專利名稱：：使用凋亡的選擇性誘導(dǎo)來(lái)治療腫瘤的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡(凋亡)的組合物和方法，且更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)使用表達(dá)諸如Fas配體(Apo-1配體)和TRAIL(Apo-2配體)這樣凋亡信號(hào)配體的表達(dá)載體來(lái)治療腫瘤的組合物和方法。凋亡信號(hào)配體的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)諸如Fas(Fas配體的受體)和DR4或DR5(TRAIL的受體)這樣介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞的凋亡。
背景技術(shù)：
：目前用于癌性腫瘤的主要治療方法是手術(shù)摘除組織、器官或腺體中的受侵害區(qū)域。例如，對(duì)乳腺癌的最新治療手段集中在摘除患病乳腺，隨后合并化療和放療。然而，高復(fù)發(fā)率是完全根除癌細(xì)胞的主要障礙。有人認(rèn)為盡管可以經(jīng)手術(shù)除去惡性腫瘤中的癌細(xì)胞，但是已經(jīng)侵害周圍組織或淋巴結(jié)的癌細(xì)胞通常導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤頻繁復(fù)發(fā)的一個(gè)原因可能是在原發(fā)性癌發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)手術(shù)過(guò)程完全除去癌細(xì)胞極其困難。剩余的癌細(xì)胞通常保持長(zhǎng)時(shí)間的靜息狀態(tài)，其被稱為作腫瘤休眠。Meltzer等(1990)“休眠與乳腺癌(″Dormancyandbreastcancer″)”-《腫瘤學(xué)手術(shù)雜志》(J.Surg.Oncol.)43181-188。一旦經(jīng)手術(shù)摘除了主要組織，則手術(shù)損傷可以刺激組織和血管在傷口部位上迅速再生。這些再生過(guò)程通過(guò)例如組織和血管生長(zhǎng)因子給周圍組織釋放出了正信號(hào)。這些因子和迅速增殖的環(huán)境誘導(dǎo)剩余的腫瘤細(xì)胞從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)變成迅速增殖的狀態(tài)且由此導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)。所有的癌細(xì)胞均共有兩種基本的特征無(wú)法控制的細(xì)胞循環(huán)；和不能進(jìn)入程序性細(xì)胞死亡、即凋亡的途徑。凋亡或程序性細(xì)胞死亡(PCD)是細(xì)胞自殺的遺傳控制反應(yīng)。凋亡的癥狀是伴隨細(xì)胞溶解旺盛、染色質(zhì)凝聚和DNA片段化的活力損耗。Wyllie等(1980)“細(xì)胞死亡凋亡的顯著性”(″Celldeaththesignificanceofapoptosis″)-《國(guó)際細(xì)胞學(xué)綜述》(Int.Rev.Cytol.)68251-306。凋亡過(guò)程在調(diào)節(jié)組織發(fā)育、器官大小與形狀和細(xì)胞壽命方面具有重要作用。在組織和器官發(fā)育過(guò)程中，凋亡是在脊椎動(dòng)物發(fā)育的組織模型化過(guò)程中，造成在正常組織更新過(guò)程中生理細(xì)胞死亡的大部分或全部PCD的原因。凋亡也是引起在免疫反應(yīng)的負(fù)選擇過(guò)程中B和T細(xì)胞系的細(xì)胞被廣泛消除的原因。凋亡作為預(yù)防細(xì)胞和組織過(guò)度生長(zhǎng)的保護(hù)措施起作用。PCD機(jī)制中形成的缺陷，可以延長(zhǎng)細(xì)胞壽命并可以使腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張。此外，PCD中的缺陷可以通過(guò)允許促進(jìn)抗基于免疫的破壞和賦予細(xì)胞毒性藥物和照射耐受性的基因突變的遺傳不穩(wěn)定性和累積，而產(chǎn)生致癌作用。在對(duì)這些治療沒(méi)有反應(yīng)的惡性細(xì)胞中確實(shí)觀察到了這些表現(xiàn)。盡管放療、化療和適宜的激素療法均可在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)一定程度的凋亡，但是可能需要較高劑量的藥物或照射來(lái)抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這反過(guò)來(lái)也會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明概述本發(fā)明提供了通過(guò)以位點(diǎn)特異性和受控的方式表達(dá)諸如FasL和TRAIL這樣的凋亡信號(hào)配體來(lái)治療癌癥、特別是實(shí)體瘤的新型方法和組合物。本發(fā)明在一個(gè)方面中，提供了在表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)死亡的方法。該方法在一種實(shí)施方案中包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入一組表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞。所述的表達(dá)載體包括編碼凋亡信號(hào)配體的多核苷酸序列，所述的凋亡信號(hào)配體的表達(dá)優(yōu)選受到所述載體內(nèi)的條件啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞在適于激活所述條件啟動(dòng)子時(shí)表達(dá)凋亡信號(hào)配體。所表達(dá)的凋亡信號(hào)配體通過(guò)凋亡信號(hào)配體與介導(dǎo)凋亡的受體之間的相互作用，誘導(dǎo)表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的那些細(xì)胞死亡。按照該實(shí)施方案，介導(dǎo)凋亡的受體可以是膜結(jié)合受體，諸如Fas配體的受體、Fas、以及TRAIL、DR4和DR5的受體。任選地，介導(dǎo)凋亡的受體是腫瘤壞死因子(TNF)的受體，盡管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系統(tǒng)性毒性。同樣，按照該實(shí)施方案，凋亡信號(hào)配體可以是能夠結(jié)合介導(dǎo)凋亡的受體的任意蛋白質(zhì)。例如，凋亡信號(hào)配體是能夠結(jié)合表達(dá)Fas(或DR4/DR5)的細(xì)胞內(nèi)的介導(dǎo)凋亡的信號(hào)Fas(或DR4/DR5)和Fas(或DR4/DR5)的抗體?？梢允褂帽景l(fā)明的表達(dá)載體將該抗體表達(dá)為單鏈抗體且該抗體在介導(dǎo)凋亡的受體上與其關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合。凋亡信號(hào)配體優(yōu)選是膜蛋白，諸如FasL和TRAIL。凋亡信號(hào)配體任選地是TNF，不過(guò)，TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系統(tǒng)性毒性。此外，凋亡信號(hào)配體任選地是非膜結(jié)合的蛋白質(zhì)，它可以在胞內(nèi)表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)凋亡。這類胞內(nèi)凋亡信號(hào)配體的實(shí)例包括但不限于Bax、Bad、Bak和Bik。同樣，按照該實(shí)施方案，所述的表達(dá)載體可以是質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)或其它轉(zhuǎn)染方法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入癌細(xì)胞。優(yōu)選所述的表達(dá)載體是病毒載體。該病毒載體可以是腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘、反轉(zhuǎn)錄病毒或單純皰疹病毒載體。最優(yōu)選所述的表達(dá)載體是腺病毒載體。所述的腺病毒載體可以是有能力復(fù)制型或無(wú)能力復(fù)制型載體，這取決于將要進(jìn)入腫瘤部位的凋亡信號(hào)配體的給予劑量。凋亡信號(hào)配體的表達(dá)受到該表達(dá)載體內(nèi)條件啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。該調(diào)節(jié)啟動(dòng)子可以是組織特異性啟動(dòng)子，諸如前列腺特異性啟動(dòng)子、乳腺特異性啟動(dòng)子、胰腺特異性啟動(dòng)子、結(jié)腸特異性啟動(dòng)子、腦特異性啟動(dòng)子、腎特異性啟動(dòng)子、膀胱特異性啟動(dòng)子、肺特異性啟動(dòng)子、肝特異性啟動(dòng)子、甲狀腺特異性啟動(dòng)子、胃特異性啟動(dòng)子、卵巢特異性啟動(dòng)子和子宮頸特異性啟動(dòng)子。所述的前列腺特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于前列腺特異性抗原(PSA)啟動(dòng)子及其突變體APSA、ARR2PB和前盆(probasin)(PB)啟動(dòng)子、gp91-phox基因啟動(dòng)子和前列腺特異性激肽釋放酶(hKLK2)啟動(dòng)子。所述的肝特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于肝清蛋白啟動(dòng)子、α1-胎蛋白啟動(dòng)子、α1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子和運(yùn)鐵蛋白運(yùn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子。所述的結(jié)腸特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于碳酸酐酶I啟動(dòng)子和癌胚的(carcinoembrogen′s)抗原啟動(dòng)子。所述的卵巢特異性啟動(dòng)子或胎盤特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于雌激素響應(yīng)啟動(dòng)子、芳香酶細(xì)胞色素P450啟動(dòng)子、膽固醇側(cè)鏈分裂(cholesterolsidechaincleavage)P450啟動(dòng)子、17α-羥化酶P450啟動(dòng)子。所述的乳腺特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于G.I.erb-B2啟動(dòng)子、erb-B3啟動(dòng)子、β-酪蛋白、β乳球蛋白和WAB(乳清酸性蛋白)啟動(dòng)子。所述的肺特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于表面活性劑蛋白C尿球蛋白(Uroglobin)(cc-10，Cllacell10kd蛋白)啟動(dòng)子。所述的皮膚特異性啟動(dòng)子包括但不限于K-14-角蛋白啟動(dòng)子、人角蛋白1或6啟動(dòng)子和羅伊細(xì)克林(loicrin)啟動(dòng)子。所述的腦特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于膠質(zhì)原纖維酸性蛋白啟動(dòng)子、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白啟動(dòng)子、髓鞘質(zhì)啟動(dòng)子和酪蛋白羥化酶啟動(dòng)子。所述的胰腺特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于絨毛蛋白啟動(dòng)子、胰高血糖素啟動(dòng)子和胰島素胰島(InsulinIslet)淀粉樣多肽(糊精)啟動(dòng)子。所述的甲狀腺特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于甲狀腺球蛋白和降鈣素啟動(dòng)子。所述的骨特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于α1(I)膠原蛋白啟動(dòng)子、骨鈣素(osteocalcin)啟動(dòng)子和骨唾液酸糖蛋白啟動(dòng)子。所述的腎特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于腎素啟動(dòng)子、肝/骨/腎堿性磷酸酶啟動(dòng)子和紅細(xì)胞生成素(epo)啟動(dòng)子。另一方面，所述的條件啟動(dòng)子可以是在有誘導(dǎo)劑存在的情況下受到激活或抑制的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，所述的誘導(dǎo)劑諸如有四環(huán)素或其衍生物或其類似物(例如強(qiáng)力霉素)；類固醇，諸如糖皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素和孕酮。同樣，該方法的實(shí)施方案進(jìn)一步包括創(chuàng)建適于激活所述條件啟動(dòng)子的條件的步驟，諸如將四環(huán)素或強(qiáng)力霉素(deoxycycline)轉(zhuǎn)運(yùn)至所述細(xì)胞組；和將類固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至所述細(xì)胞組，所述的類固醇選自糖皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素和孕酮。同樣，按照實(shí)施方案，所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括報(bào)告基因。該表達(dá)載體將報(bào)告基因表達(dá)為含有凋亡信號(hào)配體的融合蛋白?；蛘?，該表達(dá)載體通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制，可以將所述的報(bào)告基因雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有凋亡信號(hào)配體的單一蛋白。所述的報(bào)告基因優(yōu)選編碼熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和藍(lán)色熒光蛋白，而且更優(yōu)選綠色熒光蛋白(GFP)。同樣，按照該實(shí)施方案，所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼調(diào)節(jié)蛋白的多核苷酸序列?？梢詫⑺龅恼{(diào)節(jié)蛋白表達(dá)為帶有凋亡信號(hào)配體的融合蛋白，或者從表達(dá)載體上的不同啟動(dòng)子表達(dá)為單一蛋白。任選地，該表達(dá)載體通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制，可以將所述的調(diào)節(jié)蛋白雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有凋亡信號(hào)配體的單一蛋白。例如，所述的調(diào)節(jié)蛋白可以是引起凋亡信號(hào)配體組織特異性定位的蛋白?？梢詫⒈景l(fā)明的方法用于治療腫瘤。因此，將被誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞組包含于實(shí)體瘤中。實(shí)體瘤的實(shí)例包括但不限于乳腺、前列腺、腦、膀胱、胰腺、直腸、甲狀旁腺、甲狀腺、腎上腺、頭頸、結(jié)腸、胃、支氣管和腎的腫瘤?？梢酝ㄟ^(guò)使用藥物上可接受的任意給藥途徑將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入腫瘤。例如，可以通過(guò)下列方式將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入所述的腫瘤細(xì)胞組通過(guò)非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)(intraartierally)、經(jīng)皮(transdermally)、舌下、肌肉內(nèi)、直腸、經(jīng)口含化(transbuccally)、鼻內(nèi)、以脂質(zhì)體方式、通過(guò)吸入、陰道、眼內(nèi)、通過(guò)導(dǎo)管或斯滕特(stent)固定模的局部轉(zhuǎn)運(yùn)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)或使用緩釋劑型。優(yōu)選可以通過(guò)將所述的表達(dá)載體直接注入腫瘤病灶來(lái)將表達(dá)載體導(dǎo)入腫瘤部位。任選地，該方法可以以離體(exvivo)方式進(jìn)行，其中在取自患癌癥的患者的樣品中或細(xì)胞培養(yǎng)物中，包含導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞組。可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)Fas的細(xì)胞和不表達(dá)Fas的細(xì)胞的混合細(xì)胞中。任選地，可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)Fas的細(xì)胞。同樣任選地，可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入確實(shí)表達(dá)Fas的細(xì)胞。同樣任選地，可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)Fas的細(xì)胞。通過(guò)″旁觀者效應(yīng)″，在那些被載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞附近表達(dá)Fas的那些癌細(xì)胞，被Fas-FasL相互作用殺滅。本發(fā)明在另一個(gè)方面中提供了可以用于誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的腺病毒表達(dá)載體。該腺病毒載體包括條件啟動(dòng)子；和編碼表達(dá)受到載體內(nèi)條件啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的膜結(jié)合配體的多核苷酸序列，所述的配體在表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞內(nèi)發(fā)出凋亡信號(hào)。同樣，按照該實(shí)施方案，所述的膜結(jié)合配體可以是能夠結(jié)合癌細(xì)胞表面上介導(dǎo)凋亡的受體的任意蛋白質(zhì)。所述的膜結(jié)合蛋白優(yōu)選是FasL或TRAIL。膜結(jié)合蛋白任選地是TNF，盡管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系統(tǒng)性毒性。此外，按照該實(shí)施方案，所述的腺病毒載體可以是有能力復(fù)制型或無(wú)能力復(fù)制型的載體，這取決于進(jìn)入腫瘤部位的配體的給藥劑量。所述配體的表達(dá)受到腺病毒表達(dá)載體內(nèi)的條件啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。所述的條件啟動(dòng)子可以是組織特異性啟動(dòng)子，諸如前列腺特異性啟動(dòng)子、乳腺特異性啟動(dòng)子、胰腺特異性啟動(dòng)子、結(jié)腸特異性啟動(dòng)子、腦特異性啟動(dòng)子、腎特異性啟動(dòng)子、膀胱特異性啟動(dòng)子、肺特異性啟動(dòng)子、肝特異性啟動(dòng)子、甲狀腺特異性啟動(dòng)子、胃特異性啟動(dòng)子、卵巢特異性啟動(dòng)子和子宮頸特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種腺病毒表達(dá)載體，其用于嚴(yán)格控制靶蛋白響應(yīng)于四環(huán)素表達(dá)。所述的腺病毒表達(dá)載體包括四環(huán)素效應(yīng)元件；編碼能夠結(jié)合四環(huán)素效應(yīng)元件的反式激活蛋白的多核苷酸序列；和編碼其表達(dá)受到反式激活蛋白與四環(huán)素效應(yīng)元件結(jié)合所調(diào)節(jié)的靶蛋白的多核苷酸序列。按照該實(shí)施方案，四環(huán)素效應(yīng)元件和編碼反式激活蛋白的多核苷酸序列位于所述腺病毒載體的對(duì)側(cè)端。例如，四環(huán)素效應(yīng)元件位于腺病毒載體的E4區(qū)內(nèi)，而編碼反式激活蛋白的多核苷酸序列位于腺病毒載體的E1內(nèi)。所述的腺病毒載體任選地不包括腺病毒的E3區(qū)。同樣，所述的腺病毒載體任選地不包括除E4區(qū)的Orf6之外的腺病毒E4區(qū)?？梢栽谟兴沫h(huán)素或強(qiáng)力霉素存在的情況下抑制所述靶蛋白的表達(dá)?；蛘撸梢栽谟袕?qiáng)力霉素存在的情況下激活所述靶蛋白的表達(dá)。同樣，按照該實(shí)施方案，所述的靶蛋白可以是膜結(jié)合的凋亡信號(hào)蛋白質(zhì)，諸如FasL和TRAIL。同樣，按照該實(shí)施方案，所述的病毒表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括編碼報(bào)告基因蛋白的多核苷酸序列?？梢詫⑺龅膱?bào)告基因蛋白和靶蛋白編碼為融合蛋白，或者通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制將其雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有所述靶蛋白的單一蛋白。所述的報(bào)告基因優(yōu)選編碼諸如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和藍(lán)色熒光蛋白這樣的熒光蛋白，而且更優(yōu)選綠色熒光蛋白(GFP)。此外，按照該實(shí)施方案，所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括編碼調(diào)節(jié)蛋白的多核苷酸序列。可以將所述的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)為帶有凋亡信號(hào)配體的融合蛋白或表達(dá)為來(lái)自該表達(dá)載體上不同啟動(dòng)子的單一蛋白。任選地通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制將所述的調(diào)節(jié)蛋白雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有凋亡信號(hào)配體的單一蛋白。例如，所述的調(diào)節(jié)蛋白可以是導(dǎo)致凋亡信號(hào)配體的組織特異性定位的蛋白質(zhì)。該實(shí)施方案的腺病毒載體的實(shí)例包括但不限于pAdTET和Ad/FasL-GFPTET。還可以將本發(fā)明的表達(dá)載體與諸如化療劑(例如烷基化劑、抗生素制劑、抗代謝制劑、激素制劑和植物衍生劑)和生物制劑(例如細(xì)胞因子、癌癥疫苗和轉(zhuǎn)運(yùn)腫瘤抑制基因的基因療法)這樣的其它抗癌藥聯(lián)用。例如，對(duì)癌癥患者共同給予編碼TRAIL的表達(dá)載體和諸如阿霉素這樣的抗癌藥，應(yīng)該通過(guò)由所述藥物抑制凋亡抑制性分子或上調(diào)前凋亡(pro-apoptotic)分子而以協(xié)同方式使癌細(xì)胞對(duì)TRAIL-介導(dǎo)的凋亡敏感來(lái)克服這一障礙。因此，通過(guò)使用本發(fā)明的聯(lián)合療法，可以用亞毒性量的化療劑治療癌癥患者且仍然獲得了較好的臨床功效而不帶有與使用高劑量化療劑相關(guān)的嚴(yán)重副作用。附圖簡(jiǎn)述附圖1A、1B和1C以圖解方式分別表示了pLAd-C.tTA載體、pRAd.T.GFsL載體和rAd/FasL-GFPTET載體。在附圖1A中，表示了pLAd-C.tTA載體。該質(zhì)粒含有Ad5基因組最左側(cè)的450bp、后面是強(qiáng)CMVie增強(qiáng)子/啟動(dòng)子和來(lái)自插入MCS的pUHD15-1的tTA基因。接頭含有限制性位點(diǎn)Xba1、Avr2和Spe1，它們均產(chǎn)生與Xba1相容的粘端。在裝配入rAd載體后，E1ApolyA用于有效的tTA表達(dá)。將類似的策略用于構(gòu)建含有其它轉(zhuǎn)基因的pLAd載體。在附圖1B中，表示了pRAd.T.GFsL載體。該質(zhì)粒含有從唯一EcoR1位點(diǎn)(27333bp)到右側(cè)ITR(35935bp)的Ad5(sub360)序列，其中缺失了E3和E4(保留了E4的Orf6)。該圖表示由TRE啟動(dòng)子、FasL-GFP融合蛋白和牛生長(zhǎng)激素(BGH)polyA組成的可調(diào)節(jié)FasL-GFP表達(dá)盒的結(jié)構(gòu)。將此盒插入35810bp處的MCS。附圖1C中表示了rAd/FasL-GFPTET載體的體外裝配。詳述了GFP與FasL讀框之間的連接區(qū)。使用類似策略生成其它rAd載體。