專利名稱：一種京尼平的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種京尼平的制備方法，特別涉及一種共固定化 酶和細(xì)胞生物催化桅子苷水解制備京尼平的方法。
背景技術(shù)：
京尼平是由京尼平苷、亦稱桅子苷，經(jīng)葡萄糖苷酶水解后得到的環(huán)烯醚萜類 化合物。京尼平有多種用途，一是可以與氨基酸反應(yīng)生成藍(lán)色素，這種天然藍(lán)色素可以用作 食品添加劑，它無毒、性質(zhì)穩(wěn)定，在國外已經(jīng)得到普遍使用；二是京尼平在醫(yī)學(xué)上可以用作 天然生物交聯(lián)劑，現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)實踐中為了減少生物體對植入異種生物組織或人造替代物 的排斥反應(yīng)，增加生物材料的生物相容性和力學(xué)性能，通常使用交聯(lián)的辦法來達(dá)到目的，傳 統(tǒng)的交聯(lián)劑大部分是化學(xué)合成交聯(lián)劑，如戊二醛、碳化二亞胺、三聚磷酸鈉、環(huán)氧化合物等， 這些合成交聯(lián)劑都具有較大的細(xì)胞毒性，植入生物體后會影響正常組織生長，而京尼平無 毒性且生物相容性好，能形成穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)品；三是京尼平可以用于治療II型糖尿病，研 究表明一種叫線粒體解耦聯(lián)蛋白2 (Uncoupled Protein 2，UCP2)的蛋白對胰島素釋放有抑 制作用，因此如果解除UCP2對胰島素釋放的抑制，可能會促使更多的胰島素釋放，改善部 分II型糖尿病癥狀，京尼平正是這種可以解除UCP2對胰島素釋放抑制的有效成分，因此有 望為臨床上治療II型糖尿病開啟新的紀(jì)元。另外，京尼平還可以用于治療肝臟疾病、降血 壓，以及指紋采集試劑、染色劑等?？傊?，京尼平應(yīng)用范圍廣，開發(fā)潛力大，具有廣闊的市場 前景。目前京尼平的制備方法一般都采用提純后的葡萄糖苷酶來轉(zhuǎn)化桅子苷如 CN 101104745Α ；CN 101396455Α ；CN 101029066Α，再經(jīng)過乙醚萃取，丙酮結(jié)晶的方法制 備，這種方法得到的京尼平產(chǎn)率低、純度不高，投入的酶不能回收，因此成本較高，所以目 前市場上銷售的京尼平價格昂貴。另外，京尼平的制備需要使用大量的有毒有機(jī)溶劑， 對環(huán)境易造成污染；也有利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化桅子苷制備京尼平的報道，如霍蕾，蘇 建，沈競，等，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)2008，20 70-73 ；王永宏，蘇建，王建芳，等.時珍國醫(yī) 國藥，2007，18(12) :3003-3004 ;Meng Meng XU，Qun SUN, Jian SU, et al. Enzyme and MicrobialTechnology, 2008,42 :440_444，但是該方法存在一個比較大的缺陷是，微生物發(fā) 酵時發(fā)酵液中有較多的氨基酸和蛋白類物質(zhì)，當(dāng)桅子苷水解生成京尼平后，京尼平會與氨 基酸發(fā)生反應(yīng)生成藍(lán)色素，大大降低京尼平的收率；國外有報道利用固定化葡萄糖苷 酶轉(zhuǎn)化桅子苷制備京尼平的技術(shù)，如ShigeakiFUJIKAWA，Tomoko Υ0Κ0ΤΑ, Kunimasa KOGA, et al. Biotechnology Letters, 1987,9(10) :697_702，轉(zhuǎn)化率可達(dá) 95% 以上，并且固定化 酶的半衰期長達(dá)600小時，但是該方法需要得到大量的純β -葡萄糖苷酶，因此成本也較 尚ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用微生物發(fā)酵技術(shù)，制備含β -葡萄糖苷酶和細(xì)胞，或和菌絲的發(fā)酵液，
3再將發(fā)酵液直接利用固定化技術(shù)，將β葡萄糖苷酶和細(xì)胞，或和菌絲共固定化制備固定化 酶，然后將桅子苷轉(zhuǎn)化成京尼平，從而完成了本發(fā)明。該方法無須對發(fā)酵液進(jìn)行分離純化， 且制備得到的固定化酶活力高，運(yùn)行時間達(dá)960小時后酶活仍保持50%以上，對環(huán)境污染 小，京尼平產(chǎn)率高，與其他方法相比具有顯著的優(yōu)勢。本發(fā)明的目的在于提供一種采用了共固定化技術(shù)，制備固定化酶和細(xì)胞、或酶和 菌絲生物轉(zhuǎn)化桅子苷制備京尼平的制備方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的它包括固定化酶的制備工藝、桅子苷的轉(zhuǎn)化工藝和 京尼平的分離純化工藝三個部分，將產(chǎn)β “葡萄糖苷酶的菌種發(fā)酵，待達(dá)到產(chǎn)酶高峰后，將 發(fā)酵液收集，用包埋_交聯(lián)結(jié)合的方法共固定化酶和細(xì)胞、或酶和菌絲，制備固定化酶，采 用填充床或攪拌式反應(yīng)器對桅子苷進(jìn)行催化水解反應(yīng)，經(jīng)純化后得到京尼平。京尼平是利用β -葡萄糖苷酶對京尼平苷(亦稱桅子苷)進(jìn)行水解后得到的環(huán)烯 醚萜類化合物，其結(jié)構(gòu)式和水解過程如圖1所示。用產(chǎn)葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株如黑曲 霉、米根霉、宇佐美曲霉等發(fā)酵，制得發(fā)酵液和菌絲，采用共固定化法，通過交聯(lián)-包埋結(jié)合 制備固定化酶，此方法無須對酶進(jìn)行分離純化，降低了生產(chǎn)成本。