丙醇沖洗時(shí)不再出現(xiàn)白色物質(zhì)，即表明顯影完全，用氮?dú)鈽寣⒐杵蹈珊螅梢院苊黠@的看到設(shè)計(jì)的圖形。顯影對(duì)于光刻膠來(lái)說(shuō)是一個(gè)從外至內(nèi)的過(guò)程，成功顯影的結(jié)果應(yīng)該具有垂直而精細(xì)的邊壁結(jié)構(gòu)。
[0033]2.7 堅(jiān)膜
如附圖2 (D)所示，將顯影后具有微結(jié)構(gòu)的硅片置于真空烘箱中，135攝氏度的溫度下靜置120分鐘，自然冷卻，加固交聯(lián)后的PGMEA在基片上的粘附，此處得到的微結(jié)構(gòu)稱(chēng)為陽(yáng)模。
[0034]上述2.2至2.7的加工過(guò)程示意圖如圖2 (A)至圖2 (D)所示。
[0035]2.8 PDMS 固化
首先將PDMS預(yù)聚體(二甲基硅氧烷單體)和固化劑按照10:1的比例攪拌混勻，置于真空干燥器中真空脫氣后，倒在有圍堰的堅(jiān)膜后的硅片上，置于熱平板上65攝氏度溫度下烘烤4小時(shí)后，PDMS將通過(guò)交聯(lián)反應(yīng)形成有彈性的透明固體。將PDMS從SU-8陽(yáng)模上剝離下來(lái)，在入口處用針頭打孔，從而得到有微通道結(jié)構(gòu)的PDMS基片。將玻璃片與PDMS鍵合即得到PDMS陣列式細(xì)胞檢測(cè)裝置。
[0036]2.9玻璃基片處理
將玻璃基片先用丙酮超聲清洗30分鐘后(除油脂、手印等)，用超純水漂洗后加入Piranha溶液80攝氏度溫度下超聲清洗30分鐘，再用超純水超聲清洗后，置于熱平板上150攝氏度溫度下烘烤I小時(shí)后，除去基片上的吸附水，冷卻至室溫。
[0037]2.10 鍵合
打開(kāi)等離子體清洗器清洗空腔，清除腔內(nèi)雜質(zhì)，并獲得穩(wěn)定氧氣流；將需要鍵和的PDMS和玻璃基片平放入腔內(nèi)，待鍵合的表面朝上放置；抽真空，打開(kāi)高頻電源至600伏，當(dāng)達(dá)到所需真空度時(shí)清洗機(jī)會(huì)起輝(紫紅色)，氧氣流量為600毫升每分鐘，清洗60秒；取出、對(duì)齊、貼合后，置于150分鐘熱平板上靜置30分鐘，使PDMS與玻璃基片鍵合在一起，得到陣列式微流控芯片。
[0038]2.11微通道真空處理
將加工好的微流控芯片放置于真空干燥器中，用外設(shè)真空泵抽真空20分鐘，然后取出微流控芯片，在入口處貼上膠帶以保持微通道內(nèi)負(fù)壓狀態(tài)。
[0039]3.細(xì)胞進(jìn)樣
用移液槍取5微升上述制好的細(xì)胞樣品滴加至微通道的入口處，由于通道中負(fù)壓的存在，細(xì)胞樣品會(huì)自動(dòng)流進(jìn)微通道中。進(jìn)樣后讓將微流控芯片靜置10分鐘。
[0040]4.細(xì)胞成像
將進(jìn)樣好的微流控芯片置于倒置熒光顯微鏡的載物臺(tái)上，在明場(chǎng)和熒光場(chǎng)下，采用20倍物鏡，對(duì)微通道中同一位置的細(xì)胞進(jìn)行明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖片的拍攝。其中，暗場(chǎng)(即熒光圖片)用汞燈作為光源對(duì)熒光素進(jìn)行激發(fā)，濾片組為:激發(fā)濾片460-490納米，二色鏡505納米，發(fā)射濾片510-550納米。
[0041]由于目標(biāo)細(xì)胞標(biāo)記了熒光素，在暗場(chǎng)下為亮點(diǎn)。通過(guò)軟件Image Pro Plus計(jì)算暗場(chǎng)(如圖4 (B))下亮點(diǎn)的個(gè)數(shù)，對(duì)比明場(chǎng)(如圖4 (A))下細(xì)胞的總個(gè)數(shù)，就可得知所拍圖片中目標(biāo)細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例；另外，根據(jù)成像區(qū)域的體積其區(qū)域內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞的個(gè)數(shù)可以推算出細(xì)胞樣品內(nèi)目標(biāo)細(xì)胞的個(gè)數(shù)或濃度。[0042]本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS與基片鍵合在一起，其特征在于:所述的PDMS上包含有并行排列的陣列式微通道，每條微通道包含有進(jìn)樣口和出樣口以及多個(gè)捕獲細(xì)胞的微腔室；在進(jìn)樣孔口處打孔，出樣口處不打孔。
2.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述的微流控芯片經(jīng)真空過(guò)程后將整個(gè)產(chǎn)品密封。
3.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述的基片為玻璃基片。
4.一種基于微流控芯片的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，包括以下步驟: 步驟一、為目標(biāo)細(xì)胞做熒光標(biāo)記； 步驟二、制作細(xì)胞樣品； 步驟三、細(xì)胞進(jìn)樣； 步驟四、圖片獲取及細(xì)胞計(jì)數(shù)與分類(lèi)； 其特征在于:所述步驟三細(xì)胞進(jìn)樣的過(guò)程為:將細(xì)胞樣品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成負(fù)壓狀態(tài)，因此細(xì)胞會(huì)自動(dòng)進(jìn)樣至微通道中，大部分細(xì)胞會(huì)停留在微通道的微腔室中。
5.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述的制作細(xì)胞樣品具體為:采用離心的方法去除上清液，再在離心管中加入磷酸緩沖液，充分吹打后離心，去除上清液，再加入少量磷酸緩沖液即可制得細(xì)胞樣品。
6.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述的步驟一是通過(guò)連接有熒光染料的抗體與細(xì)胞表面抗原反應(yīng)后，離心去除過(guò)量的抗體；此處針對(duì)不同細(xì)胞可以選擇不同抗體，且樣品細(xì)胞有多類(lèi)時(shí)，可以同時(shí)選擇幾種帶熒光標(biāo)記的抗體。
7.如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，其特征在于:所述的微流控芯片為權(quán)利要求1、2或3所述的微流控芯片。
【文檔編號(hào)】G01N15/10GK103611584SQ201310517183
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】馮曉均 申請(qǐng)人:武漢斯坦姆賽爾生物技術(shù)有限公司