附圖2是表示293和293CrmA細(xì)胞中具有FasL活性的rAd載體滴度比較的示意圖。給12孔平板接種104個(gè)293或293CrmA細(xì)胞并在1天后以MOI為5感染r-Ad/FasL、rAdFasL-GFPTET或rAd/LacZ。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)收集細(xì)胞并使之裂解。滴定裂解物并對(duì)293CrmA細(xì)胞測(cè)定PFU/ml。結(jié)果代表了2組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和平均誤差。附圖3說(shuō)明了除了使用有利于TRAIL和GFP這兩種基因雙順?lè)醋颖磉_(dá)的IRES來(lái)分離這兩種基因，通過(guò)使用與附圖1圖例說(shuō)明中所述的類似方法來(lái)構(gòu)建TRAIL表達(dá)載體Ad.TRAIL/GFPTET。附圖4表示癌細(xì)胞對(duì)FasL-和TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡的不同敏感性。分析癌細(xì)胞A459、HeLa、LnCP和C3A對(duì)腺病毒感染的敏感性和對(duì)FasL-和TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。使細(xì)胞以MOI10感染AdGFP(從左側(cè)數(shù)第一和第二列中的組)、Ad/FasLGFPTET(第三列)和Ad.TRAIL/GFPTET(第四列)。細(xì)胞的腺病毒感染的敏感性由GFP表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量來(lái)代表(第一列)，細(xì)胞形態(tài)顯示在明視野圖中(第二列)。感染了Ad/FasL-GFPTET和Ad.TRAIL/GFPTET的細(xì)胞形態(tài)分別顯示在第三列和第四列中的組中。附圖5表示TRAIL表達(dá)不會(huì)在未轉(zhuǎn)化的成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。為了測(cè)定TRAIL表達(dá)是否會(huì)誘導(dǎo)正常細(xì)胞中的凋亡，使低傳代的人包皮成纖維細(xì)胞感染AdGFP、Ad/FasL-GFPTET和Ad.TRAIL/GFPTET，MOI約為10。明視野圖中顯示了轉(zhuǎn)導(dǎo)了AdGFP的成纖維細(xì)胞的正常形態(tài)(GFPhFF組)。成纖維細(xì)胞顯示出難以被腺病毒感染，正如GFP表達(dá)細(xì)胞的少量表達(dá)所示(GFP組)。然而，這些細(xì)胞對(duì)FasL誘導(dǎo)的凋亡高度敏感(FasL組)。相反，在TRAIL轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(TRAIL組)中沒(méi)有觀察到明顯的凋亡，甚至在5倍的MOI(TRAIL×5組)時(shí)也是如此。附圖6表示通過(guò)注射包括Fas配體的本發(fā)明腺病毒載體(Ad/FasL-GFPTET載體)抑制植入裸鼠的人乳腺腫瘤生長(zhǎng)的情況。將等數(shù)量的乳腺癌細(xì)胞植入6只小鼠的每一側(cè)。給小鼠右側(cè)面上的腫瘤注射Ad/FasL-GFPTET載體，而給同一小鼠左側(cè)上面的腫瘤注射對(duì)照載體Ad/LacZ。在6只小鼠中的4只中，在一次注射后大部分腫瘤塊消失(由黃色箭頭指示)。在這些小鼠中的2只中，與同一小鼠對(duì)照側(cè)面上的腫瘤相比，腫瘤生長(zhǎng)的抑制率大于80％(黑色箭頭)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了通過(guò)以位點(diǎn)特異性和受控方式表達(dá)諸如FasL和TRAIL這樣凋亡信號(hào)配體來(lái)治療癌癥、特別是實(shí)體瘤的新型方法和表達(dá)載體。這些凋亡信號(hào)配體的受控表達(dá)應(yīng)顯著降低與未加控制的全身給予這些配體相關(guān)的細(xì)胞毒性。依照本發(fā)明，可以通過(guò)許多藥物上可接受的給藥途徑，將表達(dá)載體諸如攜帶編碼凋亡信號(hào)配體(例如FasL和TRAIL)基因的腺病毒載體導(dǎo)入腫瘤部位。由腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)所述配體、優(yōu)選將其表達(dá)為膜結(jié)合蛋白。通過(guò)細(xì)胞中凋亡信號(hào)配體(例如TRAIL)與介導(dǎo)凋亡的受體(例如DR4和DR5)之間的相互作用，發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)。這種情況引起了多個(gè)凋亡途徑，其中所述的凋亡信號(hào)通過(guò)多種凋亡酶諸如蛋白酶和內(nèi)切核酸酶的表達(dá)而得到放大。由于所述配體與所述受體之間的相互作用可以在兩細(xì)胞之間發(fā)生，所以可以誘導(dǎo)未由腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行因″旁觀者效應(yīng)″導(dǎo)致的凋亡。這種作用可能是由于腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中表達(dá)的凋亡信號(hào)配體與在未轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的介導(dǎo)凋亡的受體之間的相互作用所導(dǎo)致的。因此，通過(guò)使用本發(fā)明的方法，細(xì)胞殺傷效率應(yīng)高于那些包括直接注射作為蛋白質(zhì)的配體或表達(dá)該配體的細(xì)胞的手段。本發(fā)明的一個(gè)重要特征在于凋亡信號(hào)配體的表達(dá)受到諸如組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子這樣的條件啟動(dòng)子的控制。通過(guò)以位點(diǎn)特異性方式(例如使用組織特異性啟動(dòng)子)和/或靈活調(diào)節(jié)的劑量(例如使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)來(lái)控制所述配體的表達(dá)，所述配體潛在的系統(tǒng)性毒性應(yīng)該被顯著降低。特別是，可以將編碼所述配體的腺病毒載體直接注入腫瘤部位并將該配體局部轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞。依賴于所要轉(zhuǎn)運(yùn)配體劑量的不同，所述的腺病毒載體可以是有能力復(fù)制型或無(wú)能力復(fù)制型的載體。一旦注入了腫瘤，則腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，結(jié)果是局部表達(dá)了高水平的配體。通過(guò)腫瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的配體與受體的相互作用，通過(guò)沿配體誘導(dǎo)的凋亡的途徑表達(dá)多個(gè)蛋白質(zhì)和酶，凋亡信號(hào)得到放大。因此，可以根除大腫瘤細(xì)胞塊而對(duì)周圍健康組織的損傷程度最低。在某種意義上，本發(fā)明提供的這種手段類似于″分子手術(shù)″，它比包括無(wú)差別、未加控制的給予癌癥治療劑的常規(guī)手段更為精確且更為安全。通過(guò)使用本發(fā)明的方法可以根除原發(fā)性腫瘤，而同時(shí)可以通過(guò)在腫瘤部位上激活癌細(xì)胞的凋亡來(lái)防止癌癥復(fù)發(fā)。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了在表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞中誘導(dǎo)死亡的方法。死亡的方式可以是壞死、凋亡或兩者的組合。該方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入一組這樣的細(xì)胞，這些細(xì)胞含有表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞。所述的表達(dá)載體包括編碼凋亡信號(hào)配體的多核苷酸序列，所述凋亡信號(hào)配體的表達(dá)優(yōu)選受到所述載體內(nèi)的條件啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞在適于激活所述的條件啟動(dòng)子時(shí)表達(dá)凋亡信號(hào)配體。所表達(dá)的凋亡信號(hào)配體，通過(guò)凋亡信號(hào)配體與介導(dǎo)凋亡的受體之間的相互作用，誘導(dǎo)那些表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞死亡。按照該實(shí)施方案，介導(dǎo)凋亡的受體可以是膜結(jié)合受體，諸如Fas配體的受體、Fas、和TRAIL、DR4和DR5的受體。介導(dǎo)凋亡的受體任選地是腫瘤壞死因子(TNF)的受體，盡管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系統(tǒng)性毒性。同樣，按照該實(shí)施方案，凋亡信號(hào)配體可以是任意能夠結(jié)合介導(dǎo)凋亡的受體的蛋白質(zhì)。例如，凋亡信號(hào)配體是能夠結(jié)合表達(dá)Fas(或DR4/DR5)的細(xì)胞內(nèi)的介導(dǎo)凋亡的信號(hào)Fas(或DR4/DR5)和Fas(或DR4/DR5)的抗體?？梢允褂帽景l(fā)明的表達(dá)載體將該抗體表達(dá)為單鏈抗體且該抗體在介導(dǎo)凋亡的受體上與其關(guān)聯(lián)抗原結(jié)合。優(yōu)選地，所述的凋亡信號(hào)配體是膜蛋白，諸如FasL和TRAIL。凋亡信號(hào)配體任選地是TNF，盡管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系統(tǒng)性毒性。1.介導(dǎo)凋亡的受體和凋亡信號(hào)配體本發(fā)明介導(dǎo)凋亡的受體是在與凋亡信號(hào)配體結(jié)合時(shí)介導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的死亡受體。該受體可以是膜結(jié)合的細(xì)胞表面受體，或者保留在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這類介導(dǎo)凋亡的受體是細(xì)胞膜結(jié)合的受體。這類介導(dǎo)凋亡的受體的突出實(shí)例屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族。TNF受體超增家族由存在相關(guān)的富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域來(lái)定義。TNF受體的實(shí)例包括但不限于NTR/GFR(p75)，諸如NGF、BDNF、NT-3和NT-4、TNF-R1(CD120a)、TNF-R2(CD120b)、Fas(CD5/Apo-1)、DR3(TRAMP/WSL-1)、DR4(TRAIL-R1)、DR5(TRAIL-R2)、DcR1(TRAIL-R3)、DcR2(TRAIL-R4)、CD30、CD40、Cd27、4-1BB(CD137)、OX-40、LT-βR、人HVEM(皰疹病毒早期介體)、OPG(osteoprotegerin)/OC1F和RANK。Ashkenazi和Dixit(1999)“死亡和假受體對(duì)凋亡的控制”(″Apoptosiscontrolbydeathanddecoyreceptors″)-《最新細(xì)胞生物學(xué)觀點(diǎn)》(Curr.Opin.CellBiol.)11255-260。所有的受體均是帶有由2-6個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域組成的胞外區(qū)的I型跨膜蛋白，所述的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域在數(shù)量上約有25％的同一性且用于與配體的結(jié)合。Fas、TNF-R1、TRAIL-DR4、DR5、TRAMP(DR3)、CAR1具有相似的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。對(duì)這些受體的胞內(nèi)區(qū)進(jìn)行的序列比較顯示出了被稱作死亡結(jié)構(gòu)域的約80個(gè)氨基酸的同源充分保守區(qū)。Orlinck和Chao(1998)“TNF相關(guān)配體及其受體”(″TNF-relatedligandsandtheirreceptors″)-《細(xì)胞信號(hào)》(CellSignal)10543-551。死亡結(jié)構(gòu)域是涉及凋亡的細(xì)胞信號(hào)分子(接頭蛋白質(zhì))的特異性補(bǔ)充所需要的。Nagata(1997)“死亡因子導(dǎo)致的凋亡”(″Apoptosisbydeathfactor″)-《細(xì)胞》(Cell)88355-365。與TNF受體超家族中的受體結(jié)合的配體包括但不限于促神經(jīng)素(neorotrophins)、TNF-α、Fas配體(FasL/CD-95L/Apo-1L)、TRAIL/Apo-2L、CD30L、CD40L、CD27L、4-1BBL、OX-40L和淋巴毒素(LT)α，β。除LT-α外，所有配體被合成為II型膜蛋白；其N-末端位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)且其C-末端擴(kuò)展入胞外區(qū)。Nagata(1997)“死亡因子導(dǎo)致的凋亡”(″Apoptosisbydeathfactor″)-《細(xì)胞》(Cell)88355-365。在TNF家族成員中胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的約150個(gè)氨基酸殘基的區(qū)有20-25％是同源的。配體的一個(gè)共同特征在于所有活性配體均由三個(gè)相同的亞單位(三聚體)組成并通過(guò)寡聚化激活其各自受體。Schulze-Osthoff等(1998)“死亡因子導(dǎo)致的凋亡”(″Apoptosisbydeathfactor″)-《歐洲生物化學(xué)雜志》(Eur.J.Biochem.)254；439-459。盡管發(fā)現(xiàn)大部分成員為膜結(jié)合分子；但是特異性金屬蛋白酶能夠產(chǎn)生可溶性形式。稱作TACE的TNF-a的鋅依賴性的金屬蛋白酶是這類特異性金屬蛋白酶的一個(gè)實(shí)例。Orlinck和Chao(1998)“TNF相關(guān)配體及其受體”(″TNF-relatedligandsandtheirreceptors″)-《細(xì)胞信號(hào)》(CellSignal)10543-551。2.Fas配體介導(dǎo)的凋亡在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，凋亡信號(hào)配體是Fas配體。按照本發(fā)明，使用腫瘤部位內(nèi)的表達(dá)載體對(duì)Fas配體進(jìn)行的控制表達(dá)，應(yīng)通過(guò)Fas-FasL相互作用誘導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞內(nèi)的凋亡，而同時(shí)將與對(duì)同樣表達(dá)Fas的那些正常細(xì)胞進(jìn)行不加區(qū)分的Fas配體攻擊相關(guān)的副作用減小到最低限度。Fas(APO-1，CD95)或Fas配體受體是45kDa的1型膜蛋白且屬于TNF/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體超家族。Bajorath，J.和A.Aruffo.(1997)“通過(guò)可比擬的分子模型化預(yù)測(cè)人Fas受體的三維結(jié)構(gòu)”(″PredictionofthethreedimensionalstructureofthehumanFasreceptorbycomparativemolecularmodeling″)-《計(jì)算機(jī)輔助的分子研究》(J.ComputAidedMolDes)113-8；和WatanabeFukunaga，R.，C.1.Brannan，N.Itoh，S.Yonehara，N.G.Copeland，N.A.Jenkins和S.Nagata“小鼠Fas抗原的cDNA結(jié)構(gòu)、表達(dá)和染色體定位”(″ThecDNAstructure，expression，andchromosomalassignmentofthemouseFasantigen″)-《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1481274-9。Fas的配體FasL是40-kDa的II型膜蛋白，它屬于腫瘤壞死因子家族。Takahashi，T.，M.Tanaka，J.Inazawa，T.Abe，T.Suda和S.Nagata.(1994)“人Fas配體基因結(jié)構(gòu)、染色體定位和種類特異性”(″HumanFasligandgenestructure，chromosomallocationandspeciesspecificity″)-《國(guó)際免疫學(xué)》(Int.Immunol.)61567-74。FasL(和某些抗-Fas抗體)與Fas的結(jié)合導(dǎo)致受體寡聚化并通過(guò)半胱氨酸天冬酶(caspase)途徑傳輸信號(hào)，從而導(dǎo)致含有受體的細(xì)胞經(jīng)凋亡而迅速死亡。Larsen，C.P.，D.Z.Alexander，R.Hendrix，S.C.Ritchie和T.C.Pearson.(1995)“Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中的免疫效應(yīng)物或免疫調(diào)節(jié)途徑？”(″Fas-mediatedcytotoxicity.AnimmunoeffectororimmunoregulatorypathwayinTcell-mediatedimmuneresponses？″)-《移植》(Transplantation)60221-4；Longthome，V.L.和G.T.Williams.(1997)“定向于Fas-介導(dǎo)的凋亡需要半胱氨酸天冬酶活性”(″CaspaseactivityisrequiredforcommitmenttoFas-mediatedapoptosis″)-《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(EMBO.J.)163805-12；Nagata，S.和P.Golstein.(1995)“Fas死亡因子”(″TheFasdeathfactor″)-《科學(xué)》(Science)2671449-56；和Ogasawara，J.，R.Watanabe-Fukunaga，M.Adachi，A.Matsuzawa，T.Kasugai，Y.Kitamura，N.Itoh，T.Suda和S.Nagata.(1993)“小鼠體內(nèi)抗-Fas抗體的致死作用”(″Lethaleffectoftheanti-Fasantibodyinmice″)[公開(kāi)的排印錯(cuò)誤出現(xiàn)在(1993)10月7日的《自然》(Nature)；365(6446)568中]-《自然》(Nature)364806-9。Fas表達(dá)在幾乎所有細(xì)胞類型中，當(dāng)Fas與FasL結(jié)合時(shí)，它通過(guò)白細(xì)胞介素偶聯(lián)酶(ICE)或半胱氨酸天冬酶的級(jí)聯(lián)表達(dá)激活了遺傳程序性細(xì)胞死亡。Chandler等(1998)“Fas誘導(dǎo)的小鼠肝臟內(nèi)凋亡后半胱氨酸天冬酶-3和半胱氨酸天冬酶-7的不同亞細(xì)胞分布”(″Differentsubcellulardistributionofcaspase-3andcaspase-7followingFas-inducedapoptosisinmouseliver″)-《生物學(xué)與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)27310815-10818；Jones等(1998)“小鼠肝細(xì)胞內(nèi)Fas-介導(dǎo)的凋亡涉及半胱氨酸天冬酶的加工和激活”(″Fas-mediatedapoptosisinmousehepatocytesinvolvestheprocessingandactivationof半胱氨酸天冬酶″)-《肝臟病學(xué)》(Hepatology)271632-1642。由于配體和受體均為膜蛋白，所以一般通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸來(lái)介導(dǎo)Fas誘導(dǎo)的凋亡。然而，F(xiàn)asL的可溶形式也由某些細(xì)胞產(chǎn)生且已經(jīng)證實(shí)它具有一定程度改變的活性，這取決于靶細(xì)胞。Tanaka.M.，T.Itai，M.Adachi和S.Nagata(1998)“通過(guò)釋放減量調(diào)節(jié)Fas配體”(″DownregulationofFasligandbyshedding″)[參見(jiàn)注解]-《天然藥物》(Nat.Med.)431-6；和Tanaka，M.，T.Suda，T.Takahashi和S.Nagata(1995)“活化淋巴細(xì)胞中的人fas配體的功能性可溶形式的表達(dá)”(″Expressionofthefunctionalsolubleformofhumanfasligandinactivatedlymphocytes″)-《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(EMBO.J.)141129-35。例如，本發(fā)明提供了通過(guò)載體介導(dǎo)的將Fas配體基因轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)Fas的腫瘤細(xì)胞(Fas+細(xì)胞)死亡的方法。在該方法中，被表達(dá)Fas配體的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，誘導(dǎo)Fas+腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡并死亡?？梢杂米⑸淦骰蛭⑿捅脤⑺鲚d體注入腫瘤，由此不需要常規(guī)手術(shù)而除去了腫瘤。被載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的癌細(xì)胞可能通過(guò)多種機(jī)制表達(dá)FasL?？梢砸詭追N方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡1)FasL與相鄰腫瘤細(xì)胞上的Fas結(jié)合并誘導(dǎo)其凋亡；2)FasL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡并破壞供應(yīng)腫瘤的血管；3)對(duì)腫瘤細(xì)胞上FasL的表達(dá)誘導(dǎo)周圍組織凋亡并除去了腫瘤細(xì)胞的任何依托支持物；和4)凋亡防止了可以重新激活導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)的靜息腫瘤細(xì)胞的正因子釋放。這種手段的主要優(yōu)點(diǎn)在于Fas-FasL相互作用是激活p53-依賴性和非依賴性途徑后的幾種凋亡途徑的主要信號(hào)事件。Callera等(1998)“使用來(lái)自可塑性貧血的淋巴細(xì)胞中bcl-2和p53的正常表達(dá)的Fas-介導(dǎo)的凋亡”(″Fas-mediatedapoptosiswithnormalexpressionofinlymphocytesfromplasticanemia″)-《英國(guó)血液病學(xué)雜志》(Br.J.Haematol.)100698-703。因此，凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通過(guò)一種以上酶的級(jí)聯(lián)表達(dá)而得到擴(kuò)增，且凋亡不依賴于p53或其它細(xì)胞周期關(guān)卡蛋白。例如，盡管使用p53基因的基因療法已經(jīng)在治療癌癥的過(guò)程中顯示出巨大的希望，(Boulikas(1997)“前列腺癌的基因療法p53、自殺基因和其它靶物”(″Genetherapyofprostatecancerp53，suicidalgenes，andothertargets.″)-《抗癌研究》(AnticancerRes.)171471-1505)，但是p53基因療法可以在約50-60％具有p53突變的腫瘤細(xì)胞中有效。Iwaya等(1997)“作為無(wú)結(jié)節(jié)乳腺癌早期復(fù)發(fā)指標(biāo)的組織學(xué)等級(jí)和p53免疫反應(yīng)”(″Ahistologicgradeandp53immunoreactionasindicatorsofearlyrecurrenceofnode-negativebreastcancer″)-《日本臨床腫瘤學(xué)雜志》(JpnJClinOncol)276-12。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于FasL一般是膜激活信號(hào)傳導(dǎo)蛋白而不是諸如p53和半胱氨酸天冬酶這樣的胞內(nèi)蛋白。