我們分別使用了攪拌式和 填充床式固定化酶對桅子苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果是轉(zhuǎn)化率都在95 %以上，但攪拌式固定化酶的 使用壽命大大縮短，原因在于攪拌式反應(yīng)器對固定化酶的活性有較大影響。各部分工藝為(1)固定化酶的制備工藝將產(chǎn)β -葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株發(fā)酵，發(fā)酵好的菌液連 同細(xì)胞或菌絲一起采用共固定化法固定，即在發(fā)酵液中加入終濃度為0. 05% -2%的交聯(lián) 材料，然后用終濃度為0. 05%-2%的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，再用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，然后逐滴 加入到氯化鈣溶液中硬化，制成小球狀的固定化酶顆粒；(2)桅子苷的轉(zhuǎn)化工藝?yán)霉潭ɑ割w粒，采用攪拌式或填充床式進(jìn)行桅子苷 的轉(zhuǎn)化，在填充床中桅子苷溶液以每小時0. 1-3個柱體積的流速通過固定化酶床，轉(zhuǎn)化溫 度為45-55°C，即得到京尼平溶液，桅子苷的轉(zhuǎn)化率在95%以上；如果采用攪拌式轉(zhuǎn)化，則 將桅子苷溶液與固定化酶混合，在45-55°C溫度下以一定的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行轉(zhuǎn)化，攪拌轉(zhuǎn)速以 50-200r/min為最佳，轉(zhuǎn)化時間以2_6小時為最佳，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%以上。我們對共固定化與單純固定化酶進(jìn)行了比較，即采用兩種不同方法固定化后的酶 分別用填充床式反應(yīng)器對桅子苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，桅子苷濃度為1%，用乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié) 溶液PH值為4.5，以讓￥/虹 ￥指柱體積)流速通過固定化酶床，一定時間后各取出Ig固 定化酶進(jìn)行酶活力測定，酶活力測定方法采用PNPG法(梁華正，劉富梁，彭玲西，等.食品 科學(xué)，2006,4:182-185)，結(jié)果表明，共固定化酶和細(xì)胞、或酶和菌絲酶活半衰期明顯長于普 通固定化酶，具體結(jié)果見下表1 表1共固定化與單純固定化酶在轉(zhuǎn)化一定時間后取出測定的酶活結(jié)果 由表1可知，共固定化酶半衰期達(dá)到960hr左右，高于普通固定化方法的酶活半衰 期。并且共固定化酶在前120hr酶活變化都較小，原因在于共固定化法制得的固定化酶中 包含有產(chǎn)酶活細(xì)胞或菌絲，這些細(xì)胞被包埋后還處于活性狀態(tài)，仍然具有產(chǎn)酶能力。(3)京尼平的分離純化工藝將京尼平轉(zhuǎn)化液經(jīng)大孔樹脂吸附，洗脫，再濃縮、干 燥、結(jié)晶，即可得京尼平產(chǎn)品，其高效液相色譜圖如圖2所示。以京尼平對照品(購于日本 Wako公司)的高效液相色譜峰面積制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算結(jié)果表明，用本方法制備的京尼平 含量達(dá)到98. 65%。(4)京尼平的收率取含量為95%的桅子苷100克，用pH為4. 5的乙酸-乙酸鈉 緩沖液溶解成濃度為1. 5%的溶液，另采用本發(fā)明方法共固定化制備固定化酶和細(xì)胞、或酶 和菌絲500克，將酶裝柱后置于50°C預(yù)熱，然后用緩沖液沖洗至檢測不出氨基酸(用京尼 平顯色法檢測，參考梁華正，廖夫生，樂長高，等.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006 (3) 467-470) 后，再將桅子苷溶液以lBV/hr的流速通過固定化酶床，將轉(zhuǎn)化液用HPD100大孔吸附樹脂吸 附，經(jīng)洗脫、濃縮、結(jié)晶、干燥后得到粉末狀京尼平46. 82克，用HPLC法檢測京尼平含量為 96. 26%，京尼平收率計算公式為收率=[(京尼平質(zhì)量X京尼平含量)/(桅子苷質(zhì)量X 桅子苷含量)]/ (226. 23/388. 36)，計算得收率為81. 45 %。本發(fā)明實施時包括如下步驟(1)將產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株發(fā)酵48-150小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取 出，直接加入終濃度為0. 1% -2%交聯(lián)材料，和終濃度為0. 1% -2%的交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)， 交聯(lián)時間為0. 5-4小時，交聯(lián)溫度為4-20°C，或?qū)Πl(fā)酵液連同菌絲進(jìn)行濃縮后再交聯(lián)；所述的產(chǎn)葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株為黑曲霉、米根霉、或宇佐美曲霉；所述交聯(lián)材料為殼聚糖或明膠；所述交聯(lián)劑為戊二醛、碳化二亞胺、三聚磷酸鈉、或環(huán)氧化合物；(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為-6% ；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度0. 5% -8%, 制備固定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在0. 1% 的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬 化時間為1-3小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)將固定化酶濕法裝柱，再用去離子水配制0. -5%的桅子苷溶液，用乙 酸_乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液PH為4. 5，以每小時0. 1-3個柱體積的流速將桅子苷溶液通過 固定化酶柱床，酶解溫度為50°C ；(7)將轉(zhuǎn)化液用大孔吸附樹脂吸附，經(jīng)洗脫、濃縮、低溫干燥得到粉末狀京尼平，純 度可達(dá)95%左右，再經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá)98%以上；
