專利名稱：腫瘤細(xì)胞生長因子依賴性的抑制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及孕酮受體抑制劑用于抑制腫瘤細(xì)胞生長因子依賴性的用途。
乳癌的發(fā)展涉及雌二醇和孕酮。然而，在診斷時(shí)，只有約1/3的腫瘤顯示類固醇激素依賴性。推測在多數(shù)類固醇激素抗性腫瘤中，局部作用的自分泌或旁分泌肽生長因子的增殖控制被取代。在這種狀況下，生長因子受體陽性且類固醇激素抗性的預(yù)后極差的擴(kuò)散腫瘤出現(xiàn)(Elledge等，Semin.Onkol.，19(1992)，244-253)。
生長因子在結(jié)合到細(xì)胞表面上的高親和酪氨酸激酶受體上之后，通過激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。最近的發(fā)現(xiàn)表明，由于表皮生長因子(EGF)的促有絲分裂作用，乳腺癌細(xì)胞可以被孕酮敏化(Groshong等，Mol.Endocrinol.11(1997)，1593-1607)。因而，例如在人乳腺癌細(xì)胞系T47D中，孕酮可能誘導(dǎo)S-期細(xì)胞的發(fā)作，伴有細(xì)胞周期蛋白1D和細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶4的活性的瞬時(shí)提高。生長刺激限于單循環(huán)，然而，其后是第二循環(huán)的G1/S轉(zhuǎn)換的生長停止(Groshong等(1997)，上述Musgrove等，Mol.Cell.Biol.13(1993)，3577-3587)。在其被孕酮停止的情況下，細(xì)胞對(duì)EGF的增殖作用敏感。另外還顯示，孕酮通過提高(ramping up)EGFR、Erb2和Erb3而增強(qiáng)EGF對(duì)T47D細(xì)胞的作用，并增加信號(hào)分子的酪氨酸磷酸化(Lange等，J.Biol.Chem.273(1998)，31308-31316；Richer等，J.Biol.Chem.273(1998)，31317-31326)。相反，至今仍然沒有可能通過影響孕酮受體而顯示EGF對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的抑制。
在導(dǎo)致本發(fā)明的試驗(yàn)的范圍內(nèi)，驚人地發(fā)現(xiàn)孕酮受體抑制劑，如17α-氟烷基類固醇能夠至少部分抑制生長因子如EGF結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上，尤其是結(jié)合到具有孕酮受體的高和/或組成性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞上。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是孕酮受體抑制劑用于生產(chǎn)抑制生長因子結(jié)合于腫瘤細(xì)胞，特別是抑制由生長因子產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞或腫瘤的增殖的試劑的用途。根據(jù)本發(fā)明，孕酮受體抑制劑優(yōu)選是競爭性抑制孕酮與其受體結(jié)合的物質(zhì)。在本案中，孕酮受體抑制劑優(yōu)選選自17α-氟烷基類固醇，如它們在例如WO98/34947中得到描述。這些17α-氟烷基類固醇具有如下通式I 其中R1表示甲基或乙基；R2表示式CnFmHo的基，其中n＝2、3、4、5或6，m＞1并且m+o＝2n+1；R3表示自由的、醚化的或酯化的羥基；R4和R5各自代表氫原子，一起代表附加的鍵或亞甲基；St表示部分結(jié)構(gòu)式A、B或C的類固醇ABC-環(huán)系統(tǒng)
其中R6表示氫原子、直鏈C1-C4烷基或支鏈C3-C4烷基或鹵素原子；R7表示氫原子、直鏈C1-C4烷基或支鏈C3-C4烷基，或者，如果St表示類固醇ABC-環(huán)系統(tǒng)A或B，則此外R6和R7一起表示附加的鍵；X表示氧原子，羥氨基＝N-OH或兩個(gè)氫原子；R8表示Y基或任選地在幾個(gè)位置被基團(tuán)Y取代的芳基，其中Y是氫原子、鹵素原子、-OH、-NO2、-N3、-CN、-NR9aR9b、-NHSO2R9、-CO2R9、C1-C10烷氧基、C1-C10鏈烷酰氧基、苯甲酰氧基-C1-C10鏈烷?；?、C1-C10羥烷基或苯甲?；磺襌9a和R9b相同或不同，與R9一樣，表示氫原子或C1-C10烷基，NR9aR9b基還包括它們的與酸的生理相容鹽，R9表示氫的CO2R9基還包括它們的與堿的生理相容鹽。
