專利名稱：分離轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的方法與組合物,及其在檢測(cè)癌轉(zhuǎn)移性上的應(yīng)用的制作方法
1.前言本發(fā)明涉及檢測(cè)和分離轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液、腹水和腫瘤組織中有轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞的新方法。本發(fā)明還涉及用作細(xì)胞粘附基質(zhì)的新組合物，這些組合物可用來檢測(cè)和分離癌細(xì)胞，并可用作轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液過濾器。本發(fā)明的方法及組合物還可用于試驗(yàn)中以衡量分離得到的癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性，和鑒定具有抑制轉(zhuǎn)移能力的藥物。此外，本發(fā)明還涉及通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞表面表達(dá)的絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶的活性而抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。本發(fā)明依據(jù)的是以下發(fā)現(xiàn)從患者血液、腹水或腫瘤中分離出的癌細(xì)胞優(yōu)先粘附、降解和攝取膠原性基質(zhì)材料。另外，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞的表面絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶[SIMP，包括seprase，二肽基肽酶IV(dipetidyl peptidase IV)(DPPIV)亞單位]被激活。
2.發(fā)明背景已有報(bào)道在進(jìn)行傳統(tǒng)的骨髓采集與白細(xì)胞分離置換過程中，伴隨有從轉(zhuǎn)移性癌癥患者的組織中分離癌細(xì)胞等問題。(Campana，D.等，急性白血病微小殘留的檢測(cè)方法學(xué)進(jìn)展與臨床意義，Blood，1995 Mar 15，85(6)1416-34；Brugger，W.等，癌細(xì)胞與造血祖代細(xì)胞向?qū)嶓w瘤患者外周血內(nèi)的遷移，Blood，83(3)636-40，1994)。據(jù)估計(jì)，從一例患者采集了總數(shù)為100億的單核細(xì)胞，其中污染有2.5萬-1.2千萬個(gè)癌細(xì)胞。通過遺傳標(biāo)記顯示這些污染的癌細(xì)胞造成了腫瘤的復(fù)發(fā)。(Rill，E R et al.，實(shí)體瘤的自體骨髓移植可能回輸多種腫瘤發(fā)生細(xì)胞的直接證據(jù)，Blood，84(2)380-383，1994)。
在轉(zhuǎn)移性癌患者的血循環(huán)中，也發(fā)現(xiàn)了大量的癌細(xì)胞。Glaves，D.，RP Huben，和L.Weiss(1988.Br.J.Cancer.5732-35)于術(shù)前從10例腎細(xì)胞癌患者的腎靜脈中采取血液，估計(jì)癌細(xì)胞以107-109個(gè)/天的速度釋放出來。這些循環(huán)性癌細(xì)胞如何造成了癌轉(zhuǎn)移還不清楚。主要的阻礙是，很難鑒定到極微量的循環(huán)性癌細(xì)胞亞群(從1000到100萬個(gè)轉(zhuǎn)移細(xì)胞)。顯然，循環(huán)性癌細(xì)胞大部分已被宿主的免疫力所殺死。例如，在實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物腫瘤模型中(此時(shí)應(yīng)用抗體介導(dǎo)的細(xì)胞分離法更為可靠)，在可移植的B16黑色素瘤和Lewis肺癌的生長(zhǎng)過程中(約20天)，據(jù)估計(jì)有1000萬至1億個(gè)癌細(xì)胞釋放入血，這些細(xì)胞在每只小鼠中產(chǎn)生不到100個(gè)肺轉(zhuǎn)移灶。(Glaves，D.，1983，Br.J.Cancer，48665-673)。
另外，在大量的實(shí)驗(yàn)中，將癌細(xì)胞直接引入小鼠或大鼠的血循環(huán)中，很少有超過0.01％的細(xì)胞會(huì)形成腫瘤結(jié)節(jié)。更常見的是，癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移率較此低2個(gè)以上的數(shù)量級(jí)。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提示，從原發(fā)腫瘤釋放出的初始癌細(xì)胞不是發(fā)生轉(zhuǎn)移的限制因素，因脫落的癌細(xì)胞中僅有很少的一部分是活細(xì)胞，具有侵襲性，從而具有轉(zhuǎn)移性。針對(duì)這些轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，必需開發(fā)一種細(xì)胞分離及檢測(cè)系統(tǒng)，以了解腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
已知有數(shù)種方法可以從血液或體液中分離出癌細(xì)胞。這些方法包括，例如，應(yīng)用顯微解剖術(shù)將癌細(xì)胞一個(gè)一個(gè)地分離出來(Suarez-Quian等.，1999，Biotechniques，26328-35；Beltinger and Debatin，1998，Mol.Pathol 51233-6)，或通過抗體介導(dǎo)的方法采用熒光激活細(xì)胞分類(Pituch-Noworolska et al.，1998，Int.J Mol.Med.1573-8)，利用磁場(chǎng)以磁性材料上包被的抗體分離癌細(xì)胞(Denis et al.，1997，Int.J.Cancer 74540-4；Racila et al.，1998，Proc.Natl.Acad Sci USA 95-4589-94)，或利用密度梯度法分離循環(huán)中的癌細(xì)胞(Sabile etal.，1999，Am.J.Clin.Pathol.112171-8)。