所述的百分比為重量百分比。采用分子量為6000至30000的中空纖維超濾器對發(fā)酵液連同菌絲進(jìn)行濃縮，濃縮 至原體積的六分之一至二分之一。本發(fā)明采用共固定化酶和細(xì)胞、或酶和菌絲的方法，只需要將發(fā)酵好的發(fā)酵液連 同細(xì)胞或菌絲一起交聯(lián)-包埋，不僅延長了固定化酶的使用時間，還大大降低了成本，克服 了以往使用純酶轉(zhuǎn)化桅子苷成本高、效率低、分離困難的缺點。其實用性和優(yōu)越性具體表現(xiàn) 在以下三個方面一是發(fā)酵液無須分離，制備固定化酶成本低；二是共固定化酶和細(xì)胞、或 酶和菌絲得到的酶活性高，半衰期長；三是固定化酶經(jīng)裝柱后用緩沖液沖洗可以有效地棄 除氨基酸、蛋白質(zhì)等，轉(zhuǎn)化液不會發(fā)生綠變，提高了京尼平的得率。


圖1、本發(fā)明桅子苷經(jīng)β -葡萄糖苷水解成京尼平的反應(yīng)式。圖2、本發(fā)明純化后京尼平的高效液相色譜圖。圖2中的色譜條件為Hypersil ODS C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)色譜柱，流動相為甲 醇水(22 78)，流速為l.Oml/min，檢測波長238nm。
具體實施例方式本發(fā)明可以通過發(fā)明內(nèi)容中說明的技術(shù)具體實施，通過下面的實施例可以對本發(fā) 明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實施例，所述的百分比為重量百分 比實施例1(1)將產(chǎn)酶黑曲霉菌株發(fā)酵96小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取出，采用分子量為 6000的中空纖維超濾器對其進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的三分之一左右，加入終濃度為 的明膠和終濃度為0. 25%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時間為1小時，交聯(lián)溫度為10°C ；(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為3% ；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度3%，制備固 定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在0. 5%的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬化時 間為2小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)將固定化酶濕法裝柱，再配制的桅子苷溶液，用乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié) 溶液PH為4. 5，以每小時0. 5個柱體積的流速將桅子苷溶液通過固定化酶柱床，酶解溫度為 50 0C ；(7)將轉(zhuǎn)化液用型號HPD-IOO等大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附；用去離子水沖洗樹脂至 無色液體流出，再用濃度為35%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，得到膏狀的 京尼平，再冷凍干燥得到粉末狀京尼平，純度可達(dá)95%左右。經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá) 98%以上。實施例2(1)將產(chǎn)酶宇佐美曲霉菌株發(fā)酵120小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取出，采用分子量為30000的中空纖維超濾器對其進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的五分之一左右，加入終濃度 為0. 5%殼聚糖和終濃度為0. 5%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時間為2小時，交聯(lián)溫度為20°C;(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為3% ；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度3%，制備固 定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在0. 5%的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬化時 間為3小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)將固定化酶濕法裝柱，再配制2%的桅子苷溶液，用乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié) 溶液PH為4. 5，以每小時0. 