這種孕酮受體抑制劑的特別優(yōu)選的實(shí)例是化合物11β-(4-乙酰苯基)-17β-羥基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)-雌-4，9-二烯-3-酮(以下稱化合物A)。然而，此外，其他抗孕酮，例如11β-[p-(二甲氨基)苯基]-17α-羥基-17-(3-羥丙基)-13α-雌-4，9-二烯-3-酮)也是適宜的。
孕酮受體抑制劑的作用特別地在具有高和/或組成性孕酮受體表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的情況下發(fā)現(xiàn)，例如在孕酮受體陽性的乳腺癌細(xì)胞系T47D中發(fā)現(xiàn)(Sartorius等，Cancer Res.54(1994)，3668-3877)。
孕酮受體抑制劑抑制孕酮誘導(dǎo)的生長因子，尤其是結(jié)合EGF受體家族如EGF受體的生長因子表達(dá)的增強(qiáng)。這些抑制劑特別優(yōu)選地抑制EGF與人乳腺癌細(xì)胞的結(jié)合。
因此，根據(jù)本發(fā)明，孕酮受體抑制劑能夠用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人的腫瘤治療，具體而言，尤其是用于阻斷腫瘤的發(fā)展，特別是阻斷乳腺癌從類固醇依賴性生長到生長因子依賴性生長。以這種方式，腫瘤的有效治療可以在類固醇依賴性生長階段進(jìn)行，例如通過抗雌激素，腫瘤不能發(fā)展到生長因子依賴性生長階段，后者與患者預(yù)后的顯著惡化有關(guān)。在生長因子依賴性生長階段，孕酮受體抑制劑給藥也可以減緩腫瘤的生長。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，可以使用非類固醇抗雌激素，如他莫昔芬和萘福昔定，以及雷洛昔芬和EM800。后面提及的兩種抗雌激素是稱為SERM(選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)的代表；同時(shí)，根據(jù)本發(fā)明也可以使用其他與SERMS作用相似的化合物，例如在PCT/EP99/05093中提及的化合物，在后者中特別是化合物5-(4-{5-[(RS)-4，4，5，5，5-五氟戊基]亞磺酰}-戊氧基)苯基)-6-苯基-8，9-二氫-7H-苯并環(huán)庚烯-2-醇。
類固醇抗雌激素的實(shí)例包括在EP 0 348 341中公開的那些，尤其是呋維司曲，以及在WO98/07740中公開的那些，尤其是11β-氟-7α-{5-[N-甲基-N-3-(4，4，5，5，5-五氟戊硫基-丙氨基)-戊基]-雌-1，3，5(10)三烯-3，17β-二醇，或在WO99/33855中公開的那些，特別是11β-氟-7α-{5-[甲基-(7，7，8，8，9，9，10，10，10-九氟-癸基)-氨基]-戊基}-雌-1，3，5(10)三烯-3，17β-二醇或其藥學(xué)相容的衍生物或類似物。具有抗雌激素作用的芳香酶抑制劑，如在EP 0 495 825 B1的第7-8頁中描述的那些，同樣可以用作抗雌激素。
孕酮受體抑制劑的給藥可以根據(jù)常規(guī)使用的方法進(jìn)行，例如局部給藥、表面給藥、皮下給藥、腸內(nèi)給藥或非腸胃給藥。對(duì)于腸內(nèi)給藥，特別是片劑、包衣片劑、膠囊劑、丸劑、混懸劑或溶液劑是適宜的，它們可以用植物制劑(gallenicals)中已知的添加劑和載體以常規(guī)方式生產(chǎn)。對(duì)于局部或表面給藥，例如陰道栓或經(jīng)皮系統(tǒng)如皮膚藥貼是適宜的。皮下給藥可以通過用油溶液注射來進(jìn)行。
劑量單位可以含有，例如0.1至100mg的一種或多種活性化合物(＝一種或多種孕酮受體抑制劑)。對(duì)于對(duì)人給藥，一種或多種活性化合物的每日劑量為約0.1至400mg，優(yōu)選為約10至100mg，特別是約50mg。
此外，接下來將通過以下實(shí)施例和附圖進(jìn)一步解釋本發(fā)明。這里

圖1顯示測試物質(zhì)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系T47D的抗增殖作用。
圖2顯示乳腺癌細(xì)胞系T47D中孕酮受體(PR)和雌激素受體(ER)蛋白的量。
圖3顯示T47D細(xì)胞中孕酮受體的轉(zhuǎn)錄活性。