然而，這些癌細(xì)胞分離方法取決于得到腫瘤特異性抗體，或取決于不同癌細(xì)胞獨(dú)特的浮力密度及形態(tài)學(xué)。因此極其需要在造血細(xì)胞移植時(shí)，能清除掉癌細(xì)胞的有效方法(Gulati，S C et al.自體干細(xì)胞移植中凈化的理論基礎(chǔ)。Journal ofHematotherapy，2(4)467-71，1993)。
正如在早期研究中證實(shí)的那樣，原發(fā)腫瘤在轉(zhuǎn)移形成的早期即開始向血循環(huán)脫落癌細(xì)胞(Fidler IJ，1973，European Journal of Cancer 9223-227；Liotta LAet al.，1974，Cancer Research 34997-1004)。癌細(xì)胞一旦脫落到血循環(huán)中，即粘附到血管壁的基底膜，并侵入鄰近的結(jié)締組織，形成微小轉(zhuǎn)移灶(Liotta et al.，1991，Cell 64327-336)。據(jù)推測(cè)，在侵入性生長(zhǎng)前沿存在著癌細(xì)胞并脫落到循環(huán)中，這在轉(zhuǎn)移進(jìn)程中起著重要的作用。
腫瘤的轉(zhuǎn)移過程很復(fù)雜，包括癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中脫落出來，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的部位，在此處扎根生長(zhǎng)。為達(dá)到成功地轉(zhuǎn)移，侵襲性癌細(xì)胞必須擁有以下轉(zhuǎn)移特性(i)從原發(fā)癌瘤上脫落下來，(ii)在循環(huán)中存活，并在血管壁上生長(zhǎng)，(iii)有能力侵入(粘附，隨后降解并攝取)膠原性基質(zhì)，以及(iv)滲出，定居，并與新血管生成過程相協(xié)同(Chambers et al.，1998，Cancer和Metastasis Review 17263-269)。
與癌細(xì)胞逃逸到淋巴管或血管的過程相關(guān)的各步驟基本上都是一樣的，都涉及到基本的細(xì)胞特性，即，細(xì)胞的侵襲性。腫瘤的侵襲性要求侵入的癌細(xì)胞粘附、降解和攝取胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，并伴有這些細(xì)胞向ECM的轉(zhuǎn)位或遷移。
這些細(xì)胞活動(dòng)發(fā)生在稱為侵入偽足的膜突起部位，此處存在著動(dòng)態(tài)的膜流動(dòng)，ECM粘附，以及降解。近期有證據(jù)表明，絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶[SIMP，包括二肽基肽酶肽酶IV(DPPIV)/CD26和seprase]參與了細(xì)胞表面的蛋白水解過程(Chen，W-T，1996，Enzyme Protein 4959-71)。
SIMP成員是II型跨膜蛋白，其N末端為含有6個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾部，繼之為20個(gè)氨基酸(seprase)或22個(gè)氨基酸(DPPIV)的跨膜區(qū)，其C末端有200個(gè)氨基酸，含有催化活性的絲氨酸以非經(jīng)典取向構(gòu)成催化區(qū)(Goldstein，LA et al.，1997，Biochem.Biophys.Acta.13611119)。DPPIV可特異性地將倒數(shù)第二位含有L-脯氨酸、L-羥脯氨酸或L-丙氧酸寡肽的N-端二肽去除。這些肽包括神經(jīng)肽Y和其它肽激素(Heins，J et al.，1988，Biochini.Biophys.Acta 954161-169；Walter，R et al.，1980，Mol.Cell Biochem.30111-126)。此外，近期的一項(xiàng)報(bào)告顯示，DPPIV也具有seprase樣的明膠酶和肽鏈內(nèi)切酶活性，提示它也參與了膠原的降解(Bermpohl F et al.，1998，F(xiàn)EBS Letters 428152-156)。另外，DPPIV在小腸和腎臟上皮細(xì)胞的刷狀緣膜上組成性表達(dá)，(Yaron and Naider，F(xiàn)，1993，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.2831-81；Morimoto C.and Schlossman SF，1994，Immunologist 24-7)，在T-細(xì)胞中也有一過性表達(dá)，提示DPPVI可能是T-細(xì)胞活化的一種標(biāo)志(Morimoto C.and Schlossman SF，1994，Immunologist24-7)。
Seprase，最初被認(rèn)定為是一種170-kDa的膜結(jié)合明膠酶，在高侵襲性黑色素瘤LOX的侵入偽足上有表達(dá)(Aoyama A.and Chen，W.T.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.878296-8300；Mueller，SC et al.，1999，J.Biol Chem.27424947-24952；Monsky，WL et al.，1994，Cancer Res.545702-5710)。已從LOX細(xì)胞的細(xì)胞膜和脫落的囊泡分離到此活性酶。Seprase是97-kDa亞基的均二聚體(Pineiro-Sanchez，ML et al.，1997，J Biol.Chem.2727595-7601)。分析了編碼97-kDa亞基的cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)這種97-kDa亞基與DPPIV同源，并與成纖維細(xì)胞活化蛋白α(FAPα)基本相同(Goldstein et al.，1997Biochem.Biophys.Acta.1361，11-19；Scanlon，M.J et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，915657-5661)。FAPα在上皮癌和正愈合創(chuàng)口處的反應(yīng)性基質(zhì)成纖維細(xì)胞上有表達(dá)，但在成人的組織中沒有表達(dá)(Garin-Chesa，P.et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.877235-7239)。