細(xì)胞表面上FasL的表達(dá)將凋亡信號(hào)通過(guò)強(qiáng)″旁觀者效應(yīng)″傳遞給周圍癌細(xì)胞且不需要將治療基因轉(zhuǎn)入所有的癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明滿足了對(duì)非手術(shù)性癌癥療法的需求，它提供了超過(guò)目前基因療法的顯著改善、避免了毒性藥物的應(yīng)用且有助于防止腫瘤復(fù)發(fā)。通過(guò)以受控方式表達(dá)Fas配體、例如通過(guò)控制組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以通過(guò)在腫瘤中選擇性地促進(jìn)凋亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)并可以降低Fas配體的系統(tǒng)性毒性。3.TRAIL-介導(dǎo)的癌細(xì)胞的選擇性凋亡TRAIL或Apo-2配體是281個(gè)氨基酸的II型跨膜蛋白且與FasL最為相關(guān)(28％氨基酸同源性)。類似于FasL，TRAIL可以在4-8小時(shí)內(nèi)殺傷許多敏感性腫瘤細(xì)胞系。相反，TNF在24小時(shí)以上的時(shí)間內(nèi)殺傷腫瘤細(xì)胞系。Wiley等(1995)“誘導(dǎo)凋亡的TNF家族的新成員的鑒定和特征記述”(″IdentificationandcharacterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosis″)-《免疫》(Immunity)3673-682。類似于全長(zhǎng)Fas受體的TRAIL受體DR4和DR5含有可能與銜接分子發(fā)生相互作用的死亡結(jié)構(gòu)域(例如FADD(Fas-連接的死亡結(jié)構(gòu)域)-類似于連接物)以便介導(dǎo)凋亡信號(hào)。TRAIL-介導(dǎo)的凋亡的引發(fā)過(guò)程包括通過(guò)受體與配體(TRAIL)交聯(lián)而使三個(gè)DR4或DR5聚集在靶細(xì)胞表面上的步驟。在受體寡聚化時(shí)，與FADD相似的銜接分子通過(guò)死亡結(jié)構(gòu)域的相互作用補(bǔ)充DR4或DR5受體群。Chinnaiyan等(1996)“通過(guò)含有死亡結(jié)構(gòu)域的與TNFR-1和CD95相關(guān)的受體DR3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”(″Signaltransductionby，adeath-domain-containingreceptorrelatedtoTNFR-1andCD95″)-《科學(xué)》(Science)274990-992?？梢允褂眉偈荏w(DcR1和DcR2)抑制興奮性受體DR4和DR5與TRAIL交聯(lián)。Sheridan等(1997)“信號(hào)和假受體家族對(duì)TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡的控制”(″TRAIL-inducedapoptosisbyafamilyofsignalinganddecoyreceptors″)-《科學(xué)》(Science)277818-821。所述的假受體能夠抑制TRAIL-介導(dǎo)的凋亡，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈閷?dǎo)死亡信號(hào)的功能性死亡結(jié)構(gòu)域且它們可以通過(guò)DR4和DR5與TRAIL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。Griffith等(1999)“使用單克隆抗體對(duì)TRAIL受體的功能性分析”(″FunctionalanalysisofTRAILreceptorsusingmonoclonalantibodies″)-《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1622597-2605。與FADD相似的TRAIL銜接分子可能含有與FLICE(capase-8)結(jié)合的死亡效應(yīng)物結(jié)構(gòu)域，所述的FLICE(capase-8)即引起產(chǎn)生最終凋亡表型的半胱氨酸天冬酶放大級(jí)聯(lián)的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶。Muzio(1998)“通過(guò)蛋白酶解的信號(hào)傳導(dǎo)死亡連接物誘導(dǎo)凋亡”(″Singlingbyproteolysisdeathadaptorsinduceapoptosis″)-《國(guó)際臨床實(shí)驗(yàn)室研究雜志》(Int.J.Clin.Lab.Res.)28141-147。當(dāng)所述連接物補(bǔ)充至TRAIL受體DR4或DR5的死亡結(jié)構(gòu)域時(shí)，F(xiàn)LICE酶原通過(guò)FADD樣連接物彼此相互接觸并通過(guò)FLICE自我切割而得到激活。由TRAIL受體-連接物-FLICE組成的FLICE活化復(fù)合物稱作DISC(死亡誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物)。Kischkel等(1995)“與細(xì)胞毒性相關(guān)的依賴性APO-1(Fas/CD95)-相關(guān)蛋白質(zhì)形成帶有所述受體的誘導(dǎo)死亡的信號(hào)復(fù)合物(DISC)”(″Cytotoxicity-associateddependentAPO-1(Fas/CD95)-associatedproteinformadeath-inducingsignalingcomplex(DISC)withthereceptor″)-《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(EMBOJ.)145579-5588。FLICE酶隨后通過(guò)切割半胱氨酸天冬酶-3和其它半胱氨酸天冬酶的酶原形式激活半胱氨酸天冬酶-3和其它半胱氨酸天冬酶。Martinez-Lorenzo等(1998)“Jurkat和人外周血液T細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的死亡中涉及的Apo-2配體/TRAIL”(″InvolvementofApo-2ligand/TRAILinactivation-induceddeathofJurkatandhumanperipheralbloodTcells″)-《歐洲免疫學(xué)雜志》(Euro.J.Immunol.)282714-2725。然后活性半胱氨酸天冬酶-3可以裂解ICAD(半胱氨酸天冬酶活化的脫氧核糖核酸酶的抑制劑)，從而釋放出將DNA切割成凋亡典型標(biāo)記的180-220bp片段的活性核酸酶。已經(jīng)在各種人體組織中檢測(cè)到了TRAIL的表達(dá)，其中在脾、肺和前列腺中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平最高。Wiley等(1995)“誘導(dǎo)凋亡的新TNF家族成員的鑒定和特征記述”(″IdentificationandcharacterizationofanewmemberoftheTNFfamilythatinducesapoptosis″)-《免疫》(Immunity)3673-82。在本發(fā)明中，經(jīng)證實(shí)，與正常細(xì)胞相比，癌細(xì)胞對(duì)TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡具有選擇敏感性。諸如LNCAP(前列腺)、HeLa(子宮頸)、A549(肺)和C3A(肝)這樣的人癌細(xì)胞系對(duì)TRAIL-介導(dǎo)的凋亡敏感，而來(lái)自包皮樣品的初級(jí)人成纖維細(xì)胞在表達(dá)相似水平TRAIL的細(xì)胞中不受影響。因此，與FasL相比，TRAIL以更具腫瘤特異性的方式誘導(dǎo)凋亡，由此在體內(nèi)表達(dá)時(shí)可能具有更低的系統(tǒng)性毒性。存在許多為何腫瘤細(xì)胞特別對(duì)TRAIL-介導(dǎo)的凋亡敏感的可能的原因。一種可能性在于健康的正常細(xì)胞可以表達(dá)胞內(nèi)調(diào)節(jié)物，諸如阻斷導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生化信號(hào)途徑的FLICE-抑制蛋白(FLIPs)。Griffith等(1998)“人黑素瘤細(xì)胞中TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡的胞內(nèi)調(diào)節(jié)”(″IntracellularregulationofTRAIL-inducedapoptosisinhumanmelanomacells″)-《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)1612833-2840。另外可能的情況是對(duì)正常細(xì)胞缺乏TRAIL的細(xì)胞毒性作用可能是由于諸如DcR1和DcR2這樣的假受體的表達(dá)所造成的，所述的假受體通過(guò)與結(jié)合TRAIL的DR4或DR5競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制TRAIL-介導(dǎo)的凋亡。通過(guò)使用本發(fā)明的方法，可以通過(guò)諸如腺病毒載體這樣的條件表達(dá)載體將TRAIL導(dǎo)入癌細(xì)胞并選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。由于TRAIL給正常細(xì)胞施加了較低的毒性且其表達(dá)可以以受控位點(diǎn)特異性方式和劑量依賴性方式受到控制，所以這種配體的系統(tǒng)性毒性應(yīng)得到降低。4.用于凋亡信號(hào)配體的表達(dá)載體可以用于實(shí)施本發(fā)明方法的表達(dá)載體可以是任意的轉(zhuǎn)移基因的載體。該表達(dá)載體可以是編碼凋亡信號(hào)配體(例如TRAIL)的質(zhì)粒?？梢酝ㄟ^(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)或其它轉(zhuǎn)染方法將這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入癌細(xì)胞。優(yōu)選所述的表達(dá)載體是病毒載體。該病毒載體可以是腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘、反轉(zhuǎn)錄病毒或單純皰疹病毒的載體。本發(fā)明提供了優(yōu)選用于以位點(diǎn)特異性和受控方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的腺病毒載體?？梢酝ㄟ^(guò)使用組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制凋亡信號(hào)配體的表達(dá)。另一方面，凋亡信號(hào)配體的表達(dá)在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中可以是組成型的?？梢栽隗w外和體內(nèi)將腺病毒表達(dá)載體用于將凋亡信號(hào)配體轉(zhuǎn)運(yùn)至廣泛細(xì)胞類型。此外，可以嚴(yán)格調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的表達(dá)，這不僅有利于產(chǎn)生編碼凋亡信號(hào)的腺病毒表達(dá)載體，而且提供了用于體內(nèi)控制所述配體表達(dá)的方式以便將系統(tǒng)性毒性降低到最低限度。此外，本發(fā)明還提供了便利而可靠地對(duì)外源性凋亡信號(hào)配體的水平和細(xì)胞定位進(jìn)行定量的方式。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的腺病毒載體包括條件啟動(dòng)子；和編碼表達(dá)受到所述載體內(nèi)條件啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的膜結(jié)合配體的多核苷酸序列；所述配體在表達(dá)介導(dǎo)凋亡的受體的細(xì)胞中傳導(dǎo)凋亡信號(hào)。該腺病毒載體可以是有能力復(fù)制型或無(wú)能力復(fù)制型的載體，這取決于進(jìn)入腫瘤部位的凋亡信號(hào)配體的給藥劑量。所述的膜結(jié)合配體可以是能夠與癌細(xì)胞表面上介導(dǎo)凋亡的受體結(jié)合的任意蛋白質(zhì)。優(yōu)選所述的膜結(jié)合蛋白是FasL或TRAIL。這種膜結(jié)合蛋白可以是TNF，盡管TNF可能具有高于Fas和TRAIL的系統(tǒng)性毒性?；蛘?，所述的腺病毒載體可以編碼另一種類型的凋亡信號(hào)配體，使得當(dāng)將所述配體導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在胞內(nèi)表達(dá)所述配體。配體與介導(dǎo)凋亡的受體之間的相互作用使細(xì)胞發(fā)生凋亡。這類凋亡信號(hào)傳導(dǎo)分子的實(shí)例包括但不限于Bax、Bad、Bak和Bik。Adams等“死亡細(xì)胞的控制”(″Controlofcelldeath″)《WEHI年鑒報(bào)告》(WEHIAnnualReport)1996/1997。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼凋亡信號(hào)配體的表達(dá)載體還可以編碼可以用于調(diào)節(jié)所述配體表達(dá)的另一種蛋白質(zhì)，諸如調(diào)節(jié)蛋白。例如，所述的調(diào)節(jié)蛋白可以使細(xì)胞膜上的Fas配體發(fā)生組織特異性定位，或另一方面，所述的調(diào)節(jié)蛋白導(dǎo)致非靶細(xì)胞中的Fas配體過(guò)早更新或通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)節(jié)來(lái)FasL的表達(dá)。還可以使用同時(shí)或依次與編碼所表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸一起轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的另一種表達(dá)載體來(lái)編碼所述的調(diào)節(jié)蛋白。在該實(shí)施方案中，兩種表達(dá)載體可以具有不同的序列，諸如不同的啟動(dòng)子，使得它們可以獨(dú)立地受到調(diào)節(jié)，例如通過(guò)給予選擇性調(diào)節(jié)所述啟動(dòng)子之一或兩者的藥物，例如通過(guò)使用類固醇激素，所述的類固醇激素例如是可以調(diào)節(jié)由該激素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的糖皮質(zhì)激素?？梢允褂玫钠渌惞檀技に匕ǖ幌抻诖萍に?、雄激素和孕酮。還可以將凋亡信號(hào)配體表達(dá)為帶有另一種蛋白質(zhì)的融合蛋白。這種與該配體融合的蛋白質(zhì)可以用于以下目的諸如蛋白質(zhì)定位、配體的活化或失活、監(jiān)測(cè)配體的定位、配體的分離和對(duì)該配體的量進(jìn)行定量。在一種實(shí)施方案中，所述的融合蛋白包括Fas配體和諸如熒光蛋白(FP)這樣的報(bào)告基因蛋白。報(bào)告基因蛋白的實(shí)例包括但不限于GFP(綠色熒光蛋白)基因、YFP(黃色熒光蛋白)基因、BFP(藍(lán)色熒光蛋白)基因、CAT基因、neo基因、潮霉素基因等。表達(dá)FasL-GFP融合蛋白的構(gòu)建體的實(shí)例如附圖1中所示且在本文中進(jìn)一步描述。或者，可以通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制將所述的報(bào)告基因雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有凋亡信號(hào)配體的單一蛋白。所述的表達(dá)載體可以進(jìn)一步編碼能夠調(diào)節(jié)凋亡信號(hào)配體的表達(dá)的序列。例如，該載體可以含有糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)元件(GRE)，使得可以將糖皮質(zhì)激素用于調(diào)節(jié)Fas配體的表達(dá)。可以調(diào)節(jié)相鄰基因表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的另一個(gè)實(shí)例通過(guò)將諸如H10和H19這樣的RNA類似物(aptamer)克隆入啟動(dòng)子區(qū)而得到，由此給予諸如煙酸己可堿染料(Hoechstdye)33258這樣的藥物可以在體內(nèi)阻斷所述基因的表達(dá)。Werstuck等(1998)“通過(guò)小分子-RNA相互作用控制活細(xì)胞中的基因表達(dá)”(″Controllinggeneexpressioninlivingcellsthroughsmallmoleculeinteractions″)-《科學(xué)》(Science)282296-298。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，所述的調(diào)節(jié)序列包括Tet-操縱子或lac操縱子或可以起真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)序列作用的任意其它操縱子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，凋亡信號(hào)配體的表達(dá)處于四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)的控制下，其中對(duì)所述配體的表達(dá)受到tet-效應(yīng)元件的控制，其中所述配體的表達(dá)需要tet-效應(yīng)元件和反式激活蛋白的相互作用。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用Ad載體嚴(yán)格控制所述配體的表達(dá)，其中將tet-效應(yīng)元件和反式激活蛋白元件插入同一載體的相對(duì)的端以便避免增強(qiáng)子的干擾。表達(dá)可以便利地受到四環(huán)素或其任意衍生物(包括但不限于強(qiáng)力霉素)劑量依賴性方式的調(diào)節(jié)。例如，該載體在體外將FasL-GFP有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞，而且融合蛋白的表達(dá)水平可以受到培養(yǎng)基中強(qiáng)力霉素濃度的調(diào)節(jié)。這類調(diào)節(jié)系統(tǒng)的實(shí)例特別如本文所述。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，所述的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的組織特異性啟動(dòng)子，它可以將組織特異性傳遞給編碼諸如FasL和TRAIL這樣凋亡信號(hào)配體的核酸。例如，所述的組織特異性啟動(dòng)子可以是前列腺特異性啟動(dòng)子、乳腺特異性啟動(dòng)子、結(jié)腸特異性啟動(dòng)子、胰腺特異性啟動(dòng)子、腦特異性啟動(dòng)子、腎特異性啟動(dòng)子、肝特異性啟動(dòng)子、膀胱特異性啟動(dòng)子、骨特異性啟動(dòng)子、肺特異性啟動(dòng)子、甲狀腺特異性啟動(dòng)子、胃特異性啟動(dòng)子、卵巢特異性啟動(dòng)子或子宮頸特異性啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是前列腺特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于PSA啟動(dòng)子、ΔPSA啟動(dòng)子、ARR2PB啟動(dòng)子、PB啟動(dòng)子、gp91-phox基因啟動(dòng)子和前列腺特異性激肽釋放酶(hKLK2)啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是乳腺特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于MMTV啟動(dòng)子、G.I.erb-B2啟動(dòng)子、erb-B3啟動(dòng)子、β-酪蛋白、β乳球蛋白和WAB(乳清酸性蛋白)。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是肝特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于肝清蛋白啟動(dòng)子、α1-胎蛋白啟動(dòng)子、α1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子和運(yùn)鐵蛋白運(yùn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是腦特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于JC病毒早期啟動(dòng)子、酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子、多巴胺羥化酶啟動(dòng)子、神經(jīng)元特異性烯醇化酶啟動(dòng)子、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白啟動(dòng)子、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白啟動(dòng)子和髓磷脂啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是結(jié)腸特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于MUCl啟動(dòng)子、碳酸酐酶I啟動(dòng)子和癌胚抗原啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是卵巢特異性啟動(dòng)子或胎盤特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于雌激素效應(yīng)啟動(dòng)子、芳香酶細(xì)胞色素P450啟動(dòng)子、膽固醇側(cè)鏈分裂P450啟動(dòng)子和17α-羥化酶P450啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是肺特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于表面活性劑蛋白C尿球蛋白(cc-10，Cllacell10kd蛋白)啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是皮膚特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于K-14-角蛋白啟動(dòng)子、人角蛋白1或6啟動(dòng)子和羅伊細(xì)克林啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是胰腺特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于絨毛蛋白啟動(dòng)子、胰高血糖素啟動(dòng)子和胰島素胰島淀粉樣多肽(糊精)啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是甲狀腺特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于甲狀腺球蛋白啟動(dòng)子和降鈣素啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是骨特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于α1膠原蛋白啟動(dòng)子、骨鈣素啟動(dòng)子和骨唾液酸糖蛋白啟動(dòng)子。如果所述的組織特異性啟動(dòng)子是腎特異性啟動(dòng)子，那么該啟動(dòng)子包括但不限于腎素啟動(dòng)子、肝/骨/腎堿性磷酸酶啟動(dòng)子和紅細(xì)胞生成素(epo)啟動(dòng)子。應(yīng)注意人類基因組計(jì)劃和其它人類基因發(fā)現(xiàn)的努力揭示出了其它組織特異性啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子可以用作由本發(fā)明的表達(dá)載體指導(dǎo)組織特異性表達(dá)的適宜方式。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于了解如何鑒定對(duì)特定細(xì)胞類型具有特異性的啟動(dòng)子。例如，通過(guò)比較不同組織類型中的不同基因表達(dá)、例如使用基因芯片技術(shù)可以鑒定僅在一種特定組織類型中的表達(dá)的基因。然后可以將這些基因分離并測(cè)序且可以分離其啟動(dòng)子并在動(dòng)物模型中測(cè)試其驅(qū)動(dòng)異源基因的組織特異性表達(dá)的能力。這類方法也屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍?？