圖4顯示作為測試物質(zhì)的存在的函數(shù)，表皮生長因子與T47D細(xì)胞結(jié)合的Scatcgard分析；圖5顯示表皮生長因子與T47D細(xì)胞結(jié)合對(duì)測試物質(zhì)的存在的依賴性。
實(shí)施例1.材料和方法材料125I-EGF(100mCi/mmol)得自Amersham Buchler?；衔顰、羥基他莫昔芬(4-OH-Tam)、ZM182780和雌二醇在Institut FürArzneimittelchemie(Institute for Pharmaceutical Agent Chemistry)中合成。
細(xì)胞系使用人雌激素受體(ER)和孕酮受體(PR)陽性的乳腺癌細(xì)胞系T47D(Freake等，BBRC101(1981)，1131-1138)。
生長研究在各例中指出的化合物的存在下，將腫瘤細(xì)胞在RPMI培養(yǎng)基加10％牛血清、200nM胰島素和0.1nM雌二醇中以5000細(xì)胞/孔在96孔板上培養(yǎng)6天，通過結(jié)晶紫染色來測定生長。
PR和ER蛋白的量
根據(jù)Fuhrmann等(Contraception 54(1996)，243-251)所描述的方法，使用用同位素標(biāo)記的孕酮或雌二醇進(jìn)行的類固醇結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞溶解產(chǎn)物中PR和ER的量。
125I-EGF與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合將用R5020預(yù)處理的T47D細(xì)胞與125I-EGF一起在4℃下溫育2小時(shí)。非特異性結(jié)合總是少于總結(jié)合的10％。
轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)(transactivation assay)用MTV-LUC(Cato等，EMBO J.，92237-40)瞬時(shí)貫穿T47D細(xì)胞，并在1nM R5020存在或不存在下培養(yǎng)之。在對(duì)PR介導(dǎo)的拮抗的測試中，將瞬時(shí)貫穿的T47D細(xì)胞用R5020處理，并且還加入濃度增加的化合物A或RU486。24小時(shí)后，進(jìn)行螢光素酶測試。
2.結(jié)果圖1顯示各種測試樣品的抗增殖作用。在0.1nM E2存在(上部網(wǎng)紋)或不存在(下部網(wǎng)紋)下，加濃度增加的化合物A(▲)、奧那斯酮(■)、ZK191703(●)或4-OH-Tam(◆)下，培養(yǎng)T47D細(xì)胞。在T47D細(xì)胞的情況下，化合物A在極低的濃度下也顯示顯著的抗增殖活性。
圖2顯示T47D細(xì)胞中的PR和ER蛋白的量。
圖3顯示T47D細(xì)胞中PR的轉(zhuǎn)錄活性，其中各細(xì)胞用MTV-LUC瞬時(shí)貫穿并在(Co)不存在或在1nM R5020的存在下培養(yǎng)。在PR介導(dǎo)的拮抗試驗(yàn)中，用0.1nM R5020和濃度增加的化合物A或RU468(b)處理瞬時(shí)貫穿的T47D細(xì)胞。
在圖4中，顯示了125I-EGF與T47D細(xì)胞結(jié)合的Scatchard分析。在20nM R5020存在下，有或沒有20nM化合物A下將細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，然后洗滌。接著，在0.25-150ng/ml的EGF的濃度范圍內(nèi)，通過在4℃下溫育2小時(shí)測定EGF結(jié)合。插入值顯示結(jié)合配體相對(duì)于游離配體的對(duì)數(shù)的量。很清楚，當(dāng)加入化合物A(下圖)時(shí)，可能阻斷由R5020(中圖)引起的EGF結(jié)合相對(duì)于監(jiān)測(上圖)的增加。
在圖5中，顯示了125I-EGF與完整T47D細(xì)胞的結(jié)合。為此目的，將細(xì)胞用2或20nM的R5020加化合物A或奧那斯酮，或者僅用化合物A處理48小時(shí)。這里也可以看到，化合物A阻斷由R5020導(dǎo)致的EGF與T47D細(xì)胞結(jié)合的增強(qiáng)。對(duì)于奧那司酮，也發(fā)現(xiàn)了類似的作用，但該作用顯著較弱。
3.討論上述結(jié)果顯示，化合物A有效阻斷具有高和組成性PR接觸的T47D細(xì)胞的雌二醇刺激的生長。
通過轉(zhuǎn)錄活性實(shí)驗(yàn)，可能顯示PR在T47D細(xì)胞中是轉(zhuǎn)錄活性的并可以被化合物1阻斷。