然而在癌瘤中，F(xiàn)APα未見表達(dá)于癌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞上(Garin-Chesa et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.877235-7239)。Seprase與FAPα的區(qū)別主要是在于與高度保守基序GXSXG(其含有活性絲氨酸部位)相鄰的一段45個(gè)氨基酸殘基上(Scanlan et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915657-5661；Goldstein etal.，1997 Biochem.Biophys.Acta.1361，11-19)。近期，從人黑色素瘤細(xì)胞系LOX中鑒定到另一種剪接的seprase mRNA，它編碼一種新的截短的27-kDa seprase同功酶，正好與97-kDa的seprase羧基末端催化區(qū)重疊(Goldstein and Chen，2000 J.Biol.Chem.2752554-2559)。這種剪接變體mRNA是由于編碼seprase97-kDa亞基的胞質(zhì)尾、跨膜區(qū)以及胞外區(qū)的膜近側(cè)中心區(qū)[纈氨酸(5)一直到絲氨酸(412)]部分的1223個(gè)堿基對(duì)的外顯子區(qū)的框外缺失而產(chǎn)生。很可能seprase兼具明膠酶和甘-脯二肽酶的活性，而截短的seprase僅具有后者二肽酶活性。
長(zhǎng)期以來人們都認(rèn)為膠原的重塑是由基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)介導(dǎo)的。然而在癌患者中進(jìn)行的MMP抑制劑(馬馬司他(Marimastat)，AG3340)和血管生成抑制劑(血管生成抑制素(angiostatin)與內(nèi)皮抑制素(endostatin))試驗(yàn)，未能獲得抗轉(zhuǎn)移、抗侵襲作用的明確證據(jù)。這些資料表明，在腫瘤的侵入前沿，需要有其它酶系統(tǒng)來代替MMP。
癌細(xì)胞的體外侵襲性可能是腫瘤轉(zhuǎn)移性的一個(gè)直接指針。了解細(xì)胞的侵襲性表型，對(duì)于開發(fā)癌治療方案，提高患者的生存率以及生活質(zhì)量等非常重要，作為診斷工具檢測(cè)癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移也非常重要。因此，作為癌瘤轉(zhuǎn)移性的一個(gè)特征，大量精力已投入到測(cè)定癌細(xì)胞的侵襲性上。
細(xì)胞的侵襲性通常用其細(xì)胞表面的蛋白水解活性表示，這種蛋白水解活性可使胞外基質(zhì)(ECM)成分降解，并使ECM片段內(nèi)化。體外檢測(cè)此類活性的試驗(yàn)常常因其它細(xì)胞表面現(xiàn)象，如粘附、細(xì)胞表面蛋白水解和膜的流動(dòng)性而變得復(fù)雜。一種設(shè)計(jì)用來檢測(cè)細(xì)胞侵襲性的專用試驗(yàn)涉及將熒光標(biāo)記的或放射性標(biāo)記的纖連蛋白(或其它ECM成分)共價(jià)連接到交聯(lián)的明膠基底層的表面(Chen et al.，1984，J.Cell Biol 981546-1555；Chen，et al.，1985，Nature，316156-158；Chen et al.，1989，J.Exp.Zool.251167-185；Chen et al.，1994，J Tiss.Cult.Meth.16177-181；Meuller et al.，1989，J.Cell.Biol.1093455-3464)。在這種專用技術(shù)中，纖連蛋白被標(biāo)記并用來包被過度固定的蛋白質(zhì)膜。然后用此膜來測(cè)定細(xì)胞表面的蛋白水解活性以及檢測(cè)蛋白膜上侵入偽足伸展部位和表面凹痕外的細(xì)胞侵襲性表型。
然而，這種纖連蛋白-明膠膜試驗(yàn)價(jià)值有限，原因在于(i)它采用的是常規(guī)的過度固定的蛋白膜；(ii)對(duì)于檢測(cè)中等程度侵襲性細(xì)胞，如大多數(shù)培養(yǎng)的癌細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞以及血管生成性內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白水解活性，這種方法缺乏敏感性，(iii)癌細(xì)胞不攝取交聯(lián)的明膠片段，(iv)以纖連蛋白和交聯(lián)明膠材料很難建構(gòu)三維培養(yǎng)凝膠系統(tǒng)。因此，檢測(cè)此類細(xì)胞侵襲性的可靠方法將對(duì)癌癥的臨床診斷及治療產(chǎn)生顯著影響。
本發(fā)明為從轉(zhuǎn)移瘤患者的血液、腹水和原發(fā)腫瘤組織中分離各種類型的癌細(xì)胞和從正常獻(xiàn)血者的血液中分離包括內(nèi)皮細(xì)胞的外周血單核細(xì)胞提供了一種獨(dú)特的以功能為基礎(chǔ)的細(xì)胞分離方法。另外，本發(fā)明提供了證據(jù)，證明在侵襲性癌細(xì)胞和活化的成纖維細(xì)胞(或其它組織細(xì)胞)以及惡性組織的新生內(nèi)皮細(xì)胞中，選擇性地誘導(dǎo)了seprase和/或DPPIV表達(dá)，從而為抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物開發(fā)提供了靶標(biāo)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明是關(guān)于一種可迅捷有效地從癌癥患者的血液、腹水和/或組織中檢測(cè)并選出侵襲性癌細(xì)胞的新型癌細(xì)胞捕獲系統(tǒng)，在晚期癌癥患者中，已發(fā)現(xiàn)某些癌細(xì)胞能與血液成分結(jié)合形成大的細(xì)胞聚集團(tuán)。
這種細(xì)胞聚集團(tuán)可能造成晚期癌癥相關(guān)的器官功能不全。本發(fā)明提供的組合物和方法可以檢測(cè)具有轉(zhuǎn)移灶的癌癥患者血中的此類細(xì)胞，并可用來清除患者血液、腹水和/或組織中的上述細(xì)胞聚集團(tuán)以及游離的單個(gè)活性癌細(xì)胞。