梢栽贕reenberg等(1994)《分子內(nèi)分泌學(xué)》(MolecularEndocrinology)8230-239中找到可以使用的鑒定組織特異性啟動(dòng)子的該方法的實(shí)例。還可以通過(guò)選擇具有高度組織特異性的表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)組織特異性。例如，可以選擇這樣的載體，該載體選擇性感染諸如與結(jié)腸癌相關(guān)這樣的粘膜細(xì)胞，然后，任選地，與特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)方法例如使用栓劑相結(jié)合，將編碼諸如Fas和TRAIL這樣凋亡信號(hào)配體的核酸選擇性地轉(zhuǎn)運(yùn)至那些所需的細(xì)胞中。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到不同的載體隨特定宿主的不同或多或少均具有應(yīng)用性。用于將核酸導(dǎo)入特定宿主的特定技術(shù)的實(shí)例是應(yīng)用可以包裝重組反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的反轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)。例如，參見(jiàn)Pastan等(1988)“攜帶MDRlcDNA的反轉(zhuǎn)錄病毒可以在MDCK細(xì)胞中產(chǎn)生多種藥物耐受性和P-糖蛋白的極化表達(dá)”(″AretroviruscarryinganconfersmultidrugresistanceandpolarizedexpressionofP-glycoproteininMDCKcells.″)一《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Nat.Acad.Sci.)854486；和Miller等(1986)“避免導(dǎo)致輔助病毒產(chǎn)生的重組的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系的重新設(shè)計(jì)”(″Redesignofretroviruspackagingcelllinestoavoidrecombinationleadingtohelpervirusproduction.″)-《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.CellBiol.)62895。然后可以將產(chǎn)生的重組反轉(zhuǎn)錄病毒用于感染且由此將編碼凋亡信號(hào)配體的核酸序列轉(zhuǎn)運(yùn)至受感染的細(xì)胞。當(dāng)然，將核酸導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的確切方法并不限于應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄病毒載體。用于該過(guò)程的其它技術(shù)可以廣泛得到，包括應(yīng)用腺病毒載體(Mitani等“用腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人骨髓”(″Transductionofhumanbonemarrowbyadenoviralvector.″)-《人基因療法》(HumanGeneTherapy)5941-948(1994))、腺伴隨病毒載體(Goodman等“重組腺伴隨病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)入造血先祖細(xì)胞”(″Recombinantadenoassociatedvirus-mediatedgenetransferintohematopoieticprogenitorcells.″)-《血液》(Blood)841492-1500(1994))、慢病毒載體(Naidini等“使用慢病毒載體進(jìn)行的體內(nèi)未分裂細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)”(″Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector.″)-《科學(xué)》(Science)272263267(1996))、假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體(Agrawal等“血液衍生的CD34+細(xì)胞中的細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)和VSV-G假型反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”(″Cell-cyclekineticsandVSV-Gpseudotypedretrovirusmediatedgenetransferinblood-derivedCD34+cells.″)-《實(shí)驗(yàn)血液學(xué)》(Exp.Hematol.)24738-747(1996))、牛痘載體和物理轉(zhuǎn)染技術(shù)(Schwarzenberger等“通過(guò)c-kit受體向人造血先祖細(xì)胞的靶向基因轉(zhuǎn)移”(″Targetedgenetransfertohumanhematopoieticprogenitorcelllinesthroughthec-kitreceptor.″)-《血液》(Blood)87472-478(1996))?？梢詫⒈景l(fā)明與這些或其它常用的基因轉(zhuǎn)移方法中任意一項(xiàng)結(jié)合使用。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于轉(zhuǎn)運(yùn)編碼Fas配體的核酸的特異性載體包括腺病毒載體。5.編碼反式調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)載體因?yàn)樾枰軌蛘{(diào)節(jié)凋亡信號(hào)配體的表達(dá)，所以本發(fā)明還提供了用于嚴(yán)格控制靶蛋白(例如FasL和TRAIL)表達(dá)的可調(diào)節(jié)表達(dá)的表達(dá)載體。該表達(dá)載體包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列；編碼能夠結(jié)合所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的反式作用調(diào)節(jié)蛋白的多核苷酸序列；和編碼表達(dá)受到反式作用調(diào)節(jié)蛋白與所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列結(jié)合的調(diào)節(jié)的靶蛋白的多核苷酸序列。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列和編碼反式作用調(diào)節(jié)蛋白的多核苷酸序列可以位于腺病毒載體的相對(duì)的端。例如，所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列位于腺病毒載體的E4區(qū)內(nèi)且編碼反式作用蛋白的多核苷酸序列位于腺病毒載體的E1內(nèi)。在該載體中，編碼靶蛋白的核酸可以與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列有效地連接。所述靶蛋白的表達(dá)可以是誘導(dǎo)型的，例如，除非存在用于特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的適宜激活物，否則不進(jìn)行FasL或FasL融合體的表達(dá)?；蛘?，靶蛋白的表達(dá)可以是阻抑型的，即除非存在用于特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的適宜阻抑物，否則進(jìn)行FasL或FasL融合體的表達(dá)。反式作用調(diào)節(jié)蛋白與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列發(fā)生相互作用以便影響靶蛋白的轉(zhuǎn)錄。如果所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是誘導(dǎo)型的，那么所述的反式作用調(diào)節(jié)蛋白是反式激活物。如果所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是阻抑型的，那么所述的反式作用因子是反式阻抑物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是tet效應(yīng)元件(TRE)且所述的反式作用因子是tet-效應(yīng)反式作用表達(dá)元件(tTA)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明應(yīng)用了載體Ad/FasL-GFPTET。它是表達(dá)鼠FasL與綠色熒光蛋白(GFP)的融合體的復(fù)制缺陷型腺病毒載體。FasL-GFP保留了野生型FasL的全部活性，同時(shí)使得易于在活細(xì)胞或固定的細(xì)胞中進(jìn)行肉眼觀察和定量。該融合蛋白處于四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)的控制下。通過(guò)創(chuàng)建這種新型″雙重組″腺病毒載體來(lái)進(jìn)行嚴(yán)格的控制，其中將tet-效應(yīng)元件和反式激活蛋白元件插入同一載體的相對(duì)的端以便避免增強(qiáng)子的干擾。可以便利地通過(guò)四環(huán)素或其任意衍生物(包括但不限于強(qiáng)力霉素)以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)FasL-GFP融合體的表達(dá)。所述載體將FasL-GFP基因有效地轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)和體外的細(xì)胞且該融合蛋白的表達(dá)水平受到添加到培養(yǎng)基或給予受試者的強(qiáng)力霉素的濃度的調(diào)節(jié)。正如可以在下面的實(shí)施例中觀察到的，Ad/FasL-GFPTET能夠通過(guò)經(jīng)改變培養(yǎng)基中強(qiáng)力霉素水平調(diào)節(jié)的那些細(xì)胞中的融合蛋白的表達(dá)而將FasL-GFP轉(zhuǎn)運(yùn)至轉(zhuǎn)化的和初級(jí)的細(xì)胞系。易于通過(guò)FasL-GFP中GFP成分的熒光來(lái)檢測(cè)FasL-GFP的量并對(duì)其進(jìn)行定量且該量與靶細(xì)胞和相鄰細(xì)胞中凋亡水平相關(guān)。這種轉(zhuǎn)運(yùn)整個(gè)的tet-調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)的載體的設(shè)計(jì)比使用多載體的策略更為有效和經(jīng)濟(jì)，而且可以將其用于需要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的任意情況。因此，本發(fā)明提供了用于嚴(yán)格控制對(duì)四環(huán)素或四環(huán)素衍生物的反應(yīng)的靶蛋白的表達(dá)的表達(dá)載體。該表達(dá)載體包括四環(huán)素效應(yīng)元件；編碼能夠結(jié)合四環(huán)素效應(yīng)元件的反式激活蛋白的多核苷酸序列；和編碼表達(dá)受到所述反式激活蛋白與四環(huán)素效應(yīng)元件結(jié)合的調(diào)節(jié)的靶蛋白的多核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的載體是病毒載體。在一個(gè)更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的病毒載體是腺病毒載體。在這種腺病毒載體中，四環(huán)素效應(yīng)元件和編碼反式激活蛋白的多核苷酸序列位于所述腺病毒載體的相對(duì)的端。例如，所述的四環(huán)素效應(yīng)元件位于腺病毒載體的E4區(qū)內(nèi)且編碼所述反式激活蛋白的多核苷酸序列位于所述腺病毒載體的E1中。任選地，該腺病毒載體不包括腺病毒的E3區(qū)。同時(shí)任選地，該腺病毒載體不包括除E4區(qū)的Orf6外的腺病毒E4區(qū)。可以在有四環(huán)素或強(qiáng)力霉素存在的情況下抑制靶蛋白的表達(dá)。另一方面，可以在有強(qiáng)力霉素存在的情況下激活靶蛋白的表達(dá)。應(yīng)注意該載體也可以是任意類型的病毒載體，包括但不限于腺伴隨病毒載體、牛痘病毒載體或反轉(zhuǎn)錄病毒載體。所述的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括編碼報(bào)告基因蛋白的多核苷酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制將所述的報(bào)告基因蛋白和靶蛋白編碼為融合蛋白或雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有靶蛋白的單一蛋白。所述的報(bào)告基因優(yōu)選編碼熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白和藍(lán)色熒光蛋白且更優(yōu)選綠色熒光蛋白(GFP)。例如，可以通過(guò)將pLAd-C.tTA和pRAd-TGFsL與Ad5基因組部分(snb360)連接而產(chǎn)生如下所述和如附圖1A-C中所示的載體Ad/FasL-GFPTET，來(lái)構(gòu)建用于表達(dá)融合蛋白的腺病毒載體?？梢酝ㄟ^(guò)使用帶有被編碼靶序列的多核苷酸取代的FasL-GFP融合序列的類似腺病毒載體(命名為pAdTET)，來(lái)調(diào)節(jié)除FasL-GFP融合體以外的靶蛋白的表達(dá)?？梢园凑张c附圖1A-C中描述生產(chǎn)載體Ad/FasL-GFPTET相同的方式，通過(guò)從載體pRAd-TGFsL中除去FasL-GFP融合序列、將靶序列插入該位點(diǎn)并將所得載體與pLAd-C.tTA連接來(lái)構(gòu)建載體pAdTET?？梢詫⑤d體pAdTET用于需要嚴(yán)格調(diào)節(jié)其表達(dá)的、無(wú)限種類的異源蛋白。所述的表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括選擇標(biāo)記，可以將這種選擇標(biāo)記用于篩選那些含有所述載體并表達(dá)所述選擇標(biāo)記的細(xì)胞。按照這種方式可以便利地分離那些含有核酸或載體并表達(dá)來(lái)自含有所述核酸或載體、但不表達(dá)所述選擇標(biāo)記的選擇標(biāo)記的細(xì)胞和來(lái)自那些不含所述核酸或載體的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。所用的特異性選擇標(biāo)記當(dāng)然可以是可以用于對(duì)不含和表達(dá)所述選擇標(biāo)記的真核細(xì)胞進(jìn)行篩選的任意的選擇標(biāo)記。這種選擇可以基于不含和表達(dá)所述選擇標(biāo)記的細(xì)胞的死亡，諸如其中所述的選擇標(biāo)記是編碼耐藥蛋白的基因。這類用于真核細(xì)胞的耐藥基因的實(shí)例是新霉素抗性基因。表達(dá)新霉素抗性基因的細(xì)胞能夠在由抗生素G418或遺傳霉素7存在的情況下存活，而在有G418存在的情況下篩選那些不含或不表達(dá)新霉素抗性基因的真核細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解存在其它選擇標(biāo)記的實(shí)例，諸如可以選擇與抗生素潮霉素B一起使用的hph基因或可以選擇與抗生素麥考酚酸一起使用的大腸桿菌Ecogpt基因。所用的特異性選擇標(biāo)記由此是可變的。所述的選擇標(biāo)記還可以是可以用于通過(guò)在有抗生素存在情況下生長(zhǎng)的能力分離那些含有和表達(dá)來(lái)自不含和/或不表達(dá)選擇標(biāo)記基因的選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞的標(biāo)記。例如，所述的選擇標(biāo)記可以編碼在表達(dá)時(shí)使那些表達(dá)編碼所述標(biāo)記的選擇標(biāo)記的細(xì)胞得到鑒定的蛋白質(zhì)。例如，所述的選擇標(biāo)記可以編碼發(fā)光蛋白，諸如熒光素酶蛋白或綠色熒光蛋白，且可以從那些不含或不表達(dá)編碼發(fā)光蛋白的選擇標(biāo)記的細(xì)胞中鑒定表達(dá)編碼發(fā)光蛋白的選擇標(biāo)記的細(xì)胞。另一方面，所述的選擇標(biāo)記可以是編碼諸如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)這樣的蛋白質(zhì)的序列。通過(guò)本領(lǐng)域中眾所周知的方法可以便利地鑒定產(chǎn)生CAT的那些細(xì)胞并使之與那些不產(chǎn)生CAT的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。6.本發(fā)明表達(dá)載體的構(gòu)建可以通過(guò)使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的表達(dá)載體。例如，上述可調(diào)節(jié)的腺病毒載體可以來(lái)源于5型腺病毒并可以將其修飾成包括編碼凋亡信號(hào)配體(例如Fas和TRAIL)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的異源序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解存在大量可獲得的技術(shù)，通過(guò)這些技術(shù)可以獲得編碼凋亡信號(hào)配體的核酸序列和任選的諸如一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列這樣的其它序列。獲得所述核酸的一種方法通過(guò)經(jīng)合成重組DNA分子構(gòu)建該核酸來(lái)進(jìn)行。例如，寡核苷酸合成步驟在本領(lǐng)域中是常用的且編碼特定蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)區(qū)的寡核苷酸易于通過(guò)自動(dòng)DNA合成而獲得?？梢院铣捎糜陔p鏈分子中的一鏈的核酸并使之與其互補(bǔ)鏈雜交?？梢栽O(shè)計(jì)這些寡核苷酸，使得產(chǎn)生的雙鏈分子帶有內(nèi)部限制位點(diǎn)或在用于克隆入合適載體的末端上帶有適宜的5′或3′突出端?？梢酝ㄟ^(guò)首先構(gòu)建編碼蛋白質(zhì)特定區(qū)域或調(diào)節(jié)區(qū)的幾種不同雙鏈分子、隨后將這些DNA分子彼此連接來(lái)合成編碼相對(duì)較大的蛋白質(zhì)或調(diào)節(jié)區(qū)的雙鏈分子。例如，Cunningham等已經(jīng)在(1989)“通過(guò)同源物-掃描誘變鑒定的人生長(zhǎng)激素中的受體和抗體表位”(″ReceptorandAntibodyEpitopesinHumanGrowthHormoneIdentifiedbyHomolog-ScanningMutagenesis″)-《科學(xué)》(Science)，243卷，1330-1336頁(yè)中通過(guò)首先構(gòu)建重疊和互補(bǔ)合成的寡核苷酸并將這些片段彼此連接而構(gòu)建了編碼人生長(zhǎng)激素基因的合成基因。另外參見(jiàn)Ferretti等(1986)《國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Nat.Acad.Sci.)82599-603，其中公開(kāi)了由合成的寡核苷酸合成1057個(gè)堿基對(duì)的合成牛視紫紅基因。一旦合成了合適的DNA分子，則可以克隆這種DNA適宜啟動(dòng)子的下游。諸如此類的技術(shù)在本領(lǐng)域中是常用的且是充分公開(kāi)的。獲得編碼凋亡信號(hào)配體的核酸的另一種方法的實(shí)例是從生物體中分離相應(yīng)的野生型核酸，在所述的生物體中可以找到這種野生型核酸并將其克隆入合適的載體。例如，可以構(gòu)建DNA或cDNA文庫(kù)并篩選存在的有意義的核酸。這類文庫(kù)的構(gòu)建和篩選方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的且進(jìn)行構(gòu)建和篩選步驟的試劑盒是商購(gòu)的(例如，StratageneCloningSystems，LaJolla，CA)。一旦分離，則可以將這種核酸直接克隆入合適的載體，或如果必要可以將其修飾以有利于隨后的克隆步驟。這類修飾步驟是常規(guī)的，其實(shí)例是添加含有至所述核酸末端的限制位點(diǎn)的寡核苷酸接頭。一般方法列在Sambrook等的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(″MolecularCloning，aLaboratoryManual″)ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中。一旦分離，則可以使用例如PCR這樣的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)改變選擇的密碼子。獲得編碼凋亡信號(hào)配體的核酸的方法的另一個(gè)實(shí)例，是擴(kuò)增在含有野生型核酸的宿主生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)的野生型核酸，并在合適的載體中克隆這些被擴(kuò)增的核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以使用與靶核酸不完全同源的引物，將該擴(kuò)增步驟與突變步驟合并使用，以便例如同時(shí)擴(kuò)增所述核酸并改變?cè)摵怂岬奶囟ㄎ恢谩Ｍㄟ^(guò)使用這些重組DNA技術(shù)，可以構(gòu)建編碼凋亡信號(hào)配體的無(wú)能力復(fù)制型腺病毒載體。例如，可以構(gòu)建編碼TRAIL的復(fù)雜腺病毒載體并將其用于感染腫瘤細(xì)胞。將還包括與TRAIL一起被雙順?lè)醋颖磉_(dá)的GFP的載體，命名為Ad.TRAIL/GFPTFT。載體Ad.TRAIL/GFPTET是表達(dá)多種基因和調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)合腺病毒載體。將該腺病毒載體的構(gòu)建描繪在附圖3中。使用穿梭載體將編碼由IRES分離的TRAIL和GFP的序列克隆入5型腺病毒基因組的右側(cè)端(E4區(qū))，從而得到穿梭載體pRAdTRE-TRAIL/GFP。該pRAdTRE-TRAIL/GFP穿梭載體含有包括右側(cè)長(zhǎng)末端重復(fù)R-TR在內(nèi)的腺病毒基因組的右側(cè)端。另一種穿梭載體pLAd-C.tTA含有5型腺病毒基因組E1區(qū)內(nèi)的四環(huán)素反式激活蛋白基因tTA。該載體pLAd-C.tTA還含有包括左側(cè)長(zhǎng)末端重復(fù)L-TR和腺病毒包裝信號(hào)ψ的腺病毒基因組的左側(cè)端。同時(shí)將載體pRAdTRE-TRAIL/GFP和pLAd-C.tTA線性化，并且被連接到腺病毒骨架以形成重組腺病毒載體Ad.TRAIL/GFPTET。7.給藥途徑和制劑可以通過(guò)使用任意藥物上可接受的給藥途徑導(dǎo)入編碼凋亡信號(hào)配體的表達(dá)載體。例如，可以通過(guò)非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、經(jīng)口含化、鼻內(nèi)、以脂質(zhì)體方式、通過(guò)吸入、陰道、眼內(nèi)、通過(guò)導(dǎo)管或斯滕特固定模的局部轉(zhuǎn)運(yùn)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)或使用緩釋劑型將所述的表達(dá)載體給藥入一組腫瘤細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到本方法的該方面可以包括將編碼凋亡信號(hào)配體(例如FasL和TRAIL)的序列穩(wěn)定或短瞬時(shí)導(dǎo)入所述細(xì)胞。另外，被穩(wěn)定或瞬時(shí)導(dǎo)入的配體編碼序列可能整合入宿主基因組，也可能沒(méi)有整合入宿主基因組。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到將所述表達(dá)載體導(dǎo)入所述細(xì)胞的精確過(guò)程，當(dāng)然可以是變化的，并且可能取決于細(xì)胞的特定類型或同一性。將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞的方法的實(shí)例包括但不限于電穿孔、細(xì)胞融合、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、使用病毒載體感染、微注射、脂轉(zhuǎn)染物-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)和粒子轟擊技術(shù)，包括各種″裸DNA″轉(zhuǎn)運(yùn)的步驟。