用R5020刺激T47D細(xì)胞導(dǎo)致EGF受體2至3倍增加的表達(dá)，其被化合物A阻斷。同時(shí)，EGF與細(xì)胞的結(jié)合也增加了2至3倍，并且可以被化合物A阻斷，而奧那斯酮的阻斷作用不如化合物A有效。增加的EGF與R5020處理的細(xì)胞的結(jié)合可以通過增強(qiáng)EGF受體表達(dá)或增強(qiáng)EGF受體和erbB2雜二聚物的形成來實(shí)現(xiàn)。
這些結(jié)果顯示了PR和人乳腺癌細(xì)胞中的生長因子信號(hào)系統(tǒng)之間的相互作用。通過使用抗孕酮，腫瘤細(xì)胞類固醇依賴性生長到生長因子依賴性生長的進(jìn)展得到抑制或阻止。
權(quán)利要求
1.孕酮受體抑制劑用于生產(chǎn)抑制生長因子結(jié)合于腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤的試劑的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于由生長因子產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞和/或腫瘤的增殖得到抑制。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途，其中孕酮受體抑制劑選自通式I的17α-氟烷基類固醇， 其中R1表示甲基或乙基；R2表示式CnFmHo的基，其中n為2、3、4、5或6，m＞1并且m+o＝2n+1；R3表示自由的、醚化的或酯化的羥基；R4和R5各自代表氫原子，一起代表附加的鍵或亞甲基；St表示部分結(jié)構(gòu)式A、B或C的類固醇ABC-環(huán)系統(tǒng) 其中R6表示氫原子、直鏈C1-C4烷基或支鏈C3-C4烷基或鹵素原子；R7表示氫原子、直鏈C1-C4烷基或支鏈C3-C4烷基，或者，如果St表示類固醇ABC-環(huán)系統(tǒng)A或B，則此外R6和R7一起表示附加的鍵；X表示氧原子，羥氨基＝N-OH或兩個(gè)氫原子；R8表示Y基或任選地在幾個(gè)位置被基團(tuán)Y取代的芳基，其中Y是氫原子、鹵素原子、-OH、-NO2、-N3、-CN、-NR9aR9b、-NHSO2R9、-CO2R9、C1-C10烷氧基、C1-C10鏈烷酰氧基、苯甲酰氧基-C1-C10鏈烷?；?、C1-C10羥烷基或苯甲?；?；且R9a和R9b相同或不同，與R9一樣，表示氫原子或C1-C10烷基，NR9aR9b基還包括它們的與酸的生理相容鹽，R9表示氫的CO2R9基還包括它們的與堿的生理相容鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中孕酮受體抑制劑是化合物11β-(4-乙酰苯基)-17β-羥基-17α-(1，1，2，2，2-五氟乙基)雌-4，9-二烯-3-酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一的用途，其中腫瘤細(xì)胞具有高和/或組成性孕酮受體表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5之一的用途，其中腫瘤細(xì)胞是乳腺癌細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6之一的用途，其中表皮生長因子和/或其他與表皮生長因子受體結(jié)合的因子的結(jié)合在腫瘤細(xì)胞中得到抑制。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的用途，其中表皮生長因子受體和erbB2之間雜二聚體的形成得到抑制。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的用途，用于腫瘤治療。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，用于抑制腫瘤從類固醇依賴性生長到生長因子依賴性生長的進(jìn)展。
全文摘要
本發(fā)明涉及孕酮受體抑制劑用于抑制腫瘤細(xì)胞的生長因子依賴性的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1551772SQ01817385
公開日2004年12月1日 申請日期2001年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月18日
發(fā)明者羅斯瑪麗·利希特納, 烏爾麗克·富爾曼, 克 富爾曼, 羅斯瑪麗 利希特納 申請人:舍林股份公司