與早期抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞分離和檢測(cè)方法相比，本發(fā)明的細(xì)胞分離系統(tǒng)根據(jù)的是癌細(xì)胞的功能性質(zhì)，即其粘附、降解以及攝取細(xì)胞外基質(zhì)的能力。因此，本發(fā)明的細(xì)胞分離及試驗(yàn)系統(tǒng)設(shè)計(jì)用來鑒定和分離癌癥患者血液、腹水和腫瘤組織中非常少量的具有侵襲性和轉(zhuǎn)移性的活性癌細(xì)胞。
例如，可以利用該富集的癌細(xì)胞群來測(cè)定其轉(zhuǎn)移性和確定最有效的治療方案。還可利用該富集的細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞融合來開發(fā)癌疫苗。
本發(fā)明涉及到轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液過濾器，作為細(xì)胞粘附基質(zhì)的天然纖維組合物，其包括血源性粘附分子包被的膠原、纖維蛋白、棉纖維及塑料纖維。例如，取自胎盤組織或大鼠尾的I型膠原，對(duì)于制備這種基質(zhì)特別有用，通過多輪聚合和解聚處理可以很容易地裝配成任何形式和包被在血管的表面。該膠原基質(zhì)可用各種各樣的源自血液的粘附分子包被，包括但不限于纖連蛋白、層粘連蛋白和玻連蛋白等。單個(gè)癌細(xì)胞或細(xì)胞集落可粘附于這種細(xì)胞粘附基質(zhì)為細(xì)胞分離提供了基礎(chǔ)。
例如，此類組合物可用于清除癌細(xì)胞和富集血液或骨髓中的造血祖代細(xì)胞用作骨髓移植的供體細(xì)胞。此外，應(yīng)用本發(fā)明的細(xì)胞分離法可以從全血中濃集不同癌種的特殊癌細(xì)胞，經(jīng)活體外增殖用來與樹突狀細(xì)胞相互作用，開發(fā)有效的抗腫瘤疫苗。除此之外，還可分離患者循環(huán)血中的癌細(xì)胞，接受體外化療方案的攻擊。這樣，就可以給予同一患者有效劑量的藥物或藥物組合。
本發(fā)明的組合物和方法為癌癥患者血液、腹水及組織中侵襲性癌細(xì)胞的檢測(cè)和分離提供了一種快捷的方法。此類癌癥包括但不限于前列腺，乳腺，結(jié)腸，肺，頭頸部，腦，膀胱，淋巴瘤，卵巢，腎臟和睪丸，黑色素瘤，肝，胰或其它胃腸道癌等?？刹捎妹庖呒?xì)胞化學(xué)法和本發(fā)明的細(xì)胞功能試驗(yàn)，即膠原降解與攝取試驗(yàn)，檢測(cè)癌細(xì)胞并對(duì)其定性。
本發(fā)明的方法可以用于開發(fā)檢測(cè)癌癥患者血液、腹水或腫瘤組織中的侵襲性癌細(xì)胞的敏感方法，用于預(yù)后、監(jiān)測(cè)治療和外科手術(shù)的療效以及癌的早期檢測(cè)。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試驗(yàn)，諸如檢測(cè)癌細(xì)胞的組織來源，測(cè)定細(xì)胞的血管生成能力，以及檢測(cè)減少的白細(xì)胞或補(bǔ)體結(jié)合等等，可進(jìn)一步提高癌轉(zhuǎn)移性檢測(cè)的敏感性及準(zhǔn)確性。
本發(fā)明的細(xì)胞粘附基質(zhì)還提供了一種捕獲癌細(xì)胞的方法，可以獲得高產(chǎn)量并將活性癌細(xì)胞從全血、白細(xì)胞層、外周血干細(xì)胞制品或骨髓中有效地清除掉。本發(fā)明的細(xì)胞分離方法目的是用于治療性血液成分部采集和白細(xì)胞分離置換進(jìn)行自體輸血清除掉其中的污染性癌細(xì)胞。本發(fā)明為從以下癌癥患者的全血中清除癌細(xì)胞提供了一種高效方法前列腺，乳腺，結(jié)腸，肺，頭頸部，腦，膀胱，淋巴瘤，卵巢，腎臟和睪丸，黑色素瘤，肝，或胰及其它胃腸道癌。
本發(fā)明還提供了試驗(yàn)方法，可用于篩選能夠抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而控制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的藥物。
此類試驗(yàn)涉及，在待測(cè)藥物存在下使細(xì)胞粘附基質(zhì)與癌細(xì)胞樣品接觸，然后檢測(cè)和定量癌細(xì)胞的粘度和降解或攝取基質(zhì)的情況。本發(fā)明的試驗(yàn)系統(tǒng)也可以用于監(jiān)測(cè)治療過程中可能具有抗腫瘤作用的藥物的療效。例如，可在治療前或治療期間，測(cè)定全血中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。可通過比較整個(gè)治療過程中癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性變化而確定該藥物的效果。顯示有效的藥物是那些能夠降低癌侵襲性，提高宿主免疫力并抑制癌增殖但不影響或很小影響正常組織細(xì)胞的藥物。例如，這種抗轉(zhuǎn)移性藥物篩選試驗(yàn)系統(tǒng)已鑒定出針對(duì)seprase-DPPIV復(fù)合物的單克隆抗體和肽抑制劑，它們能阻抑轉(zhuǎn)移性細(xì)胞粘附、降解及侵入膠原性基質(zhì)的能力(圖13和14)。此外，此類試驗(yàn)系統(tǒng)顯示，針對(duì)seprase和DPPIV的反義核酸和核糖酶構(gòu)建物能夠降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲性(圖19)。
本發(fā)明提供了用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的方法及組合物，包括給予絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明這一方面內(nèi)容的根據(jù)是以下觀察一種包括seprase和DPPIV的新的蛋白酶復(fù)合物的形成是細(xì)胞侵入膠原基質(zhì)的前提。這類蛋白酶抑制劑包括但不限于那些能夠抑制DPPIV和seprase活性的化合物。seprase和DPPIV活性被激活是細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的前提，這一發(fā)現(xiàn)為鑒定癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制劑的藥物篩選試驗(yàn)提供了靶分子。
4.