任選地，該方法以離體方式進(jìn)行，其中在取自患有癌癥的患者的樣品中或在細(xì)胞培養(yǎng)物中，包含有被導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞組。例如，可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)Fas的細(xì)胞和不表達(dá)Fas的細(xì)胞的混合細(xì)胞中。任選地，可以將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)Fas的細(xì)胞。同樣可以任選地將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入確實(shí)表達(dá)Fas的細(xì)胞。通過(guò)″旁觀者效應(yīng)″，經(jīng)Fas-FasL相互作用，殺滅那些接近于被表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的那些表達(dá)Fas腫瘤細(xì)胞?？梢詫⒂糜诒磉_(dá)凋亡信號(hào)配體的各種載體和宿主用于在細(xì)胞培養(yǎng)物中或在體外表達(dá)所述配體。例如，可以將編碼Fas配體的表達(dá)載體導(dǎo)入組織培養(yǎng)細(xì)胞系、諸如COS細(xì)胞并在該細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以按照這種方式選擇可能在宿主生物體中具有有限壽命的細(xì)胞類型，使得宿主可以在一定時(shí)間期限內(nèi)有效地清除表達(dá)凋亡信號(hào)配體的細(xì)胞，從而可以將對(duì)非靶的周圍細(xì)胞或組織的任何可能的凋亡作用減少到最低限度。或者，可以從受試者體內(nèi)取出來(lái)自受試者的細(xì)胞，對(duì)其給予編碼凋亡信號(hào)配體的表達(dá)載體，然后將其重新置入所述的受試者。在這種離體治療過(guò)程中，可以操作所述細(xì)胞以有利于編碼凋亡信號(hào)配體的核酸的攝取，而對(duì)受試者沒(méi)有不必要的不良作用。可以將用于表達(dá)凋亡信號(hào)配體的各種載體和宿主用于在體內(nèi)表達(dá)核酸。例如，可以將編碼FasL的表達(dá)載體導(dǎo)入真核宿主細(xì)胞、優(yōu)選腫瘤細(xì)胞以便在原位治療Fas+腫瘤細(xì)胞。正如上面簡(jiǎn)述的，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以通過(guò)對(duì)宿主選擇性給予所述載體來(lái)治療特定組織。例如，可以通過(guò)氣溶膠、諸如通過(guò)使用吸入器，選擇性地將所述載體給予肺，以此進(jìn)行腺病毒載體的給予?？梢匀芜x地將使用的栓劑對(duì)結(jié)腸細(xì)胞選擇性給予所述載體。同樣，任選地以諸如霜?jiǎng)┻@樣的形式局部轉(zhuǎn)運(yùn)所述載體，可以選擇性地將所述載體或核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至皮膚細(xì)胞或子宮頸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解各種通?？梢杂糜趯⑺霰磉_(dá)載體選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)至特定器官或細(xì)胞的方法。例如，通過(guò)諸如將載體注入選擇部位這類方法，可以以手動(dòng)方式促進(jìn)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，直接注射可以被用于將所述載體轉(zhuǎn)運(yùn)至特定的腦和/或乳腺部位。在本發(fā)明的一種實(shí)施方案中，將編碼Fas配體或TRAIL的載體的直接注射用于將其轉(zhuǎn)運(yùn)入乳腺腫瘤塊。計(jì)劃通過(guò)使用本發(fā)明的方法和載體將凋亡信號(hào)配體給予細(xì)胞、或受試者、最優(yōu)選是人，以治療優(yōu)選是癌癥的疾病。可以通過(guò)非腸道(例如通過(guò)靜脈內(nèi))、通過(guò)肌內(nèi)注射、通過(guò)腹膜內(nèi)注射、局部、經(jīng)皮等方式給予本發(fā)明的載體，無(wú)論是單獨(dú)的載體、與另一種化合物或組合物(例如化療劑)的組合、還是基于載體的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的部分，不過(guò)，一般優(yōu)選局部給藥。所需這類核酸、組合物、載體等的確切量可以隨受試者的不同而改變，這取決于受試者的種類、年齡、體重和一般情況、所治療疾病或情況的嚴(yán)重程度、所用的特定化合物或組合物、其給藥方式等。因此，無(wú)法或不必要詳細(xì)指定確切的量。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法來(lái)測(cè)定適宜的量(例如，參見(jiàn)Martin等，1989)。就局部給藥而言，本發(fā)明的組合物可以是固體、半固體或液體劑型形式的藥物組合物，諸如例如粉劑、液體、混懸劑、洗劑、霜?jiǎng)?、凝膠等，優(yōu)選適合于單一給予確切劑量的單位劑型。該組合物一般可以包括有效量的選擇的核酸、組合物或與藥用載體相結(jié)合的載體，此外，還可以包括其它醫(yī)學(xué)制劑、藥學(xué)制劑、載體、佐劑、稀釋劑等。所謂″藥物上可接受的″指的是無(wú)生物活性的或者是非必需的物質(zhì)，即可以將其與選擇的核酸、其組合物或載體一起給予個(gè)體、但不會(huì)產(chǎn)生任何不需要的生物作用或以有害方式與所述藥物組合物中包含的任意其它成分發(fā)生相互作用的物質(zhì)。作為選擇或者另外，如果使用非腸道給藥，那么非腸道給藥的特征一般在于注射，例如靜脈內(nèi)注射，包括經(jīng)供應(yīng)含有靶細(xì)胞的組織或器官的血管進(jìn)行的區(qū)域性灌注?？梢詫⒖勺⑸涞奈镔|(zhì)制成常用劑型，如液體溶液或混懸液、適合于在注射前制成液體溶液或混懸液的固體劑型或乳劑。非腸道給藥還可以使用緩慢釋放或緩釋系統(tǒng)以便維持恒定的劑量水平(例如，參見(jiàn)美國(guó)專利US3,710,795)?？梢詫⒒衔镏苯幼⑷氡磉_(dá)Fas+表型的細(xì)胞或組織部位，或可以注射它們以便它們擴(kuò)散或循環(huán)至Fas+表型細(xì)胞部位。劑量取決于給藥方式、所治療的疾病或情況和個(gè)體受試者的情況。劑量還取決于所給予的物質(zhì)，例如核酸、包括核酸的載體或另一種類型的化合物或組合物。這類劑量在本領(lǐng)域中是公知的。此外，可以根據(jù)用于所治療特定疾病或情況的典型劑量來(lái)調(diào)整這一劑量。此外，可以將靶細(xì)胞類型的培養(yǎng)細(xì)胞用于使體內(nèi)靶細(xì)胞用的劑量最優(yōu)化，而且可以監(jiān)測(cè)來(lái)自與靶細(xì)胞類型相同類型的培養(yǎng)細(xì)胞中達(dá)到的不同劑量的轉(zhuǎn)化。通常單劑量可能足夠；然而，如果需要可以重復(fù)該劑量。該劑量不應(yīng)大至產(chǎn)生不良副作用。一般來(lái)說(shuō)，該劑量將隨年齡、疾病、性別和患者體內(nèi)的疾病程度的不同而改變且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。各臨床醫(yī)師還可以在任何并發(fā)癥的情況中調(diào)整這一劑量。在實(shí)施例中給出了非人動(dòng)物中的有效劑量的實(shí)例?；诂F(xiàn)有技術(shù)中接受的公式，通?？梢杂商峁┎⒈蛔C實(shí)有效的劑量來(lái)計(jì)算人體內(nèi)的有效劑量。就對(duì)受試者體內(nèi)的細(xì)胞給藥而言，一旦給予了所述受試者所述的化合物或組合物，則它們當(dāng)然會(huì)調(diào)節(jié)至受試者的體溫。就離體給藥而言，可以通過(guò)維持細(xì)胞存活力的任意標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)給予所述的化合物或組合物、諸如通過(guò)將其添加到培養(yǎng)基(適于所述靶細(xì)胞)中并將該培養(yǎng)基直接加入所述細(xì)胞。正如從本領(lǐng)域中得知的，本方法中所用的任何培養(yǎng)基可以是含水的且是無(wú)毒性的以便不使細(xì)胞無(wú)法存活。此外，如果需要，它可以含有用于維持細(xì)胞存活的標(biāo)準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)物。就體內(nèi)給藥而言，例如，可以將所述的復(fù)合物添加到來(lái)自患者的血液樣品或組織樣品中，或加入到例如鹽水和緩沖鹽水這樣的藥物上可接受的載體中，并通過(guò)本領(lǐng)域中公知的任意幾種方式進(jìn)行給藥。給藥的其它實(shí)例包括氣溶膠吸入；皮下或肌內(nèi)注射；將編碼所述化合物的核酸序列直接轉(zhuǎn)染入例如為移植和隨后植入受試者而制備的骨髓細(xì)胞，其中該化合物是核酸或蛋白質(zhì)；和直接轉(zhuǎn)染進(jìn)入隨后植入受試者的器官。其它給藥方法包括口服給藥，特別是當(dāng)將組合物包囊時(shí)更是如此；或直腸給藥，特別是當(dāng)組合物是栓劑形式時(shí)更是如此。藥物上可接受的載體包括無(wú)生物活性的否則就是非必需的物質(zhì)，即可以將該物質(zhì)與選擇的復(fù)合物一起給予個(gè)體、但不會(huì)產(chǎn)生任何不需要的生物作用或以有害方式與所述藥物組合物中包含的任意其它成分發(fā)生相互作用的物質(zhì)。特別地，如果例如通過(guò)器官或腫瘤的區(qū)域灌注，來(lái)靶向體內(nèi)的特定細(xì)胞類型，那么可以對(duì)來(lái)自靶組織的細(xì)胞進(jìn)行活檢并可以如本文所述和本領(lǐng)域中公知的方法在體外測(cè)定進(jìn)入該組織的最佳劑量以便使包括濃度和時(shí)間期限在內(nèi)的體內(nèi)劑量最優(yōu)化?；蛘?，還可以將相同細(xì)胞類型的培養(yǎng)細(xì)胞用于最優(yōu)化體內(nèi)靶細(xì)胞的劑量。例如，可以使用可控制的泵、諸如計(jì)算機(jī)控制的泵或微溫性泵來(lái)控制腫瘤內(nèi)的注射量和比例以便控制腫瘤或組織內(nèi)的核酸或載體的比例和分布。實(shí)施例4證實(shí)了用于小鼠體內(nèi)乳腺和腦腫瘤的體內(nèi)治療的Ad/FasL-GFPTET的有效劑量。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于得知如何外推這些附圖以便確定有效的人體劑量。就離體或體內(nèi)應(yīng)用而言，可以以任意有效濃度給予所述的核酸、載體或組合物。有效濃度是導(dǎo)致轉(zhuǎn)化表型的細(xì)胞死亡、減少、抑制或阻止的量?？梢砸越M合物的形式給予本發(fā)明的表達(dá)載體。例如，該組合物可以進(jìn)一步包括其它醫(yī)學(xué)制劑、藥學(xué)制劑、載體、佐劑、稀釋劑等。此外，該組合物除包括所述核酸或載體外還可以包括脂類，諸如脂質(zhì)體，如陽(yáng)離子型脂質(zhì)體(例如DOTMA、DOPE、DC-膽固醇)或陰離子型脂質(zhì)體。如果需要，脂質(zhì)體可以進(jìn)一步包括蛋白質(zhì)以便有利于靶向特定細(xì)胞。包括核酸或載體和陽(yáng)離子型脂質(zhì)體的組合物，可以被給藥入傳入靶器官的血液，或者使其吸入呼吸道至呼吸道的靶細(xì)胞。關(guān)于脂質(zhì)體，例如參見(jiàn)Brigham等《美國(guó)呼吸道細(xì)胞分子生物學(xué)雜志》(Am.J.Resp.Cell.Mol.Biol.)195-100(1989)；Felgner等《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.SciUSA)847413-7417(1987)；美國(guó)專利US4,897,355。此外，可以將所述的核酸或載體作為可以靶向至諸如巨噬細(xì)胞這樣特定細(xì)胞類型的微囊成分給藥，或者其中將從微囊擴(kuò)散的化合物或轉(zhuǎn)運(yùn)的化合物設(shè)計(jì)成特定的比例或劑量?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法治療表達(dá)介導(dǎo)凋亡信號(hào)的受體的任意細(xì)胞、特別是腫瘤細(xì)胞。例如，F(xiàn)as是主要的表面蛋白，而且可以通過(guò)Fas-FasL凋亡誘導(dǎo)將表達(dá)FasL的細(xì)胞用于治療表達(dá)Fas的細(xì)胞。表達(dá)FasL的細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞表面上Fas與FasL的相互作用與表達(dá)Fas的細(xì)胞發(fā)生相互作用，并且由此治療表達(dá)FasL的細(xì)胞可以接觸到的、表達(dá)Fas的細(xì)胞。另外，產(chǎn)生FasL的細(xì)胞也可以通過(guò)產(chǎn)生隨后與Fas發(fā)生相互作用且還誘導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡的可溶性FasL，來(lái)調(diào)節(jié)表達(dá)Fas的細(xì)胞。Fas與FasL相互作用的典型情況是配體-受體結(jié)合，不過(guò)，這種相互作用本身可能并不一定需要結(jié)合，而包括因Fas與FasL的任何相互作用導(dǎo)致的任意細(xì)胞反應(yīng)。因此，本文關(guān)注任何經(jīng)由Fas的這樣的細(xì)胞凋亡，此細(xì)胞凋亡由通過(guò)表達(dá)Fas配體的同一細(xì)胞或第二種細(xì)胞表達(dá)FasL而產(chǎn)生。盡管使用本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)表達(dá)Fas的任意細(xì)胞發(fā)生凋亡，但是優(yōu)選的實(shí)施方案是使用這些方法誘導(dǎo)Fas+腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在該實(shí)施方案中，可以選擇性誘導(dǎo)這些腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡且隨后死亡，由此治療腫瘤。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的腫瘤是實(shí)體瘤，并且給該腫瘤注射可以感染腫瘤細(xì)胞且由此導(dǎo)致它們表達(dá)FasL的重組病毒，由此，表達(dá)FasL的細(xì)胞與表達(dá)Fas的細(xì)胞發(fā)生的相互作用導(dǎo)致Fas+細(xì)胞發(fā)生凋亡。由表達(dá)FasL的細(xì)胞侵染的表達(dá)Fas的細(xì)胞一般是與表達(dá)FasL的細(xì)胞相鄰的細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞與細(xì)胞的接觸一般是發(fā)生凋亡信號(hào)所必不可少的。不過(guò)，諸如如果表達(dá)FasL的細(xì)胞已經(jīng)移動(dòng)和/或如果表達(dá)FasL的細(xì)胞產(chǎn)生可溶性FasL，那么可以從表達(dá)FasL的細(xì)胞的鄰近周圍除去感染的Fas細(xì)胞。表達(dá)FasL的細(xì)胞還可以導(dǎo)致其自身死亡，條件是那些細(xì)胞也是Fas+細(xì)胞。在這種手段中，本發(fā)明的方法可以使Fas+細(xì)胞死亡，由此消除可能在其它情況下使腫瘤回歸的那些腫瘤細(xì)胞。8.聯(lián)合療法本發(fā)明還提供了使用聯(lián)合療法的方法，所述的聯(lián)合療法將凋亡信號(hào)配體的表達(dá)與給予抗癌藥合并使用。據(jù)信通過(guò)共同給予抗癌藥，癌細(xì)胞的凋亡可以得到強(qiáng)化或敏化，尤其是在那些耐FasL-或TRAIL-介導(dǎo)的凋亡的癌細(xì)胞中更是如此。治療癌癥中的主要障礙在于耐藥腫瘤細(xì)胞的形成和形成了可以解讀FasL或TRAIL對(duì)凋亡敏感的抗凋亡機(jī)制。理想的情況是對(duì)TRAIL(或Fas)抗性腫瘤細(xì)胞給予亞毒性濃度的化療藥和TRAIL(或Fas)，該過(guò)程應(yīng)產(chǎn)生最大的腫瘤抑制作用和最小的、與給予高劑量化療藥相關(guān)的副作用。本發(fā)明的聯(lián)合療法可以通過(guò)多種作用機(jī)理克服腫瘤對(duì)Fas-或TRAIL-介導(dǎo)的凋亡的耐受性。諸如化療劑或細(xì)胞因子這樣的抗癌藥，可以通過(guò)1)抑制抗凋亡分子和/或2)增量調(diào)節(jié)前凋亡分子，來(lái)敏化Fas-或TRAIL-介導(dǎo)的凋亡。例如，可以通過(guò)抗癌藥來(lái)調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的主要抑制劑Bel-xL和Bcl-2。低濃度的、植物來(lái)源的抗癌藥紫杉醇可以通過(guò)誘導(dǎo)Bcl-2磷酸化降低Bcl-2的活性。此外，藥物和細(xì)胞因子還可以增量調(diào)節(jié)前凋亡分子的表達(dá)以降低誘導(dǎo)TRAIL-介導(dǎo)的凋亡所需的信號(hào)傳導(dǎo)閾值。例如，可以使用基因毒性藥物和TNF-α誘導(dǎo)DR5(一種死亡誘導(dǎo)TRAIL受體)的表達(dá)。DR5的誘導(dǎo)似乎同時(shí)受到p53-依賴性和p53-非依賴性機(jī)制的調(diào)節(jié)。Sheikh等(1998)“對(duì)基因毒性應(yīng)激和腫瘤壞死因子α的反應(yīng)的死亡受體KILLER/DR5基因表達(dá)的p53-依賴性和非依賴性調(diào)節(jié)”(″p53-dependentandindependentregulationofthedeathreceptorgeneexpressioninresponsetogenotoxicstressandtumornecrosisfactoralpha″)-《癌癥研究》(CancerRes.)581593-1598。此外，可以使用γ-干擾素增量調(diào)節(jié)半胱氨酸天冬酶(半胱氨酸天冬酶-1、-2、-6、-8和-9)的mRNA。這些半胱氨酸天冬酶的增量調(diào)節(jié)應(yīng)增強(qiáng)了對(duì)本發(fā)明凋亡信號(hào)配體誘導(dǎo)的凋亡的敏感性?？梢怨餐o予范圍很廣的抗癌藥和本發(fā)明的表達(dá)載體。所述抗癌藥的實(shí)例包括但不限于烷基化劑、抗生素制劑、抗代謝制劑、激素制劑、植物衍生制劑和生物制劑。烷基化劑的實(shí)例包括但不限于二氯乙胺類(氮芥子氣，例如苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法侖、尿嘧啶氮芥)、氮丙啶類(例如噻替派)、烷基酮磺酸鹽類(例如白消安)、硝基脲類(例如卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星)、非傳統(tǒng)的烷基化劑(六甲蜜胺、達(dá)卡巴嗪和丙卡巴肼)、鉑化合物(卡鉑(carboplastin)和順鉑)?？股刂苿┑膶?shí)例包括但不限于蒽環(huán)霉素類(anthracyclines)(例如多柔比星、柔紅霉素、表柔比星、伊達(dá)比星和蒽二酮)、絲裂霉素C、博來(lái)霉素、更生霉素、普里卡諾霉素(plicatomycin)?？勾x制劑的實(shí)例包括但不限于氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤、亞葉酸、羥基脲、硫鳥(niǎo)嘌呤(6-TG)、巰嘌呤(6-MP)、阿糖胞苷、噴司他丁、磷酸氟達(dá)拉濱、克拉屈濱(2-CDA)、門冬酰胺酶和吉西他濱。這類激素制劑的實(shí)例是合成雌激素類(例如己烯雌酚)、抗雌激素類(例如他莫昔芬、托瑞米芬、氟羥甲基固醇(fluoxymesterol)和雷洛昔芬)、抗雄激素類(比卡魯胺、尼魯米特、氟他胺)、芳香酶抑制劑(例如氨魯米特、阿納托司唑和四唑)、酮康唑、醋酸性瑞林、亮丙瑞林、去氫甲孕酮和米非司酮。植物衍生的制劑的實(shí)例包括但不限于長(zhǎng)春花生物堿(例如長(zhǎng)春花新堿、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春地辛、長(zhǎng)春利定和長(zhǎng)春瑞濱)、鬼臼毒素類(例如依托泊苷(VP-16)和替泥鉑苷(VM-26))、喜樹(shù)堿及其衍生物(例如9-硝基-喜樹(shù)堿和9-氨基-喜樹(shù)堿)和紫杉烷類(例如紫杉醇和紫杉萜)。生物制劑的實(shí)例包括但不限于免疫調(diào)節(jié)蛋白，諸如細(xì)胞因子、針對(duì)腫瘤抗原的單克隆抗體、腫瘤抑制基因和癌癥疫苗?？梢耘c本發(fā)明組合物聯(lián)用的白細(xì)胞介素的實(shí)例包括但不限于白細(xì)胞介素2(IL-2)和白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素12(IL-12)?？梢耘cCPT聯(lián)用的干擾素的實(shí)例包括但不限于干擾素α、干擾素β(成纖維細(xì)胞干擾素)和干擾素γ(成纖維細(xì)胞干擾素)。這類細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于紅細(xì)胞生成素(紅細(xì)胞生成素α(epoietinα))、粒細(xì)胞-CSF(非爾司亭)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-CSF(沙莫司亭)。非細(xì)胞因子的其它免疫調(diào)節(jié)劑包括但不限于卡介苗、左旋咪唑和奧曲肽。針對(duì)可以與CPT聯(lián)用的腫瘤抗原的單克隆抗體的實(shí)例包括但不限于HERCEPTIN_(Trastruzumab)和RITUXAN_(Rituximab)。腫瘤抑制基因的實(shí)例包括但不限于DPC-4、NF-1、NF-2、RB、p53、WT1、BRCA1和BRCA2。癌癥疫苗的實(shí)例包括但不限于神經(jīng)節(jié)苷脂(GM2)、前列腺特異性抗原(PSA)、α-甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)(由結(jié)腸癌和例如乳腺、肺、胃和胰腺癌這樣的其它腺癌產(chǎn)生)、黑素瘤相關(guān)抗原(MART-1、gp100、MAGE1，3酪氨酸酶)、乳頭瘤病毒E6和E7片段、自體腫瘤細(xì)胞和同種異體腫瘤細(xì)胞的完整細(xì)胞或部分/裂解物?？梢詫⒆魟┯糜谠鰪?qiáng)對(duì)TAAs的免疫反應(yīng)。佐劑的實(shí)例包括但不限于卡介苗(BCG)、內(nèi)毒素脂多糖類、匙孔血藍(lán)蛋白(GKLH)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，和環(huán)磷酰胺，這是一種據(jù)信在低劑量給藥時(shí)可減少腫瘤誘導(dǎo)抑制作用的化療藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以將抑制RNA合成并減少Bd-xL表達(dá)的藥物放線菌素D，用于在癌細(xì)胞中、例如在與AIDS相關(guān)的卡波西氏肉瘤(KS)的癌細(xì)胞中，以敏化TRAIL-介導(dǎo)的凋亡。KS是在帶有HIV感染的人中產(chǎn)生的最常見(jiàn)的惡性腫瘤(AIDS-KS)。盡管已經(jīng)將許多方式使用了15年，但是仍然無(wú)法使用目前可得到的治療方式治愈KS或使其長(zhǎng)期完全緩解。Lee和Mitsuyasu(1996)“與AIDS相關(guān)的卡波西肉瘤的化療”(″ChemotherapyofAIDS-relatedKaposi′ssarcoma″)-《北美臨床血液學(xué)與腫瘤學(xué)》(Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.)101051-1068。在AIDS-KS損害中檢測(cè)到了高水平的Bcl-x和Bcl-xL，這一結(jié)果可能是KS細(xì)胞對(duì)化療藥和NK細(xì)胞的抗性所導(dǎo)致的。因此，對(duì)KS患者共同給予編碼TRAIL的表達(dá)載體和一種或多種基因毒性藥物，應(yīng)該通過(guò)經(jīng)由所述基因毒性藥物抑制Bcl-x和Bcl-xL水平而以協(xié)同方式使癌細(xì)胞對(duì)TRAIL-介導(dǎo)的凋亡敏感，從而克服了這一障礙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將多柔比星與表達(dá)TRAIL的表達(dá)載體聯(lián)用以治療患前列腺癌的患者。前列腺癌是美國(guó)男性中最普遍的癌癥之一且患晚期前列腺癌的患者的存活率目前較低。Landis等″Cancerstatitics″一《CA臨床癌癥雜志》(CACancerJ.Clin.)498-31。盡管手術(shù)、激素療法和化療可以除去前列腺癌的大部分，但是可以發(fā)生晚期癌轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)。由于激素難以治愈的前列腺細(xì)胞，對(duì)放療和化療也不敏感，因此當(dāng)這些細(xì)胞發(fā)展成更為惡性的腫瘤時(shí)，它們可能產(chǎn)生對(duì)各種刺激物誘導(dǎo)的所有凋亡過(guò)程的耐受性。然而，共同給予基因毒性藥物和編碼TRAIL的表達(dá)載體，應(yīng)該通過(guò)經(jīng)抑制凋亡抑制分子或增量調(diào)節(jié)前凋亡分子而使前列腺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL-介導(dǎo)的凋亡敏感，從而克服了這一障礙?