3個柱體積的流速將桅子苷溶液通過固定化酶柱床，酶解溫度為 50 0C ；(7)將轉(zhuǎn)化液用型號HPD-200樹脂進(jìn)行吸附；用去離子水沖洗樹脂至無色液體流 出，再用濃度為35 %乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，得到膏狀的京尼平，再冷 凍干燥得到粉末狀京尼平，純度可達(dá)95%左右。經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá)98%以上。實施例3(1)將產(chǎn)酶米根霉菌株發(fā)酵96小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取出，加入終濃度為 2%明膠和終濃度為的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時間為1小時，交聯(lián)溫度為10°C ；(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為3% ；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度4%，制備固 定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在0. 5%的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬化時 間為2小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)將固定化酶濕法裝柱，再配制2%的桅子苷溶液，用乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié) 溶液PH為4. 5，以每小時1. 5個柱體積的流速將桅子苷溶液通過固定化酶柱床，酶解溫度為 50 0C ；(7)將轉(zhuǎn)化液用型號HPD-100樹脂進(jìn)行吸附；用去離子水沖洗樹脂至無色液體流 出，再用濃度為35 %乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，得到膏狀的京尼平，再冷 凍干燥得到粉末狀京尼平，純度可達(dá)95%左右。經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá)98%以上。實施例4(1)將產(chǎn)酶黑曲霉菌株發(fā)酵96小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取出，加入終濃度為 殼聚糖和終濃度為0. 25%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時間為1小時，交聯(lián)溫度為10°C ；(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為4% ；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度5%，制備固 定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬化時間 為3小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)配制0. 5%的桅子苷溶液5升，用乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH為4. 5，加入固定化酶1kg，置于50°C恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行水解轉(zhuǎn)化5小時；(7)將轉(zhuǎn)化液用型號HPD-200樹脂進(jìn)行吸附；用去離子水沖洗樹脂至無色液體流 出，再用濃度為35%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，得到膏狀的京尼平，再低 溫干燥得到粉末狀京尼平，純度可達(dá)95%左右。經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá)98%以上。實施例5(1)將產(chǎn)酶黑曲霉菌株發(fā)酵120小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取出，加入終濃度為 明膠和終濃度為0. 25%的戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時間為1. 5小時，交聯(lián)溫度為15°C ；(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為3% ；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度4%，制備固 定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在0.5%的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬化時 間為2小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)配制0. 5%的桅子苷溶液10升，用乙酸-乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH為4. 5，加 入固定化酶2kg，置于50°C恒溫水浴鍋內(nèi)進(jìn)行水解轉(zhuǎn)化6小時；(7)將轉(zhuǎn)化液用型號HPD-100樹脂進(jìn)行吸附；用去離子水沖洗樹脂至無色液體流 出，再用濃度為35 %乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；將洗脫液濃縮，得到膏狀的京尼平，再冷 凍干燥得到粉末狀京尼平，純度可達(dá)95%左右。經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá)98%以上。