圖1A-B.細(xì)胞粘附基質(zhì)的成分與制備。
圖1A.制備I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)，此圖顯示基質(zhì)制備、細(xì)胞分離和癌細(xì)胞侵襲性顯微鏡檢的7個(gè)步驟。圖1B.應(yīng)用以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)，對(duì)細(xì)胞總膠原降解進(jìn)行微量滴定測(cè)定。癌細(xì)胞所降解和攝取的Bodipy-rhodamine膠原基質(zhì)用熒光微量滴定板讀數(shù)儀以紅色熒光的增加量進(jìn)行測(cè)定。下圖顯示，在細(xì)菌膠原酶存在下，37℃孵育30分鐘，釋放出的熒光單位(RFU)與覆蓋在各微量滴定孔上的Bodipy-rhodamine膠原的量成正比。
圖2A-B.以細(xì)胞粘附基質(zhì)為基礎(chǔ)的細(xì)胞分離及試驗(yàn)系統(tǒng)在診斷和治療中的應(yīng)用。圖2A.可用于診斷的細(xì)胞分離和試驗(yàn)方法，包括診斷、監(jiān)測(cè)治療或手術(shù)反應(yīng)，以及早期腫瘤檢測(cè)。圖中顯示分離、檢測(cè)、定性血液、腹水或組織細(xì)胞群中癌細(xì)胞的步驟。圖2B.本發(fā)明可用于治療及預(yù)防的細(xì)胞分離和試驗(yàn)方法。圖中顯示分離及培養(yǎng)血液、腹水或組織細(xì)胞群中癌細(xì)胞的步驟。
圖3A-F.患者及對(duì)照血液樣品的癌細(xì)胞分離分析。圖中顯示接種于完全培養(yǎng)液中，或正常獻(xiàn)血者對(duì)照或膀胱癌(BLC)患者血液中的熒光標(biāo)記Hs578T乳腺癌細(xì)胞的代表性范例。將紅色熒光標(biāo)記的Hs578T乳腺癌細(xì)胞加入3ml培養(yǎng)液或血液樣品中，細(xì)胞被微量滴定小孔內(nèi)的膠原性基質(zhì)所捕獲，培養(yǎng)18小時(shí)。顯示的圖片是在良好的熒光照明和相差條件下攝制的，僅代表了微量滴定孔的一部分。圖3A.對(duì)加入培養(yǎng)液中的Hs578T乳腺癌細(xì)胞(500個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行熒光分析。估計(jì)有495個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)為粘附或散布于基質(zhì)上的亮點(diǎn)。圖3B.對(duì)接種于正常獻(xiàn)血者血液中的Hs578乳腺癌細(xì)胞(500個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行熒光分析。在存留的基質(zhì)底層上估計(jì)有415個(gè)呈紅色熒光的癌細(xì)胞混在培養(yǎng)的其它血細(xì)胞(無熒光信號(hào))中。圖3C.對(duì)接種于正常獻(xiàn)血者血液中的Hs578T乳腺癌細(xì)胞(19個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行熒光分析。在存留的基質(zhì)底層上估計(jì)有11個(gè)呈紅色熒光的癌細(xì)胞混在培養(yǎng)的其它血細(xì)胞(無熒光信號(hào))中。圖3D.對(duì)接種于BLC患者血液中的Hs578T乳腺癌細(xì)胞(200個(gè)細(xì)胞)進(jìn)行熒光成像。估計(jì)癌癥患者血液中有182個(gè)Hs578T乳腺癌細(xì)胞與循環(huán)性BLC細(xì)胞一起被捕獲。Hs578T細(xì)胞傾向與患者單核血細(xì)胞(圖中為黑點(diǎn))聚集成團(tuán)。圖3E.被基質(zhì)捕獲的接種于BLC患者血液中的Hs578T乳腺癌細(xì)胞(19個(gè)細(xì)胞)的熒光分析。估計(jì)有16個(gè)呈紅色熒光的癌細(xì)胞混在其它血細(xì)胞中，視野中可看到一個(gè)Hs578T乳腺癌細(xì)胞。圖3F圖3E所示為基質(zhì)捕獲的Hs578T乳腺癌細(xì)胞以及循環(huán)性BLC細(xì)胞的免疫熒光分析。
此地Hs578T乳腺癌細(xì)胞與源自血液的4個(gè)膀胱癌細(xì)胞被偶聯(lián)了熒光素的抗細(xì)胞角蛋白PCK抗體著染。在患者血液中的膀胱癌細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白標(biāo)記的綠色熒光中，可見到Hs578T乳腺癌細(xì)胞(在圖4E中顯示為紅色熒光)。圖片大小A-D，662μm×478μm；圖片大小E-F，331μm×239μm.
圖4A-I.循環(huán)性細(xì)胞粘附于細(xì)胞粘附基質(zhì)。圖4A-C.頭頸部(HN)鱗狀細(xì)胞癌患者血液中的循環(huán)性細(xì)胞聚集于一片組織片段上。這種細(xì)胞-組織集落被捕獲于采用膠原性基質(zhì)的底層上，培養(yǎng)4天(圖A中的d4)，5天(圖B中的d6)，以及13天(圖C中的d13)。圖4D.轉(zhuǎn)移性前列腺癌(PC)患者血液中的細(xì)胞聚集在一片組織片段上，培養(yǎng)3天(d3)。圖4E.轉(zhuǎn)移性前列腺癌(PC)患者的循環(huán)性癌細(xì)胞聚集在一根纖維蛋白纖維上(纖維蛋白)，培養(yǎng)3天(d3)。圖4F.轉(zhuǎn)移性前列腺癌(PC)患者的循環(huán)性細(xì)胞聚集在塑料片上(塑料)，培養(yǎng)3天(d3)。視野中可見體積較大的癌細(xì)胞更易于粘附在塑料片上。圖4G.與圖4F同樣培養(yǎng)的循環(huán)性細(xì)胞，但培養(yǎng)12天(d12)。視野中可見體積較大的癌細(xì)胞更易于粘附在塑料片上。圖4H.轉(zhuǎn)移性前列腺癌(PC)患者的循環(huán)性細(xì)胞聚集在純棉上(棉質(zhì))，培養(yǎng)3天(d3)。圖4I.聚集于純棉(棉質(zhì))上的腦癌(BN)患者的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)20天(d20)。圖片大小A-G，662μm×478μm；圖片大小H-I，1324μm×956μm。