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體在表達(dá)用于治療癌癥(或其它疾病)的凋亡信號(hào)配體時(shí)，與其它抗癌(或所治療的其它疾病)的治療劑聯(lián)合給藥，對(duì)該表達(dá)載體的給藥可以在給予所述的其它治療劑之前、過(guò)程中或之后進(jìn)行。可以按照已知或測(cè)定為有效的劑量給予這些治療劑，而且由于存在由本發(fā)明載體表達(dá)的凋亡信號(hào)配體，因而可以以減少的劑量給予它們。在下面的實(shí)施例中更具體地描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅作為解釋目的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以對(duì)其中的內(nèi)容進(jìn)行修改和改變。實(shí)施例實(shí)施例1Fas配體的表達(dá)載體在上述和附圖1中描繪的方法實(shí)例中，構(gòu)建含有編碼鼠Fas配體的核酸的重組腺病毒。另外，構(gòu)建含有編碼鼠Fas配體且還編碼水母綠熒光蛋白(GFP)的核酸的重組腺病毒，使得最終翻譯出融合蛋白。將這種融合蛋白用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在用所述腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后的培養(yǎng)細(xì)胞和動(dòng)物組織中的表達(dá)和定位。三種不同的腫瘤細(xì)胞系分離自乳腺癌患者，它們均對(duì)使用所述腺病毒載體的Fas配體療法表現(xiàn)出高度的敏感性。這一結(jié)果表明可以使用這些方法有效治療或殺滅腫瘤細(xì)胞。平行進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)還證明幾種前列腺癌細(xì)胞系對(duì)Fas-介導(dǎo)的凋亡極其敏感，因?yàn)槭褂孟俨《窘閷?dǎo)將編碼Fas配體的核酸導(dǎo)入這些細(xì)胞，可以將這些細(xì)胞完全殺滅。實(shí)施例2使用復(fù)合腺病毒載體進(jìn)行的FasL-GFP融合蛋白的受控轉(zhuǎn)運(yùn)Fas配體(FasL)誘導(dǎo)表達(dá)Fas受體的細(xì)胞凋亡，而且其在免疫反應(yīng)、變性和淋巴組織增生性疾病和腫瘤發(fā)生中起重要作用。它還涉及免疫特異性位點(diǎn)的生產(chǎn)且由此對(duì)基因療法領(lǐng)域而言具有意義。我們描述了表達(dá)鼠FasL和綠色熒光蛋白(GFP)融合體的可復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建和特征。FasL-GFP保留了野生型FasL的全部活性，同時(shí)使得在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中的肉眼觀察和定量更為便利。該融合蛋白處于四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)的控制下。通過(guò)創(chuàng)建新型A雙重組Ad載體來(lái)進(jìn)行嚴(yán)格控制，其中將tet-效應(yīng)元件和反式激活蛋白插入同一載體的相對(duì)的端以避免增強(qiáng)子的干擾。可以便利地以劑量依賴性方式使用四環(huán)素或其衍生物調(diào)節(jié)表達(dá)。所述載體能夠在體外有效轉(zhuǎn)運(yùn)FasL-GFP基因且通過(guò)培養(yǎng)基中強(qiáng)力霉素的濃度來(lái)調(diào)節(jié)融合蛋白的表達(dá)水平。這種調(diào)節(jié)使得我們通過(guò)抑制在CrmA表達(dá)細(xì)胞系中FasL的表達(dá)而生產(chǎn)了高滴度的載體。在所測(cè)試的全部細(xì)胞系中均顯示出凋亡的誘導(dǎo)作用。這些結(jié)果表明我們的載體是用于基于FasL的癌癥基因療法和用于研究FasL/Fas-介導(dǎo)的凋亡和免疫特異性的有潛在價(jià)值的工具。材料和方法細(xì)胞HeLa細(xì)胞和293細(xì)胞獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(分別為ATCCCCL-2.1和ATCCCRL-1573)并將其作為單層維持在37℃下和5％CO2中的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM；GibcoBRL)中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充了10％小牛血清(BCS；HyClone)和1％青霉素/鏈霉素(Cellgro)。將培養(yǎng)的大鼠成肌細(xì)胞維持在補(bǔ)充了20％胎牛血清(FBS；HyClone)和1％青霉素/鏈霉素和1％兩性霉素的H-21(Cellgro)培養(yǎng)基。為了進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)染，使用LipofectAMINE(GibcoBRL)、按照制造商的說(shuō)明書(shū)以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔平板(Greiner)且此后轉(zhuǎn)染24小時(shí)。為了生產(chǎn)表達(dá)細(xì)胞因子應(yīng)答調(diào)節(jié)物A(CrmA)的293細(xì)胞系，將pCrmA-I-Neo轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞。通過(guò)以0.4g/L將G418加入到培養(yǎng)基中4周來(lái)選擇Neo陽(yáng)性克隆，結(jié)束時(shí)取出各個(gè)克隆、使其增殖并根據(jù)其對(duì)FasL-誘導(dǎo)的凋亡的耐受性檢測(cè)CrmA的表達(dá)。質(zhì)粒和重組腺病毒載體的構(gòu)建載體pEGFP-1和pEGFP1-C1獲自Clontech。它們含有野生型綠色熒光蛋白(wtGFP)基因的紅移變體(red-shiftedvariant)，具有較亮的熒光和″人源化″密碼子選擇。(Zhang，G.，V.Gurtu和S.R.Kain.1996“增強(qiáng)的綠色熒光蛋白允許對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移進(jìn)行敏感性檢測(cè)”(″Anenhancedgreenfluorescentproteinallowssensitivedetectionofgenetransferinmammaliancells.″)(《生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊》(BiochemBiophysResCommun)227707-11。)在本實(shí)施例中將這種蛋白質(zhì)稱作″GFP″。在基因庫(kù)中得到的小鼠FasLcDNA序列位于Bluescript(Invitrogen)載體中。載體pUHD10-3和pUHD15-1(Gossen，M.和H.Bujard，“通過(guò)四環(huán)素效應(yīng)啟動(dòng)子嚴(yán)格控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)”(″Tightcontrolofgeneexpressioninmammaliancellsbytetracyclineresponsivepromoters″)-《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(ProcNatlAcadSciUSA)895547-51，1992)獲自Clontech。通過(guò)插入編碼pEGFP-C1中GFP序列的小鼠Fas配體讀框下游aa11-aa279的DNA以產(chǎn)生pC.GFsl來(lái)構(gòu)建GFP-FasL融合基因。將來(lái)自pC.GFsI的融合基因插入pUHD10-3以產(chǎn)生p10-3.GFsl。pcDNA3載體中的牛痘病毒(Chordopoxvirinae)細(xì)胞因子應(yīng)答效應(yīng)物A(crmA；CPV-W2)cDNA獲自Genentech。從pcDNA3中切下CrmA基因并插入pIRES-Neo載體(Clontech)而生成pCrmA-I-Neo。將GFP、FasL、FasL-GFP和LacZ基因克隆入E1穿梭載體pLAd-CMV以分別形成pLAd-C.Gf、pLAd-C.Fsl、pLAd-C.GFsl和pLAd-C.Lz構(gòu)建體(附圖1A)。從pUHD15-1中提取Tet-OFF融合活化子蛋白表達(dá)盒并將其插入pLAd-CMVie而生成pLAd-C.tTA。從p103.GFsl中切下GFP-FasL融合基因表達(dá)盒并在Ad5的右側(cè)ITR與E4之間的轉(zhuǎn)基因插入處，插入到穿梭載體pRAd.mcs中。所得構(gòu)建體稱作pRAd-T.GFsl(附圖1B)。Ad/FasL-GFPTET載體的裝配如附圖1C中所示。使用類似策略構(gòu)建本研究中所用的其它rAd基因組。所有載體均基于Ad5sub360(AE3)，其中另外缺失了除ORF6外的所有E4ORFs。(Huang，M.M.和P.Hearing.1989)。腺病毒早期區(qū)域4開(kāi)放閱讀框6/7蛋白通過(guò)直接復(fù)合調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子E2F的DNA結(jié)合活性。(《基因開(kāi)發(fā)》(GenesDev)31699-710)。病毒載體的增殖使用含有rAd載體DNA的連接混合物、應(yīng)用LipofectAMINE法轉(zhuǎn)染提供反式Ad5E1a和E1b功能的293細(xì)胞(Graham，F(xiàn).L.，J.Smiley，W.C.Russell和R.Naim；“通過(guò)來(lái)自人5型腺病毒的DNA轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞系的特征”(″CharacteristicsofahumancelllinetransformedbyDNAfromhumanadenovirustype5″)(《遺傳病毒學(xué)雜志》(JGenVirol)3659-74，1977)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞直到觀察到與腺病毒相關(guān)的致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)為止(一般在7-14天)，在該時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行載體增殖和擴(kuò)增。在293或293CrmA細(xì)胞上滴定原液并且評(píng)價(jià)噬斑以將載體產(chǎn)率確定為PFU/ml。如果合適，還使用GFP熒光或X-gal染色來(lái)滴定載體。在兩種情況中，滴度估計(jì)值完全符合PFU/ml。蛋白質(zhì)印跡分析給10cm平板(Greiner)接種106個(gè)初級(jí)大鼠成肌細(xì)胞的細(xì)胞。24小時(shí)后，以感染多重度(MOI)為2使平板感染Ad/FasL-GFPTET或?qū)φ蛰d體。感染后24小時(shí)將該平板用PBS洗滌2次。收集細(xì)胞并使之在含有50mMTris-HCl(pH7.8)、1mMEDTA、2％SDS、0.1％溴苯酚藍(lán)、1mMPMSF(Sigma)、50μg/ml亮異蛋白酶肽(Sigma)、2μg/ml抑酶肽(Sigma)和1ng/ml胃酶抑制劑(Sigma)的細(xì)胞裂解緩沖液中裂解。將樣品煮沸5分鐘，在每個(gè)8％SDS-PAGE微型凝膠(BioRad)的泳道中加入原始量(106個(gè)細(xì)胞)的1/10，使該步驟在20mA下進(jìn)行3小時(shí)。人重組FasL(C-末端)獲自SantaCruzLaboratories。使用半干的凝膠轉(zhuǎn)移裝置(BioRad)將該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到硝化纖維膜(PharmaciaBiotech)上。通過(guò)在含有10mMTris-HCl(pH7.5)、140mMNaCl、3％(w/v)BSA、5％(w/v)奶粉、0.2％(v/v)Tween-20(Amresco，Solon，OH)和0.02％(w/v)疊氮化鈉(Sigma)的溶液中保溫而將該膜封閉。使用封閉溶液按1∶100稀釋多克隆兔抗-FasL抗體(SantaCruz)并在環(huán)境溫度下與所述膜一起保溫2小時(shí)。用10mMTris-HCl(pH7.5)和140mMNaCl溶液將印跡洗滌2次，然后與按1∶10000稀釋的、共扼了HRPO(Caltag，Burlingame，CA)的羊抗兔IgG一起溫育。使該印跡在ECL試劑(AmershamLifeScience)中顯影過(guò)夜并用KodakX光片觀察。凋亡的檢測(cè)通過(guò)使用原位細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒AP(BoehringerMannheim)、按照制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)完成對(duì)培養(yǎng)的粘著細(xì)胞的凋亡的早期檢測(cè)。該試劑盒使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)法將熒光素導(dǎo)入游離3′-OHDNA末端，并使用與堿性磷酸酶共扼的抗熒光素抗體檢測(cè)它。在底物反應(yīng)后，可以使用光學(xué)顯微鏡觀察染色細(xì)胞。結(jié)果FasL和FasL-GFP蛋白的功能分析為了證實(shí)Fas配體-GFP(FasL-GFP)融合蛋白保留了全部FasL活性，我們已經(jīng)通過(guò)使用將DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入對(duì)Fas-介導(dǎo)的凋亡敏感的細(xì)胞而分析和比較FasL和FasL-GFP蛋白的功能。使用表達(dá)FasL、GFP-FasL或作為對(duì)照品的GFP-半乳糖苷酶的載體轉(zhuǎn)染一式三份孔的HeLa細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，將細(xì)胞固定并通過(guò)使用TUNEL試劑盒對(duì)凋亡進(jìn)行分析。一般來(lái)說(shuō)，如通過(guò)使用pcDNA3-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的X-Gal染色所測(cè)定，獲得了10-25％的轉(zhuǎn)染效率。用表達(dá)FasL或FasL-GFP的載體轉(zhuǎn)染的大量HeLa細(xì)胞顯示出凋亡形態(tài)(諸如膜起泡且粘著力下降)且在TUNEL試驗(yàn)中染色呈陽(yáng)性。極少量感染了對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞發(fā)生凋亡。用FasL-GFP載體轉(zhuǎn)染的孔中凋亡細(xì)胞的數(shù)量以可再現(xiàn)的方式與用FasL載體感染的那些細(xì)胞的數(shù)量相似，從而提示野生型蛋白和融合蛋白具有可比的活性。腺病毒載體的構(gòu)建和特征我們的目的是生產(chǎn)大量的FasL表達(dá)可以得到調(diào)節(jié)的腺病毒載體。這種調(diào)節(jié)使FasL在靶細(xì)胞中的表達(dá)水平得到控制且由此有利于對(duì)其生物效應(yīng)的研究。此外，預(yù)計(jì)在293細(xì)胞中以組成型方式表達(dá)FasL或FasL-GFP的rAd載體的擴(kuò)增可產(chǎn)生低的滴度，因?yàn)镕asL表達(dá)引起產(chǎn)生病毒的細(xì)胞的凋亡。Muruve，D.A.，A.G.Nicolson，R.C.Manfro，T.B.Strom，V.P.Sukhatme和T.A.Libermann.(1997)“全身給藥后Fas配體的腺病毒介導(dǎo)的表達(dá)誘導(dǎo)肝凋亡且離體的凋亡感染胰島同種異體移植物和同種移植物”(″Adenovirus-mediatedexpressionofFasligandinduceshepaticapoptosisafterSystemicadministrationandapoptosisofexvivoinfectedpancreaticisletallograftsandisografts″)-《人類基因療法》(HumGeneTher)895563。為了實(shí)現(xiàn)FasL-GFP的受控表達(dá)，我們?cè)O(shè)計(jì)了Ad/FasL-GFPTET載體，其中由TRE啟動(dòng)子表達(dá)FasL-GFP。Gossen，M.和H.Bujard.(1992)“通過(guò)四環(huán)素效應(yīng)啟動(dòng)子嚴(yán)格控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)”(″Tightcontrolofgeneexpressioninmammaliancellsbytetracycline-responsivepromoters″)-《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(ProcNatlAcadSciUSA)895547-51。我們將CMVie啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的tTA基因(“tet-關(guān)閉”元件)插入Ad5E1區(qū)且TRE-控制的FasL-GFP融合蛋白接近右側(cè)ITR。這種策略基于如下考慮。首先，這種策略使用單一載體而不是如上所述的兩種Ad載體來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)完整的tet-調(diào)節(jié)的表達(dá)系統(tǒng)。Harding，T.C.，B.J.Geddes，D.Murphy，D.Knight和J.B.Uney.(1998)“使用腺病毒四環(huán)素可調(diào)節(jié)系統(tǒng)接通轉(zhuǎn)基因表達(dá)”(″Switchingtransgeneexpressioninthebrainusinganadenoviraltetracycline-regulatablesystem″)，參見(jiàn)《國(guó)家生物技術(shù)》(NatBiotechnol)16553-5備注。單一載體的應(yīng)用使得向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)更為有效且對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)更為均勻。這種策略還在CMVie啟動(dòng)子與TRE啟動(dòng)子的增強(qiáng)子元件之間實(shí)現(xiàn)了最大可能的分離，從而將FasL-GFP蛋白的背景(未調(diào)節(jié)的)表達(dá)減少到最低限度(附圖1B和1C)。通過(guò)在Ad5基因組的右側(cè)端放置TRE啟動(dòng)子，獲得了與位于Ad5包裝信號(hào)內(nèi)的E1A增強(qiáng)子元件相似的結(jié)果。Hearing，P.和T.Shenk.1983。5型腺病毒E1A轉(zhuǎn)錄控制區(qū)含有重復(fù)的增強(qiáng)子元件?！都?xì)胞》(Cell)33695-703。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了這些元件與克隆入E1區(qū)的某些啟動(dòng)子發(fā)生相互作用。Shi，Q.，Y.Wang和R.Worton.(1997)“腺病毒載體中細(xì)胞啟動(dòng)子的特異性和活性的調(diào)節(jié)”(″Modulationofthespecificityandactivityofacellularpromoterinanadenoviralvector″)-《人類基因療法》(HumGeneTher)8403-10。如附圖1C所示，以大規(guī)模連接反應(yīng)體外組裝用于本發(fā)明的重組腺病毒載體基因組。然后對(duì)這些基因組進(jìn)行凝膠純化并轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞且使所得的培養(yǎng)物進(jìn)行增殖，直到觀察到病毒誘導(dǎo)的CPE為止。就表達(dá)-半乳糖苷酶或GFP的載體而言，CPE發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)明顯早于表達(dá)FasL或FasL-GFP的時(shí)間點(diǎn)，從而表明腺病毒載體的復(fù)制可能因FasL活性而具有有害的影響。按照已有的技術(shù)擴(kuò)增原始載體儲(chǔ)備液，并提取重組腺病毒DNA且使用限制酶消化液檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)完整性。293細(xì)胞中Ad/FasL和Ad/FasL-GFPTET的滴度一般低于Ad/LacZ或Ad/GFP的滴度30-100倍。Ad載體的滴度與FasL活性的比較證實(shí)當(dāng)它們?cè)?93CrmA細(xì)胞中產(chǎn)生時(shí)(附圖2)，這些載體的產(chǎn)率明顯增加(8-12倍)。正如附圖2中所示，293或293CrmA細(xì)胞中對(duì)照載體Ad/LacZ的擴(kuò)增使產(chǎn)率基本上相同。隨后，在293CrmA細(xì)胞中進(jìn)行具有FasL活性的所有載體的生產(chǎn)和擴(kuò)增。通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的FasL表達(dá)誘導(dǎo)凋亡為了在功能上證實(shí)腺病毒介導(dǎo)的FasL表達(dá)，我們用Ad/FasL-GFPTET以不同的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)，分析細(xì)胞的凋亡情況。感染了Ad/FasL-GFPTET的細(xì)胞顯示出典型的凋亡形態(tài)。凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨載體滴度的增加而增加。相反，以相同MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)了對(duì)照載體Ad/LacZ的平板，在過(guò)量的未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照品中沒(méi)有產(chǎn)生凋亡的細(xì)胞。通過(guò)X-gal染色測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的總效率且證實(shí)-半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量隨MOI的增加而增加。我們已經(jīng)觀察到凋亡的細(xì)胞的數(shù)量顯著高于帶有可檢測(cè)到GFP熒光的細(xì)胞或同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)的X-gal染色細(xì)胞的數(shù)量。因此，通過(guò)感染細(xì)胞表面上FasL與其相鄰細(xì)胞表面上Fas受體的相互作用，導(dǎo)致未感染所述載體而與所述細(xì)胞相鄰的細(xì)胞發(fā)生凋亡。FasL-GFP融合蛋白的檢測(cè)和細(xì)胞定位野生型FasL是II型膜蛋白。為了證實(shí)FasL-GFP融合蛋白也靶向至細(xì)胞膜，我們利用了其GFP成分的熒光，可以使用帶FITC濾光片部件的熒光顯微鏡在活細(xì)胞中檢測(cè)到這種熒光。我們已經(jīng)將這種技術(shù)用于在由rAd載體表達(dá)時(shí)觀察我們的FasL-GFP融合蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位。在HeLa細(xì)胞中，F(xiàn)asL-GFP的表達(dá)在接近GFP檢測(cè)閾值的蛋白質(zhì)水平上導(dǎo)致凋亡。因此，分析初級(jí)大鼠成肌細(xì)胞中FasL-GFP的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞相對(duì)耐受FasL-誘導(dǎo)的凋亡。在用Ad/FasL-GFPTET以MOI為10感染后24小時(shí)，在成肌細(xì)胞中可以檢測(cè)到高水平的FasL-GFP表達(dá)。在大部分轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中，F(xiàn)asL-GFP的膜相關(guān)表達(dá)是明顯的。相反，GFP自身的熒光模式在細(xì)胞質(zhì)中分布均勻，而通常不分布在細(xì)胞核。這些定位差異在較高的放大倍數(shù)下的轉(zhuǎn)導(dǎo)的293CrmA細(xì)胞中也是明顯的。這些結(jié)果表明FasL-GFP融合蛋白定向于細(xì)胞表面，在那里它以與野生型FasL類似的方式與Fas受體發(fā)生相互作用。由rAd載體調(diào)節(jié)FasL-GFP的表達(dá)為了證實(shí)本發(fā)明的載體具有調(diào)節(jié)靶細(xì)胞中由我們的rAd載體產(chǎn)生的FasL活性的量的能力，我們已經(jīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)來(lái)在誘導(dǎo)或非誘導(dǎo)條件下和蛋白質(zhì)合成與功能水平上建立FasL表達(dá)水平。