權(quán)利要求
一種京尼平的制備方法，它包括固定化酶的制備工藝、梔子苷的轉(zhuǎn)化工藝和京尼平的分離純化工藝三個部分，其特征在于將產(chǎn)β 葡萄糖苷酶的菌種發(fā)酵，待達(dá)到產(chǎn)酶高峰后，將發(fā)酵液收集，用包埋 交聯(lián)結(jié)合的方法共固定化酶和細(xì)胞、或酶和菌絲，制備固定化酶，采用填充床或攪拌式反應(yīng)器對梔子苷進(jìn)行催化水解反應(yīng)，經(jīng)純化后得到京尼平。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種京尼平的制備方法，其特征在于各部分工藝為(1)固定化酶的制備工藝將產(chǎn)葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株發(fā)酵，發(fā)酵好的菌液連同細(xì) 胞或菌絲一起采用共固定化法固定，即在發(fā)酵液中加入終濃度為0. 05% -2%的交聯(lián)材料， 然后用終濃度為0. 05% -2%的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，再用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，然后逐滴加入到 氯化鈣溶液中硬化，制成小球狀的固定化酶顆粒；(2)桅子苷的轉(zhuǎn)化工藝?yán)霉潭ɑ割w粒，采用攪拌式或填充床式進(jìn)行桅子苷的轉(zhuǎn) 化，在填充床中桅子苷溶液以每小時0. 1-3個柱體積的流速通過固定化酶床，轉(zhuǎn)化溫度 為45-55°C，即得到京尼平溶液，桅子苷的轉(zhuǎn)化率在95%以上；如果采用攪拌式轉(zhuǎn)化，則將 桅子苷溶液與固定化酶混合，在45-55°C溫度下以一定的攪拌轉(zhuǎn)速進(jìn)行轉(zhuǎn)化，攪拌轉(zhuǎn)速以 50-200r/min為最佳，轉(zhuǎn)化時間以2_6小時為最佳，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%以上。(3)京尼平的分離純化工藝將京尼平轉(zhuǎn)化液經(jīng)大孔樹脂吸附，洗脫，再濃縮、干燥、結(jié) 晶，即可得京尼平產(chǎn)品；所述的百分比為重量百分比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種京尼平的制備方法，其特征在于它包括如下步驟(1)將產(chǎn)葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株發(fā)酵48-150小時，將發(fā)酵液連同菌絲一起取出，直 接加入終濃度為0. -2%交聯(lián)材料，和終濃度為0. -2%的交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)時 間為0. 5-4小時，交聯(lián)溫度為4-20°C，或?qū)Πl(fā)酵液連同菌絲進(jìn)行濃縮后再交聯(lián)；所述的產(chǎn)葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株為黑曲霉、米根霉、或宇佐美曲霉；所述交聯(lián)材料為殼聚糖或明膠；所述交聯(lián)劑為戊二醛、碳化二亞胺、三聚磷酸鈉、或環(huán)氧化合物；(2)將交聯(lián)后的酶和菌絲液用海藻酸鈉進(jìn)行包埋，海藻酸鈉濃度為-6%；(3)將包埋好的混合液逐滴加入氯化鈣溶液中進(jìn)行固定，氯化鈣濃度0.5% -8%，制備 固定化酶小球；(4)將制備的固定化酶小球置于室溫在0.1% -1%的氯化鈣溶液中進(jìn)行硬化，硬化時 間為1-3小時；(5)過濾硬化好的固定化酶，置于4°C下保存?zhèn)溆茫?6)將固定化酶濕法裝柱，再用去離子水配制0.1% -5%的桅子苷溶液，用乙酸-乙酸 鈉緩沖液調(diào)節(jié)溶液PH為4. 5，以每小時0. 1-3個柱體積的流速將桅子苷溶液通過固定化酶 柱床，酶解溫度為50°C ；(7)將轉(zhuǎn)化液用大孔吸附樹脂吸附，經(jīng)洗脫、濃縮、低溫干燥得到粉末狀京尼平，純度可 達(dá)95%左右，再經(jīng)重結(jié)晶后京尼平純度可達(dá)98%以上；所述的百分比為重量百分比。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種京尼平的制備方法，其特征在于采用分子量為6000至 30000的中空纖維超濾器對發(fā)酵液連同菌絲進(jìn)行濃縮，濃縮至原體積的六分之一至二分之全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種京尼平的制備方法，它包括固定化酶的制備工藝、梔子苷的轉(zhuǎn)化工藝和京尼平的分離純化工藝三個部分，其特征在于將產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種發(fā)酵，待達(dá)到產(chǎn)酶高峰后，將發(fā)酵液收集，用包埋-交聯(lián)結(jié)合的方法共固定化酶和細(xì)胞、或酶和菌絲，制備固定化酶，采用填充床或攪拌式反應(yīng)器對梔子苷進(jìn)行催化水解反應(yīng)，經(jīng)純化后得到京尼平。本發(fā)明無須對發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，且制備得到的固定化酶活力高，運(yùn)行時間達(dá)960小時后酶活仍保持50％以上，對環(huán)境污染小，京尼平產(chǎn)率高，與其他方法相比具有顯著的優(yōu)勢。
文檔編號C12R1/66GK101899484SQ20091018681
公開日2010年12月1日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者唐伯辰, 徐尤智, 曾彥雯, 梁華正, 謝鍵泓, 賀玉蘭, 陳賀 申請人:撫州市臨川之信生物科技有限公司