圖5A-H.粘附于以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)上的循環(huán)性細(xì)胞。圖5A-C轉(zhuǎn)移性胰腺癌(PnC)患者的細(xì)胞聚集團(tuán)被采用I型膠原基質(zhì)的底層所捕獲，洗滌后，在基質(zhì)上培養(yǎng)5天(A)，9天(B)，以及16天(C)。
這些圖顯示以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)與侵入該基質(zhì)并在塑料表面生長(zhǎng)的癌細(xì)胞的相差顯微鏡表現(xiàn)。大多數(shù)正常供獻(xiàn)血者血中并不存在的癌細(xì)胞有著獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征，在培養(yǎng)過程中其細(xì)胞體積和數(shù)量增大增多，而同時(shí)分離得到的白細(xì)胞體積較小，在培養(yǎng)過程中數(shù)量減少。圖5d轉(zhuǎn)移性胰腺癌(PnC)患者的循環(huán)性細(xì)胞聚集團(tuán)被捕獲在采用I型膠原基質(zhì)的底層上，從基質(zhì)上洗脫的細(xì)胞在塑料表面(塑料)以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)7天。在細(xì)胞群落的周邊有梭形細(xì)胞與上皮細(xì)胞樣癌細(xì)胞相伴。圖5E-F.基質(zhì)成纖維細(xì)胞侵入I型膠原底層中。從頭頸部(HN)鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤活檢樣品中分離的細(xì)胞。在基質(zhì)表面可分離到兩種形態(tài)學(xué)截然不同的細(xì)胞類型HN鱗狀細(xì)胞在基質(zhì)表面保持靜止不動(dòng)(E)，而基質(zhì)成纖維細(xì)胞則侵入膠原凝膠中(F)在Nikon Eclipse TE300倒置顯微鏡下經(jīng)精細(xì)調(diào)節(jié)后，在圖5E所觀察的平面以下約80μm處。圖5G以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)的形態(tài)學(xué)，圖示基質(zhì)和從結(jié)腸癌(CC)患者血液中分離得到的粘附性癌細(xì)胞的透射電子顯微鏡表現(xiàn)。圖5H.圖5H中所示的膠原纖維的高倍鏡觀察，圖示裝配好的膠原纖維的透射電鏡表現(xiàn)。圖片大小A-F，662μm×478μm；圖片大小G-H，如圖中比例尺條帶所示。
圖6A-D.循環(huán)癌性細(xì)胞侵襲性表型的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。圖6A-B.轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌(CC)患者的循環(huán)性細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞剛剛分離出來，培養(yǎng)1天(d1)和9天(d9)。圖中所示為以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)被癌細(xì)胞降低產(chǎn)生的小孔的相差顯微鏡表現(xiàn)，以及癌細(xì)胞的特征，其獨(dú)特的形態(tài)學(xué)特征，即在培養(yǎng)了1天時(shí)體積小(A)，但培養(yǎng)9天后體積增大，呈上皮細(xì)胞樣(B)。在培養(yǎng)過程中，癌細(xì)胞的細(xì)胞體積增大，數(shù)量增多，而同時(shí)分離所得的白細(xì)胞體積小，數(shù)量減少。另外，在細(xì)胞群落中，梭形細(xì)胞與上皮細(xì)胞樣的癌細(xì)胞相伴(B)。圖6C-D.轉(zhuǎn)移性胃癌(SC)患者的循環(huán)性細(xì)胞團(tuán)。細(xì)胞被捕獲在應(yīng)用I型膠原基質(zhì)的底層上，培養(yǎng)19天。上皮細(xì)胞樣癌細(xì)胞在膠原膜被降解的小孔內(nèi)的塑料表面生長(zhǎng)(C)，或沿著膠原膜的邊緣呈線性生成(D)。圖片大小A-B，1324μm×956μm；圖片大小C-D，662μm×478μm.
圖7A-D.以細(xì)胞分離方法自對(duì)照的血液樣品得到的細(xì)胞。圖7A.自39歲正常獻(xiàn)血者的血液中分離得到的細(xì)及其下面的I型膠原基質(zhì)。培養(yǎng)7天后，僅有極少量細(xì)胞存活，而基質(zhì)膜保持完整。圖7B.自良性結(jié)腸腫瘤(CTN)患者血液中分離得到的細(xì)胞及其下面的I型膠原基質(zhì)。僅有極少量細(xì)胞被分離出來，基質(zhì)膜保持完整。圖7C-D.轉(zhuǎn)移性乳腺癌(BC)患者的循環(huán)性細(xì)胞及其下面的I型膠原基質(zhì)。在化療期間收集血液樣品。經(jīng)1天和4天培養(yǎng)，僅有相當(dāng)少量的細(xì)胞被分離出來并存活，且基質(zhì)膜保持完整。圖片大小A-D，662μm×478μm。
圖8A-L.采用熒光標(biāo)記的膠原的細(xì)胞侵襲性表型分離和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，以及用抗上皮細(xì)胞標(biāo)記抗體測(cè)得的循環(huán)性癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)特征。細(xì)胞來自乳腺癌(BC，A-C)，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HN，D-F)，結(jié)腸癌(CC，G-I)，前列腺癌(PC，K)等患者和正常獻(xiàn)血者(對(duì)照，L)的血液，以及Hs578T乳腺癌細(xì)胞系(Hs578T，J)。細(xì)胞被捕獲在含羅丹明-膠原基質(zhì)的基底層上，培養(yǎng)1天(d1)或63天(d63)。圖8A-C.以攝入的羅丹明-膠原斑點(diǎn)為乳腺癌(BC)患者的循環(huán)性癌細(xì)胞侵襲性表型的標(biāo)志。將細(xì)胞接種在基質(zhì)上，培養(yǎng)18小時(shí)，固定，進(jìn)行觀察。在大量的白細(xì)胞的背景下，可見單個(gè)的或成簇的推定癌細(xì)胞(PH，相差圖像見A所示)攝入了羅丹明-膠原碎片，標(biāo)以Col+(紅色熒光見B所示)。拼接后的C表明羅丹明-膠原斑點(diǎn)與推定癌細(xì)胞正好匹配。這提示，每ml患者血液中含有2,067個(gè)Col+細(xì)胞。圖8D-F.以攝入羅丹明-膠原斑點(diǎn)作為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HN)患者的循環(huán)性癌細(xì)胞侵襲性的標(biāo)志。如圖所示，大簇或單個(gè)推定癌細(xì)胞(PH，相差圖像見D所示)，與廣譜的細(xì)胞角蛋白亞基(PCK+，見E中所示)抗體染色陽性細(xì)胞相吻合，這些細(xì)胞中帶有羅丹明-膠原Col+(紅色熒光，如F所示)。這提示，每ml患者血液中分別有20,814個(gè)PCK+細(xì)胞和18,003個(gè)Col+細(xì)胞。PCK+細(xì)胞的數(shù)量多于Col+細(xì)胞，可能是抗體染色陽性和粘附于細(xì)胞粘附基質(zhì)的活性癌細(xì)胞較少。