在Ad/FasL-GFPTET載體中，將FasL-GFP融合蛋白的表達(dá)設(shè)計(jì)成被tetR-VP16融合蛋白(由相同載體的組成型表達(dá)；參見(jiàn)附圖1C)與最小CMVie啟動(dòng)子的tet-操縱子上游的七聚物結(jié)合所激活。Gossen，M.和H.Bujard.(1992)“使用四環(huán)素效應(yīng)啟動(dòng)子嚴(yán)格控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因表達(dá)”(″Tightcontrolofgeneexpressioninmammaliancellsbytetracycline-responsivepromoters″)-《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(ProcNatlAcadSciUSA)895547-51。細(xì)胞中存在的強(qiáng)力霉素應(yīng)抑制這種結(jié)合且由此以濃度依賴性方式抑制FasL-GFP的表達(dá)。首先，我們通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析測(cè)定了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中產(chǎn)生的FasL-GFP的量。我們?cè)跊](méi)有或有四環(huán)素衍生物強(qiáng)力霉素存在的情況下以MOI為2使初級(jí)大鼠成肌細(xì)胞感染了Ad/FasL-GFPTET。選擇低MOI以便使轉(zhuǎn)導(dǎo)了所述載體單拷貝的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值。48小時(shí)后，使細(xì)胞裂解并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析、使用針對(duì)FasL胞外結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體分析該裂解物。檢測(cè)到了大于預(yù)計(jì)大小的wtFasL的單特異性帶。帶的強(qiáng)度隨強(qiáng)力霉素濃度的增加而降低且在有0.5mg/L或0.5mg/L以上濃度強(qiáng)力霉素存在情況下培養(yǎng)的細(xì)胞裂解物中不能檢測(cè)到這種帶。在轉(zhuǎn)導(dǎo)了對(duì)照載體的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到FasL-特異性帶。在細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)基上清液中沒(méi)有檢測(cè)到相當(dāng)于分解或裂解產(chǎn)物的尺寸較小的帶。這些結(jié)果表明由Ad/FasL-GFPTET載體在細(xì)胞中產(chǎn)生的GFP-FasL蛋白的量可以受到培養(yǎng)基中強(qiáng)力霉素濃度的調(diào)節(jié)且這種蛋白質(zhì)是穩(wěn)定的，而且一旦出現(xiàn)在細(xì)胞表面上則不會(huì)發(fā)生明顯的裂解。我們還分析了FasL活性的調(diào)節(jié)，即在Fas-陽(yáng)性靶細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。以MOI為2給HeLa細(xì)胞的孔轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad/FasL-GFPTET并在由不同濃度強(qiáng)力霉素存在的情況下培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后24小時(shí)時(shí)，分析細(xì)胞的凋亡表型。結(jié)果證實(shí)可以用強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)了Ad/FasLGFPTET的細(xì)胞中凋亡的誘導(dǎo)。在我們選擇的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)系統(tǒng)中，存在的強(qiáng)力霉素抑制了tTA與TRE的結(jié)合并以劑量依賴性方式切斷了FasL-GFP的轉(zhuǎn)錄。我們選擇將以組成型方式表達(dá)的活化子插入E1區(qū)并將FasL-GFP表達(dá)盒插入Ad5的E4啟動(dòng)子與右側(cè)ITR之間的新克隆位點(diǎn)，推斷這種排列將腺病毒包裝區(qū)內(nèi)存在的E1A啟動(dòng)子和TRE上tTA啟動(dòng)子內(nèi)的CMVie增強(qiáng)子的作用減小到最低限度，并由此在抑制劑存在情況下減少了所述融合蛋白的背景表達(dá)。該系統(tǒng)成功地在腺病毒載體內(nèi)使用，使得FasL-GFP的表達(dá)可以通過(guò)改變培養(yǎng)基內(nèi)強(qiáng)力霉素的濃度來(lái)有效調(diào)節(jié)。在我們的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們已經(jīng)觀察到293細(xì)胞對(duì)FasL-誘導(dǎo)的凋亡敏感。這種效應(yīng)起顯著限制表達(dá)FasL的rAd載體滴度的作用。這一結(jié)果即使在將調(diào)節(jié)的或組織特異性啟動(dòng)子用于表達(dá)FasL蛋白時(shí)也是確實(shí)的，因?yàn)楦咚降牡鞍踪|(zhì)表達(dá)在293細(xì)胞內(nèi)載體復(fù)制過(guò)程中是不可避免的。為了克服這一問(wèn)題，我們已經(jīng)生產(chǎn)了以組成型方式表達(dá)CrmA的293細(xì)胞系。這種蛋白質(zhì)特異性地起抑制半胱氨酸天冬酶的活性的作用，半胱氨酸天冬酶對(duì)Fas凋亡途徑而言是必不可少。通過(guò)在這些細(xì)胞中生產(chǎn)我們的含有FasL的載體，我們已經(jīng)在載體滴度上獲得了顯著改善?？傊?，我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)并測(cè)試了在四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)系統(tǒng)控制下表達(dá)新型FasL-GFP融合蛋白的rAd載體。這種載體將向分裂與未分裂細(xì)胞的高滴度和有效轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)運(yùn)與在活細(xì)胞和固定細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)的便利調(diào)節(jié)和融合蛋白的方便檢測(cè)結(jié)合起來(lái)。這種載體是用于通過(guò)免疫學(xué)、移植和癌癥療法治療疾病的有價(jià)值的工具。實(shí)施例3使用Fas配體融合基因的腺病毒轉(zhuǎn)運(yùn)的旁觀者基因療法本實(shí)施例描述了使用通過(guò)旁分泌/自分泌機(jī)制誘導(dǎo)前列腺腺癌發(fā)生凋亡(程序性細(xì)胞死亡)的Fas配體-融合基因手段的一類旁觀者基因療法。這項(xiàng)工作為治療前列腺癌(PCa)提供了新型和有效的療法。此外，可以使用組織特異性啟動(dòng)子獲得對(duì)前列腺或任意其它組織的特異性以便以非腸道方式轉(zhuǎn)運(yùn)治療轉(zhuǎn)移型疾病的病毒。我們的治療手段是用E1A、E3和E4缺失的第二代腺病毒轉(zhuǎn)運(yùn)并表達(dá)Fas配體(CD95L-融合基因)。CD95L的表達(dá)受到允許在體外和體內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)的Tet操縱子的控制。本建議中所用的CD95L是這樣的鼠CD95LcDNA，在鼠CD95LcDNA的N末端截短了10個(gè)氨基酸并且其被融合在這樣的框架中，該框架在增強(qiáng)的GFP的C末端帶有一個(gè)4氨基酸接頭。表1中列出了我們使用5種PCa細(xì)胞系的數(shù)據(jù)且一般性地證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)(Hedlund等《前列腺》(TheProstate)3692-101，1998；和Rokhlin等《癌癥研究》(Can.Res.)571758-1768，1997)，其證實(shí)PCa細(xì)胞系對(duì)CH-11興奮劑活性有耐受性。相反，目前我們證實(shí)了迄今為止測(cè)試的全部5種PCa細(xì)胞系中對(duì)AdGFP-FasL和C2-神經(jīng)酰胺的敏感性。使用MTS測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞毒性百分比。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將細(xì)胞接種入含有1ml培養(yǎng)基的12孔平板。在處理前使細(xì)胞生長(zhǎng)至75％的融合率并用500ng/mlCH-11抗-Fas抗體、500ng/ml正常小鼠血清或30μMC2-神經(jīng)酰胺處理。為了進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，以MOI為10-1000用Ad/CMVGFP或Ad/GFP-FasLTET處理約1×105個(gè)細(xì)胞/孔。就每一細(xì)胞系而言，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照不作處理并將1ml培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。將細(xì)胞在37℃下保溫48小時(shí)以最大限度地殺滅細(xì)胞。吸出培養(yǎng)基并用0.5ml新鮮培養(yǎng)基+100μlCellTiter967AqueousOneSolution試劑/孔替代。在37℃下將細(xì)胞再保溫1-3小時(shí)。保溫后，將120μl培養(yǎng)基放入96孔平板并使用Vmax動(dòng)態(tài)微量培養(yǎng)板讀出器在490nm處讀取吸收度讀數(shù)。如下計(jì)算細(xì)胞毒性百分比％細(xì)胞毒性＝[1-(實(shí)驗(yàn)孔的OD/陽(yáng)性對(duì)照孔的OD)]×100。為了進(jìn)行神經(jīng)酰胺試驗(yàn)，將1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔平板上。第二天早上洗滌細(xì)胞并與100μl的30μM二氫-神經(jīng)酰胺或C2-神經(jīng)酰胺一起(稀釋自10mM的乙醇原液)在不含血清的RPMI1640中溫育。24小時(shí)后，向各孔中加入20μlCelltiter967AqueousOneSolution試劑并將平板再溫育1-4小時(shí)。如上所述測(cè)定吸收度和％細(xì)胞毒性。在每一實(shí)驗(yàn)中均將數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行一式三份的記錄。結(jié)果表1中分析的5種PCa細(xì)胞系顯然對(duì)CH-11極不敏感。對(duì)劑量為30μl的C2-神經(jīng)酰胺的敏感性相對(duì)一致，從而提示凋亡途徑是完整的。最重要的是所有的細(xì)胞系均對(duì)給予AdGFP-FasL有響應(yīng)，其中DU145最不敏感。通過(guò)這些實(shí)驗(yàn)得到了重要的幾點(diǎn)。首先，我們使用FACS分析證實(shí)就我們使用的所有細(xì)胞系而言，對(duì)全部候選PCa細(xì)胞系表達(dá)了CD95(Fas受體)。其次，我們證實(shí)阻斷抗體(ZB4)的fas受體不會(huì)通過(guò)AdGFP-FasL防止誘導(dǎo)凋亡。我們已經(jīng)使用不同劑量的ZB4進(jìn)行了幾次這種實(shí)驗(yàn)，結(jié)果始終是病毒在有或沒(méi)有所述抗體存在下誘導(dǎo)的凋亡程度相同。這一結(jié)果提示新合成的CD95-CD95L可能會(huì)在達(dá)到質(zhì)膜的途中或在達(dá)到細(xì)胞表面時(shí)作為執(zhí)行的和功能性凋亡信號(hào)復(fù)合體在高爾基體中發(fā)生相互作用(Bennett等《科學(xué)》(Science)282290-293，1998)。第三，我們的結(jié)果證實(shí)了不存在有利于PCa中誘導(dǎo)凋亡的腺病毒的內(nèi)在特性。這一結(jié)果通過(guò)用對(duì)照病毒(AdCMVGFP)+500ng/mlCH11感染PCa而得到證實(shí)。結(jié)果是CH-11仍然難以誘導(dǎo)凋亡。這些結(jié)果表明凋亡僅在CD95+-CH11抗性PCa細(xì)胞系中發(fā)生，此時(shí)發(fā)生病毒指導(dǎo)的CD95L胞內(nèi)表達(dá)且它不依賴于病毒。最終和最相關(guān)的部分信息涉及我們是否可以給予AdGFP-FasLTET而不會(huì)對(duì)受試者產(chǎn)生致死性。這在重要性方面非常關(guān)鍵，因?yàn)楫?dāng)以非腸道方式給藥時(shí)，低至2×108pfu的病毒劑量會(huì)殺死小鼠。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，使PPC1異種移植物在Balbcnu/nu小鼠體內(nèi)發(fā)育并用不同劑量的AdCMVGFP對(duì)照或AdGFP-FasL病毒治療。從這些單劑量研究中。我們已經(jīng)證實(shí)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)得到延緩或終止。此外，用病毒治療的14只動(dòng)物中沒(méi)有1只因這種病毒而死亡?？傊?，我們得出結(jié)論我們的Ad5轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的GFP-FasL融合蛋白對(duì)治療PCa具有強(qiáng)有力的治療潛能。由強(qiáng)力霉素增量調(diào)節(jié)的AdGFP-FasL類型的研制以原位方式(orthotopically)將我們目前的病毒用于給予PCa。如果該病毒脫離了腫瘤并進(jìn)入體內(nèi)，那么它可能是致死性的，條件是足夠的病毒到達(dá)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(主要是肝臟)。通過(guò)給予強(qiáng)力霉素(dox)，可以減量調(diào)節(jié)由AdGFP-FasL表達(dá)CD95L且避免這種危險(xiǎn)。通過(guò)使用實(shí)施例1中所列的Tet調(diào)節(jié)元件構(gòu)建由表現(xiàn)出″極低″基礎(chǔ)活性強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的表達(dá)載體。相對(duì)于GFP-FasL的表達(dá)，這種載體在沒(méi)有dox存在的情況下被完全抑制，且在10ng/ml下開(kāi)始誘導(dǎo)，最大誘導(dǎo)值為100-500ng/ml。這樣的劑量在人體中容易實(shí)現(xiàn)(一般劑量水平為1-3μlg/ml)。如果觀察到不良作用，則終止給予dox。然而，強(qiáng)力霉素具有16小時(shí)的血清半衰期，我們認(rèn)為添加dox以減量調(diào)節(jié)Fas配體的表達(dá)這一論斷，對(duì)治療患者體內(nèi)的不良作用而言可能是較好的論斷，因?yàn)槲覀兛梢酝ㄟ^(guò)非腸道給藥在幾分鐘內(nèi)迅速獲得有效的強(qiáng)力霉素劑量。如果必要，PEST信號(hào)的添加可以加速降解(參見(jiàn)Clontech目錄)。方法我們用rTSkidB/C和rtTA系統(tǒng)替換了我們目前的Tet阻抑物和操縱子系統(tǒng)(Freundlieb等《基因藥物雜志》(J.GeneMed.)14-12，1999)。早已指出，我們可以將我們的前列腺特異性啟動(dòng)子(PSA、PSADBam、PB和ARRPB2，附錄)放入病毒(取代CMVie)以獲得組織特異性，其中僅前列腺內(nèi)皮細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)rtTA。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使所有病毒從經(jīng)PCR評(píng)價(jià)野生型腺病毒為陰性的3X噬斑純化的樣品中生長(zhǎng)。使所有病毒在有1μg/ml強(qiáng)力霉素存在情況下在以組成型方式表達(dá)牛痘病毒細(xì)胞因子應(yīng)答調(diào)節(jié)物crmA的HEK293包裝細(xì)胞系中生長(zhǎng)。Rubinchik等。這對(duì)防止在所述的包裝細(xì)胞系中發(fā)生GFP-FasL誘導(dǎo)的凋亡而言是必不可少的。始終通過(guò)在CsCl上等密度離心來(lái)純化病毒、通過(guò)層析法脫鹽、通過(guò)過(guò)濾濃縮并以少量等分部分形式凍存在10％甘油的PBS中，凍存溫度為-80℃。僅使病毒融化一次并在麻醉?xiàng)l件下、通過(guò)如上所述以15μl/分鐘輸注或通過(guò)尾靜脈使用結(jié)核菌素注射器將其給予動(dòng)物。收集腫瘤和動(dòng)物組織，如果合適將其制成切片、或者固定并包埋，并且通過(guò)H&E進(jìn)行分析、通過(guò)隧道(tunel)試驗(yàn)分析凋亡、并使用免疫染色以便測(cè)定嗜中性白細(xì)胞浸潤(rùn)和相關(guān)的GFP表達(dá)。測(cè)試Balbcnu/nu小鼠中前列腺癌同種異體移植物的原始AdGFP-FasLTetd(dox減量調(diào)節(jié)的)。進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)以建立毒理學(xué)和功效參數(shù)。具體地說(shuō)，我們將增加劑量的1×109-5×1010pfuAdGFP-FasLTetd輸注入75-100mm3腫瘤以便測(cè)定A)原位給予病毒后減少75％或75％以上腫瘤體積所需的最低成功劑量，其中每4天給予1次劑量和3次劑量。腫瘤形成自CD95L敏感性PPC1、即刻敏感性LnCAPC2-4和更具耐受性的Du145細(xì)胞系。基于使用始終為腫瘤消退的終點(diǎn)的結(jié)果顯示給藥的其它參數(shù)。B)原位給藥后的最高耐受病毒劑量(達(dá)5×1010pfu)。C)確定腫瘤是否在以后的時(shí)間(6-12個(gè)月)的相同或較遠(yuǎn)的部位上重新發(fā)生(C4-2)。D)50％小鼠存活的靜脈內(nèi)給予(尾靜脈)的最高劑量。E)使用來(lái)自D的數(shù)據(jù)測(cè)試強(qiáng)力霉素給藥對(duì)動(dòng)物存活曲線的作用和強(qiáng)力霉素保護(hù)作用期限(Balbcnu/nu小鼠對(duì)CTL沒(méi)有響應(yīng)，所以腺病毒可能長(zhǎng)時(shí)間存活)。使用應(yīng)用單側(cè)t-檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。F)通過(guò)在有1μg/mldox存在情況下使用FACS分析監(jiān)測(cè)GFP(作為GFP-FasL融合體)來(lái)測(cè)定K562細(xì)胞(CD95L抗性，參見(jiàn)表1)中GFP-FasL的半衰期。使用如上所述構(gòu)建的Tet誘導(dǎo)型病毒進(jìn)行與如上述B1中所述相同的一組實(shí)驗(yàn)。給予正常實(shí)驗(yàn)室小獵犬的AdGFP-FasLTetu(增量調(diào)節(jié)的)和AdGFP-FasLTetd(減量調(diào)節(jié)的)的毒理學(xué)測(cè)試。盡管存在大量PCa用動(dòng)物模型，但是只有狗模型可以充分代表病理學(xué)和解剖學(xué)上的人體疾病。目前已經(jīng)證實(shí)人AdRSVbgal(血清型5)腺病毒可以在體外和體內(nèi)感染狗內(nèi)皮細(xì)胞，包括前列腺腫瘤細(xì)胞。Andrawiss等《前列腺癌與前列腺疾病》(ProstaticCan.ProstaticDis.)225-35，1999。對(duì)目前這種Ad/GFP-FasTET在狗(免疫活性)與免疫缺失小鼠(Balbcnu/nu)體內(nèi)的比較，為這種基因療法手段的人體I期臨床試驗(yàn)再次提供了支持。在下面的部分中，對(duì)性成熟正常狗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以便觀察將Ad/GFP-FasLTET正位轉(zhuǎn)運(yùn)至激素前列腺是否具有最低程度的損害或沒(méi)有附帶的損害。通過(guò)腹部手術(shù)手段將純化的濃縮腺病毒(均為血清型5的增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié)的Ad/GFP-FasLTET和報(bào)告基因病毒Ad/CMV-LacZ)注入狗的一葉前列腺。此方法優(yōu)選跨直腸導(dǎo)入，因?yàn)閾?jù)信對(duì)前列腺直接觀察可以在首先進(jìn)行的這一系列實(shí)驗(yàn)中使病毒的導(dǎo)入更為精確。其次，由于狗前列腺的高血管密度特性，所以直接進(jìn)行肉眼觀察允許我們使用局部組織粘性物和手指壓力來(lái)密封針跡，從而防止病毒從注射部位滲漏?；谶@些結(jié)果，將3D超聲引導(dǎo)的跨直腸導(dǎo)入用于模擬提出的人體手段之一。在400μl的恒定體積中使用5×109；1×1010、和5×1010的病毒劑量2條狗為一組地接受5×1010pfu的Ad/CMV-LacZ以便對(duì)病毒擴(kuò)散進(jìn)行組織化學(xué)監(jiān)測(cè)。在接近前72小時(shí)內(nèi)監(jiān)測(cè)狗的任何痛苦的癥候。收集糞便并通過(guò)PCR分析病毒釋放情況。另外用foley導(dǎo)管收集尿并通過(guò)PCR對(duì)293細(xì)胞檢測(cè)釋放的病毒。在第7天時(shí)使用戊巴比妥鈉實(shí)施安樂(lè)死(2條狗/病毒劑量)并如上所述進(jìn)行處理。(Andrawiss等《前列腺癌與前列腺疾病》(ProstaticCan.ProstaticDis.)225-35，1999)。將所有的組織樣品冷凍在OCT中，而將剩余物固定并進(jìn)行處理以用于組織學(xué)分析(tunel、免疫組織化學(xué))或冷凍儲(chǔ)存在-80℃下用于DNA提取和使用病毒特異性引物的PCR。在Ad/CMV-LacZ組中檢驗(yàn)LacZ的表達(dá)以監(jiān)測(cè)病毒在全身的擴(kuò)散情況。實(shí)施例4Ad/GFP-FasLTET的腫瘤內(nèi)導(dǎo)入，在小鼠體內(nèi)抑制了乳腺腫瘤和腦腫瘤生長(zhǎng)在本實(shí)驗(yàn)中，我們將106個(gè)MCF-7細(xì)胞從雙側(cè)面植入Balbcnu/nu小鼠(附圖6)。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到5mm直徑時(shí)，我們使用Harvard輸注泵在超過(guò)10分鐘的期限內(nèi)，以15μl/分鐘將2×109pfuAd/GFP-FasLTET輸注入小鼠右側(cè)面上的腫瘤或?qū)?×109pfuAd/LacZ輸注入小鼠左側(cè)面。在注射后3周時(shí)，與對(duì)照組治療的腫瘤相比，注射了Ad/FasLGFPTET的所有腫瘤均顯示出了約80-100％的腫瘤消退。特別是在6只治療小鼠中的4只中，在注射一次后大部分腫瘤塊消失(黃色箭頭指示的)。在6只小鼠中的另外2只中，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)塊的抑制比同一小鼠對(duì)照側(cè)面上的腫瘤高80％(黑色箭頭指示的)。相反，所有注射了Ad/LacZ的腫瘤在植入后3周時(shí)直徑均生長(zhǎng)至約2cm。對(duì)某些小鼠殘余腫瘤的組織學(xué)分析僅顯示了浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，沒(méi)有明顯的癌細(xì)胞殘留。這一結(jié)果表明可以將FasL-誘導(dǎo)的凋亡用作治療乳腺癌的新型療法。類似地，我們將106個(gè)SF767細(xì)胞植入了Balbcnu/nu小鼠雙側(cè)面。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到5mm直徑時(shí)，我們使用Harvard輸注泵在超過(guò)10分鐘的期限內(nèi)，以15μl/分鐘將2×109pfuAd/GFP-FasLTET輸注入小鼠右側(cè)上的腫瘤或?qū)?×109pfuAd/LacZ輸注入小鼠左側(cè)。與未治療的腫瘤相比，經(jīng)治療腫瘤內(nèi)的腫瘤抑制率約為80-100％。相反，所有注射了Ad/LacZ的腫瘤在植入后3周時(shí)直徑均生長(zhǎng)至約2cm。這一結(jié)果表明可以將FasL-誘導(dǎo)的凋亡用作治療腦癌的新型療法。實(shí)施例5在體外，癌細(xì)胞對(duì)FasL-和TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡的敏感性比較在本實(shí)施例中，在體外比較了不同癌細(xì)胞系(來(lái)源于前列腺、子宮頸和肝癌)對(duì)FasL-和TRAIL-介導(dǎo)的凋亡的敏感性。將TRAIL，Ad.TRAIL/GFPTET的表達(dá)載體用于在這些癌細(xì)胞中表達(dá)TRAIL。附圖3中說(shuō)明了Ad.TRAIL/GFPTET的構(gòu)建。與Ad/FasL-GFPTET相似，該載體含有由E1區(qū)中CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的反式激活蛋白和處于E4區(qū)中TRE啟動(dòng)子控制下的TRAIL-IRES-GFP表達(dá)盒，這樣，可以通過(guò)向培養(yǎng)基中添加強(qiáng)力霉素來(lái)調(diào)節(jié)TRAIL和GFP的表達(dá)。腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)允許由相同的mRNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)兩種基因。盡管GFP不與凋亡蛋白TRAIL融合，但是其表達(dá)與TRAIL的表達(dá)相關(guān)。由于TRAIL位于GFP和IRES序列之前，其表達(dá)水平應(yīng)高于GFP幾倍。Liu等(2000)“以預(yù)定水平穩(wěn)定表達(dá)多基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的產(chǎn)生”(″Generationofmammaliancellsstablyexpressingmultiplegenesatpredeterminedlevels″)-《分析生物化學(xué)》(Anal.Biochem.)28020-28。這一結(jié)果確保了在可以使用UV顯微鏡觀察到GFP表達(dá)的細(xì)胞中TRAIL的高水平表達(dá)。為了測(cè)定TRAIL表達(dá)是否可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡，我們將TRAIL轉(zhuǎn)導(dǎo)入4種不同的癌細(xì)胞系LNCaP(前列腺)、HeLa(子宮頸)、A549(肺)和C3A(肝)。我們用Ad.TRAIL/GFPTET在相同的MOI為10的情況下感染了這些細(xì)胞。所有這些細(xì)胞均表現(xiàn)出對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡的敏感性，其敏感性水平不同，且這些敏感性看起來(lái)低于癌細(xì)胞對(duì)FasL的敏感性。為了證實(shí)這一觀察結(jié)果，我們已經(jīng)在平行實(shí)驗(yàn)中比較了FasL-GFP與TRAIL在誘導(dǎo)凋亡中的功效。我們用Ad/GFP、Ad/FasLGFPTET和Ad.TRAIL/GFPTET以類似的MOI感染了所述癌細(xì)胞。與FasL-敏感性研究相似(如上所述)，通過(guò)表達(dá)GFP的細(xì)胞的數(shù)量分析這些細(xì)胞的敏感性，并且基于在這些初步實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞形態(tài)確定對(duì)FasL和TRAIL誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。正如附圖4中的″TRAIL″組所示，細(xì)胞表現(xiàn)出不同水平的凋亡。在所有經(jīng)測(cè)試的細(xì)胞中，在Ad.TRAIL/GFPTET感染孔中發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量少于感染了Ad/FasL-GFPTET的孔中發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量(用″FasL″標(biāo)記的組)，從而提示LNCaP、HeLa、A549和C3A細(xì)胞對(duì)FasL誘導(dǎo)的凋亡比對(duì)TRAIL-誘導(dǎo)的凋亡更為敏感。實(shí)施例6.腺病毒介導(dǎo)的TRAIL表達(dá)，在癌細(xì)胞、而不是正常成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡認(rèn)為TRAIL腫瘤療法的主要優(yōu)點(diǎn)之一在于據(jù)推定TRAIL表達(dá)對(duì)正常細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)低于FasL的毒性，而仍然會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中的凋亡。為了測(cè)試這種″腫瘤特異性″，我們用Ad.TRAIL/GFPTET以MOI約為10轉(zhuǎn)導(dǎo)了正常人成纖維細(xì)胞。我們從包皮樣品中獲得了初級(jí)早期傳代的成纖維細(xì)胞并對(duì)其測(cè)試了它們對(duì)我們的Ad/FasL-GFPTET和Ad.TRAIL/GFPTET載體誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)初級(jí)人成纖維細(xì)胞對(duì)FasL-GFP誘導(dǎo)的凋亡十分敏感，使得即使在低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下，它們中的大部分也會(huì)顯示出標(biāo)準(zhǔn)的凋亡形態(tài)(附圖5，F(xiàn)asL組)。相反，用表達(dá)TRAIL的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的初級(jí)成纖維細(xì)胞基本上不受影響，即使在MOI高于用于轉(zhuǎn)運(yùn)FasL-GFP的MOI5倍的情況下也是如此(附圖5，TRAIL×5)。我們由此證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)即使在來(lái)自我們腺病毒載體的高表達(dá)水平的情況下，TRAIL也不會(huì)在正常細(xì)胞中誘導(dǎo)明顯的凋亡。這些結(jié)果提示載體介導(dǎo)的TRAIL的腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)可能甚至比FasL更為安全。盡管已經(jīng)參照本發(fā)明的某些實(shí)施方案的特定記載描述了本發(fā)明，但是并不應(yīng)將這類描述看作對(duì)本發(fā)明范圍的限制，除非它們包含在待批權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在本申請(qǐng)中，參照各種公開(kāi)文獻(xiàn)。將這些公開(kāi)文獻(xiàn)的全部公開(kāi)內(nèi)容引入本文作為參考以便更完整地描述本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)的情況。表1用抗-Fas抗體、C2-神經(jīng)酰胺(22小時(shí))或Ad/GFP-FasLTET治療48小時(shí)的前列腺癌細(xì)胞系中Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(表示為％細(xì)胞毒性SD)*MOI10，HMOI1000。在全部實(shí)驗(yàn)中N＝3(除了在使用TSU和PC-3的神經(jīng)酰胺實(shí)驗(yàn)時(shí)，N＝2)。使用MTS測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞毒性百分比。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將細(xì)胞接種入含有1ml培養(yǎng)基的12孔平板。在處理前使細(xì)胞生長(zhǎng)至75％的融合率并用500ng/mlCH-11抗-Fas抗體、500mg/ml正常小鼠血清或30μMC2-神經(jīng)酰胺處理。為了進(jìn)行腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，以MOI為10-1000用Ad/CMVGFP或Ad/GFP-FasLTET處理約1×105個(gè)細(xì)胞/孔。就每一細(xì)胞系而言，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照不作處理并將1ml培養(yǎng)基用作陰性對(duì)照。將細(xì)胞在37℃下保溫48小時(shí)以最大限度地殺滅細(xì)胞。吸出培養(yǎng)基并用0.5ml新鮮培養(yǎng)基+100μlCellTiter967AqueousOneSolution試劑/孔替代。在37℃下將細(xì)胞再保溫1-3小時(shí)。保溫后，將120μl培養(yǎng)基放入96孔平板并使用Vmax動(dòng)態(tài)微量培養(yǎng)板讀出器在490nm處讀取吸收度讀數(shù)。如下計(jì)算細(xì)胞毒性百分比％細(xì)胞毒性＝[1-(實(shí)驗(yàn)孔的OD/陽(yáng)性對(duì)照孔的OD)]×100。為了進(jìn)行神經(jīng)酰胺試驗(yàn)，將1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔平板上。第二天早上洗滌細(xì)胞并與100μl的30μM二氫-神經(jīng)酰胺或C2-神經(jīng)酰胺一起(稀釋自10mM的乙醇原液)在不含血清的RPMI1640中保溫。24小時(shí)后，向各孔中加入20μlCelltiter96AqueousOneSolution試劑并將平板再溫育1-4小時(shí)。如上所述測(cè)定吸收度和％細(xì)胞毒性。在每一實(shí)驗(yàn)中均將數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行一式三份的記錄。權(quán)利要求1.用于誘導(dǎo)TRAIL-介導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡的方法，該方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入包括表達(dá)TRAIL的受體的細(xì)胞在內(nèi)的一組細(xì)胞中，所述的表達(dá)載體包括編碼TRAIL的多核苷酸序列，所表達(dá)的TRAIL通過(guò)TRAIL與所述受體之間的相互作用誘導(dǎo)那些表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞死亡。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的TRAIL受體是膜結(jié)合受體。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的TRAIL受體是DR4或DR5。4.權(quán)利要求1所述的方法，導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞組包括表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞與不表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞的混合細(xì)胞。5.權(quán)利要求4所述的方法，其中將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞。6.權(quán)利要求4所述的方法，其中將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入確實(shí)表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞。7.權(quán)利要求4所述的方法，其中將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入不表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞和確實(shí)表達(dá)TRAIL受體的細(xì)胞。8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的細(xì)胞組被包含在實(shí)體瘤中。9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的實(shí)體瘤選自乳腺、前列腺、腦、膀胱、胰腺、直腸、甲狀旁腺、甲狀腺、腎上腺、頭頸、結(jié)腸、胃、支氣管和腎的腫瘤。10.權(quán)利要求1所述的方法，其中將表達(dá)載體導(dǎo)入所述細(xì)胞組的步驟通過(guò)非腸道、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)皮、舌下、肌肉內(nèi)、直腸、經(jīng)口含化、鼻內(nèi)、以脂質(zhì)體方式、通過(guò)吸入、陰道、眼內(nèi)、通過(guò)導(dǎo)管或斯滕特固定模的局部轉(zhuǎn)運(yùn)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)或以緩釋劑型來(lái)進(jìn)行操作。11.權(quán)利要求1所述的方法，其中導(dǎo)入所述表達(dá)載體的步驟是通過(guò)將所述表達(dá)載體直接注入所述的細(xì)胞組中來(lái)進(jìn)行的。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的表達(dá)載體是質(zhì)粒。13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的表達(dá)載體是病毒載體。14.權(quán)利要求13所述的方法，所述的病毒載體選自腺病毒、腺伴隨病毒、牛痘、反轉(zhuǎn)錄病毒和單純皰疹病毒載體。15.權(quán)利要求13所述的方法，所述的腺病毒載體是有能力復(fù)制的或無(wú)能力復(fù)制的腺病毒載體。16.權(quán)利要求1所述的方法，其中TRAIL的表達(dá)通過(guò)所述載體內(nèi)的條件啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)，導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞在適宜激活所述條件啟動(dòng)子的條件下表達(dá)TRAIL。17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的條件啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的組織特異性啟動(dòng)子選自前列腺特異性啟動(dòng)子、乳腺特異性啟動(dòng)子、胰腺特異性啟動(dòng)子、結(jié)腸特異性啟動(dòng)子、腦特異性啟動(dòng)子、腎特異性啟動(dòng)子、膀胱特異性啟動(dòng)子、肺特異性啟動(dòng)子、肝特異性啟動(dòng)子、甲狀腺特異性啟動(dòng)子、胃特異性啟動(dòng)子、卵巢特異性啟動(dòng)子和子宮頸特異性啟動(dòng)子。19.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的細(xì)胞組是前列腺癌細(xì)胞且所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是前列腺特異性啟動(dòng)子。20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的前列腺特異性啟動(dòng)子選自PSA啟動(dòng)子、ΔPSA啟動(dòng)子、ARR2PB啟動(dòng)子、前盆啟動(dòng)子、gp91-phox基因啟動(dòng)子和前列腺特異性激肽釋放酶啟動(dòng)子。21.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是肝特異性啟動(dòng)子。22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的肝特異性啟動(dòng)子選自肝清蛋白啟動(dòng)子、α-胎蛋白啟動(dòng)子、α1-抗胰蛋白酶啟動(dòng)子和運(yùn)鐵蛋白運(yùn)甲狀腺素蛋白啟動(dòng)子。23.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是結(jié)腸特異性啟動(dòng)子。24.權(quán)利要求23所述的方法，其中所述的結(jié)腸特異性啟動(dòng)子選自碳酸酐酶I啟動(dòng)子和癌胚的抗原啟動(dòng)子。25.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是卵巢特異性啟動(dòng)子或胎盤特異性啟動(dòng)子。26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的卵巢特異性啟動(dòng)子或胎盤特異性啟動(dòng)子選自雌激素效應(yīng)啟動(dòng)子、芳香酶細(xì)胞色素P450啟動(dòng)子、膽固醇側(cè)鏈分裂P450啟動(dòng)子和17α-羥化酶P450啟動(dòng)子。27.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是乳腺特異性啟動(dòng)子。28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的乳腺特異性啟動(dòng)子選自G.I.erb-B2啟動(dòng)子、erb-B3啟動(dòng)子、β-酪蛋白、β乳球蛋白和乳清酸性蛋白啟動(dòng)子。29.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是肺特異性啟動(dòng)子。30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的肺特異性啟動(dòng)子是表面活性劑蛋白C尿球蛋白啟動(dòng)子。31.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是皮膚特異性啟動(dòng)子。32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的皮膚特異性啟動(dòng)子選自K-14-角蛋白啟動(dòng)子、人角蛋白1啟動(dòng)子、人角蛋白6啟動(dòng)子和羅伊細(xì)克林啟動(dòng)子。33.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是腦特異性啟動(dòng)子。34.權(quán)利要求33所述的方法，其中所述的腦特異性啟動(dòng)子選自膠質(zhì)原纖維酸性蛋白啟動(dòng)子、成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白啟動(dòng)子、髓鞘質(zhì)啟動(dòng)子和酪蛋白羥化酶啟動(dòng)子。35.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是胰腺特異性啟動(dòng)子。36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述的胰腺特異性啟動(dòng)子選自絨毛蛋白啟動(dòng)子、胰高血糖素啟動(dòng)子和胰島素胰島淀粉樣多肽啟動(dòng)子。37.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是甲狀腺特異性啟動(dòng)子。38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述的甲狀腺特異性啟動(dòng)子選自甲狀腺球蛋白和降鈣素啟動(dòng)子。39.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是骨特異性啟動(dòng)子。40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的骨特異性啟動(dòng)子選自α1膠原蛋白啟動(dòng)子、骨鈣素啟動(dòng)子和骨唾液酸糖蛋白啟動(dòng)子。41.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的表達(dá)載體的條件啟動(dòng)子是腎特異性啟動(dòng)子。42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的腎特異性啟動(dòng)子選自腎素啟動(dòng)子、肝/骨/腎堿性磷酸酶啟動(dòng)子和紅細(xì)胞生成素啟動(dòng)子。43.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的條件啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是可由四環(huán)素或強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。45.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是可由類固醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的類固醇選自糖皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素和孕酮。47.權(quán)利要求16所述的方法，該方法進(jìn)一步包括創(chuàng)建適于激活所述條件啟動(dòng)子的條件的步驟。48.權(quán)利要求47所述的方法，其中創(chuàng)建適于激活所述條件啟動(dòng)子的步驟包括將四環(huán)素或強(qiáng)力霉素轉(zhuǎn)運(yùn)至所述細(xì)胞組。49.權(quán)利要求47所述的方法，其中創(chuàng)建適于激活所述條件啟動(dòng)子的步驟包括將類固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至所述細(xì)胞組，所述的類固醇選自糖皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素和孕酮。50.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的表達(dá)載體進(jìn)一步包括報(bào)告基因。51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的表達(dá)載體將報(bào)告基因表達(dá)為帶有TRAIL的融合蛋白。52.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的表達(dá)載體通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)或剪接供體/受體位點(diǎn)機(jī)制將所述的報(bào)告基因雙順?lè)醋拥乇磉_(dá)為帶有TRAIL的單一蛋白。53.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述的報(bào)告基因編碼綠色熒光蛋白。54.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的表達(dá)載體進(jìn)一步含有編碼調(diào)節(jié)蛋白的多核苷酸序列。55.權(quán)利要求54所述的方法，其中所述的表達(dá)載體將所述的調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)為帶有TRAIL的融合蛋白。56.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述融合蛋白中的調(diào)節(jié)蛋白是引起凋亡信號(hào)配體組織特異性定位的蛋白質(zhì)。57.權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法以離體方式進(jìn)行，其中在取自癌癥患者的樣品中含有導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞組。58.權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法在體外進(jìn)行，其中在細(xì)胞培養(yǎng)物中含有導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞組。全文摘要本發(fā)明提供了通過(guò)由死亡配體TRAIL介導(dǎo)的凋亡來(lái)誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的組合物和方法。所述方法包括下列步驟將表達(dá)載體導(dǎo)入包括表達(dá)TRAIL的受體的細(xì)胞在內(nèi)的一組細(xì)胞。所述表達(dá)載體包括編碼TRAIL的多核苷酸序列，所述TRAIL的表達(dá)優(yōu)選由該載體內(nèi)的條件啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)。導(dǎo)入了所述表達(dá)載體的細(xì)胞在條件適宜激活所述條件啟動(dòng)子時(shí)表達(dá)TRAIL。所表達(dá)的TRAIL通過(guò)TRAIL與諸如DR4和DR5這樣的受體之間的相互作用誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL受體的那些細(xì)胞死亡。該方法可以用于以腫瘤位點(diǎn)特異性和劑量可調(diào)節(jié)方式治療腫瘤。文檔編號(hào)A61P35/00GK1744919SQ01817315公開(kāi)日2006年3月8日申請(qǐng)日期2001年9月10日優(yōu)先權(quán)日2000年9月11日發(fā)明者董劍云,詹姆斯·S·諾里斯申請(qǐng)人:南卡羅萊納醫(yī)科大學(xué)研究發(fā)展基金會(huì)