圖8G-I.以攝入羅丹明-膠原斑點(diǎn)為結(jié)腸癌(CC)患者的循環(huán)性癌細(xì)胞侵襲性表型的標(biāo)志。成簇和單個(gè)推定癌細(xì)胞(相差干擾成像，如G所示)，以抗上皮細(xì)胞表面抗原抗體進(jìn)行標(biāo)記(ESA+，在G中為紅染)。如圖所示，ESA+細(xì)胞與用抗內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記因子VIII的抗體染色的細(xì)胞(F8+，在H中為綠色熒光細(xì)胞)相吻合，這些細(xì)胞攝入了羅丹明-膠原碎片Col+(在I中為紅色熒光細(xì)胞)。這提示，每ml患者血中分別有2,284個(gè)ESA+，7,308個(gè)F8+和1,978個(gè)Col+細(xì)胞。F8+細(xì)胞遠(yuǎn)多于Col+或ESA+細(xì)胞，可能是因?yàn)檠写嬖谟姓５膬?nèi)皮細(xì)胞。圖8J.Hs578T乳腺癌細(xì)胞系以抗-PCK抗體染色，作為腫瘤(上皮細(xì)胞)標(biāo)記對(duì)照。圖8K.培養(yǎng)了63天的PC細(xì)胞(d63)，ESA染色陽性。注意這些大細(xì)胞含有多個(gè)核，與G圖中的d1細(xì)胞相比，它們的直徑增加了5倍以上。圖8L.培養(yǎng)正常獻(xiàn)血者的循環(huán)血細(xì)胞1天后羅丹明-膠原基質(zhì)保持完整。圖片大小A-C，1324μm×956μm，圖片大小DF，331μm×239μm；圖片大小G-L，662μm×478μm。
圖9A-L.循環(huán)性癌細(xì)胞的血管生成傾向。細(xì)胞來自以下患者的血液頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HN，A-C；I-J)，結(jié)腸癌(CC，D-F)和前列腺癌(PC，G-H)。細(xì)胞被捕獲在用膠原基質(zhì)的底層，培養(yǎng)1-11天，以d1或d11表示。圖9A-C.一大簇和7個(gè)單個(gè)HN細(xì)胞(相差圖像，所A所示)F8+強(qiáng)陽性(B)和攝入的膠原碎片Col+(C)。在相差(PH)圖像(A)顯示HN細(xì)胞與同一視野內(nèi)F8抗體反應(yīng)陽性細(xì)胞(B)以及那些攝入了羅丹明-膠原基質(zhì)的細(xì)胞(C)緊密相伴。這提示，在每ml患者血中分別有42,495個(gè)F8+和15,611個(gè)Col+細(xì)胞。F8+細(xì)胞遠(yuǎn)多于Col+細(xì)胞，這是因?yàn)檠杏蠪8+內(nèi)皮細(xì)胞。圖9D-F.CD31+和F8+的細(xì)胞亞組代表了Col+CC細(xì)胞。將羅丹明-膠原基質(zhì)上的細(xì)胞以抗內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31的抗體和偶聯(lián)了熒光素的抗內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記因子VII(F8)的抗體進(jìn)行標(biāo)記。如相差干涉(DIC)圖像(D)中所示，鮮紅色的CD31+細(xì)胞與CC細(xì)胞相伴。同一視野內(nèi)的CC細(xì)胞對(duì)F8抗體呈陽性反應(yīng)(E)，并攝入羅丹明-膠原基質(zhì)(F)。這提示，在每ml患者血中分別有11,693個(gè)CD31+細(xì)胞，6,577個(gè)F8+和2,558個(gè)Col+細(xì)胞。CD31+與F8+細(xì)胞遠(yuǎn)多于Col+細(xì)胞，這是因?yàn)樵谘写嬖谥鳦D31+和F8+陽性內(nèi)皮細(xì)胞。圖9G-H.摻入了乙酰化低密度脂蛋白(LDL)的PC細(xì)胞。如相差干涉(DIC)圖像(G)所示，染成鮮紅色的上皮細(xì)胞表面抗原(ESA)陽性細(xì)胞攝入了熒光素-LDL(H)。
這提示，在每ml患者血中分別有9,744個(gè)ESA+和34,105個(gè)LDL+細(xì)胞。LDL+細(xì)胞遠(yuǎn)多于ESA+細(xì)胞，這是因?yàn)榇嬖谟心軗饺胍阴；疞DL的其它內(nèi)皮細(xì)胞。圖9I-J.摻入了乙?；疞DL的原代HN細(xì)胞。注意，如素-羅丹明-Hoechst三染圖像所示(J)，僅有一種特殊的朝向中心的細(xì)胞，摻入了熒光素-LDL和羅丹明-膠原，提示這種細(xì)胞代表了在培養(yǎng)12天后仍保留侵襲性的細(xì)胞。
圖9K-L.循環(huán)性CC細(xì)胞在膠原凝膠上生成毛細(xì)血管網(wǎng)。在將循環(huán)性CC細(xì)胞接種到厚度0.5mm的I型膠原凝膠板上，2天后，可觀察到血管網(wǎng)形成(K)和條索狀結(jié)構(gòu)形成(L)。圖片大小A-C；GJ，331μm×239μm；圖片大小D-F；K-L，662μm×478μm。
圖10A-L.培養(yǎng)基中循環(huán)性癌細(xì)胞的免疫癌殺傷和生長(zhǎng)。以膠原基質(zhì)分離結(jié)腸癌(CC，A-E)，前列腺癌(PC，F(xiàn)-I)或膀胱癌(BLC，J-L)患者血液中的細(xì)胞，并培養(yǎng)在含10-20％人血漿的培養(yǎng)基中。圖10A-C.CD34+外周血干細(xì)胞與F8+/Col+CC細(xì)胞聚集成團(tuán)。在相差干涉(DIC)圖像(A)中，鮮紅染色的CD34+細(xì)胞與CC細(xì)胞相伴。同一視野中的CC細(xì)胞對(duì)F8抗體(B)呈陽性反應(yīng)，并攝入了羅丹明-膠原(C)。這表示，在每ml患者血中分別有111,082個(gè)CD34+，7,673個(gè)F8+和2,558個(gè)Col+細(xì)胞。CD34+及F8+細(xì)胞多于Col+細(xì)胞，這是因?yàn)樵谘褐写嬖谥鳦D34+的干細(xì)胞和F8+的內(nèi)皮細(xì)胞。圖10D-E.CD45+的白細(xì)胞與Col+CC細(xì)胞聚集成團(tuán)。在羅丹明-膠原基質(zhì)上分離的細(xì)胞，經(jīng)抗白細(xì)胞共同抗原CD45抗體標(biāo)記。在DIC圖像(D)中，顯示了鮮紅染色的CD45+白細(xì)胞與CC細(xì)胞相伴。在同一視野內(nèi)的CC細(xì)胞顯示攝入了羅丹明-膠原基質(zhì)(E)。這表示，在每ml患者血中分別有125,670個(gè)CD45+的白細(xì)胞和1,827個(gè)Col+細(xì)胞。圖10F-I.預(yù)后良好的前列腺癌(PC)患者的免疫細(xì)胞與癌細(xì)胞簇細(xì)胞溶解的系列圖片。大部分癌細(xì)胞受到白細(xì)胞攻擊，培養(yǎng)1天后變成碎片(F-H)。然而，在相同培養(yǎng)基中，7天后白細(xì)胞消失了，留下少量的PC群落(I)。
圖10J-L.同一患者自身免疫性血漿使其膀胱癌(BLC)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞溶解。將BLC細(xì)胞培養(yǎng)在含有同一位癌癥患者的10％自體血漿的培養(yǎng)基中(J-K中的au.血漿表示自體血漿)，或在含有10％正常供體血漿的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(L中的n.血漿表示正常人血漿)。在含有自體血漿的培養(yǎng)基中，BLC細(xì)胞在第2天溶解，顏色變成棕色(J-K中的au血漿表示自體血漿)，但在含有正常人血漿的培養(yǎng)基中，BLC細(xì)胞一直存活達(dá)6周以上(L中的n血漿表示正常人血漿)，提示自身癌抗體在補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解中發(fā)揮著作用，提示了宿主免疫力在對(duì)抗轉(zhuǎn)移方面的重要性。圖片大小A-L，662μm×478μm。
圖11A-B.檢測(cè)Sepharase和DPPIV的凝膠柱過濾色譜與免疫印跡。圖11A.以Sepharase 12(Pharmacal-LKB，Piscataway，N.J.)的凝膠過濾柱從W1 38細(xì)胞中分離得到的WGA-純化的清潔劑可溶解的蛋白質(zhì)。用以校準(zhǔn)過濾柱的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是維生素B-12(1.35-kDa)，肌紅蛋白(17-kDa)，卵白蛋白(44-kDa)，γ-球蛋白(158-kDa)，過氧化氫酶(232-kDa)，鐵蛋白(440-kDa)，以及甲狀腺球蛋白(670-kDa)。圖11B.利用抗seprase和DPPIV單抗，應(yīng)用免疫斑點(diǎn)印跡法對(duì)各片段進(jìn)行分析。在200-kDa(片段17)，440-kDa(片段14)，以及670-kDa(片段13)區(qū)，發(fā)現(xiàn)有Seprase和DPPIV，提示seprase-DPPIV復(fù)合物大小為440-670kDa。
圖12A-D.W138人胚胎肺成纖維細(xì)胞的Seprase-DPPIV復(fù)合物的特性。圖12A.表面生物素化的W138成纖維細(xì)胞的免疫沉淀反應(yīng)(Ip)?？箂eprase(D28)和抗DPPIV(EI9)的單克隆抗體均鑒定出一種RIPA-可溶性蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括170-以及200-kDa 2個(gè)主要條帶，分別對(duì)應(yīng)著seprase和DPPIV。圖12B.Ip和免疫印跡法(Ib)顯示的seprase-DPPIV復(fù)合物。WI38 RIPA裂解物中分離得到的Seprase-或DPPIV-免疫沉淀在seprase-或DPPIV-免疫印跡中得以證實(shí)，但在β1和β3整聯(lián)蛋白印跡中未得到證實(shí)，提示這種蛋白酶復(fù)合物與RIPA中的β1和β3整聯(lián)蛋白沒有相關(guān)性。圖12C.seprase-DPPIV液化明膠的活性。在沒有Ca而有2mM EDTA存在下，以凝膠酶譜法分析這種蛋白酶復(fù)合物。Seprase和DPPIV的免疫分離物(Ip)均顯示170-kDa凝膠酶(seprase)活性。圖12D.Seprase-DPPIV復(fù)合物的DPPIV脯氨酸特異性蛋白酶活性。用熒光Ala-Pro-AFC(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)底物覆蓋試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)seprase和DPPIV的免疫分離物(Ip)均顯示相同的肽酶活性。對(duì)于av，a2，a6或β3整聯(lián)蛋白或?qū)φ彰庖叻蛛x物，均未觀察到有活性。
圖13A-E.創(chuàng)傷活化的W138成纖維細(xì)胞在膠原凝膠中的遷移和膠原間接作用。圖13A.單細(xì)胞層損傷后1小時(shí)(a，b，c)和18小時(shí)(d，e，f)W138的形態(tài)(細(xì)胞存活時(shí)拍照)。圖片a和dW138在創(chuàng)傷邊緣以及無細(xì)胞覆蓋的玻璃表面的相差，顯示梭形細(xì)胞在18小時(shí)時(shí)(d)在膠原纖維上遷移。圖片b和e與圖片a和d同一視野內(nèi)的熒光膠原凝膠。1小時(shí)后(b)，可見單層的TRITC-標(biāo)記膠原，在18小時(shí)(e)，創(chuàng)傷邊緣的熒光膠原被活化的遷移細(xì)胞局部清除。圖片c和f左側(cè)與中間的圖片的顯微鏡拼接圖像。條帶＝10μm.圖13B.抑制性mAb E19(抗DPPIV)對(duì)細(xì)胞遷移有的劑量依賴性抑制作用，但對(duì)照mAb C37(抗細(xì)胞表面糖蛋白gp-90)卻沒有這樣的作用。對(duì)于每種抗體，進(jìn)行了三次24小時(shí)單層細(xì)胞創(chuàng)傷模型實(shí)驗(yàn)。通過測(cè)量細(xì)胞從原始的創(chuàng)傷邊緣前進(jìn)的面積，對(duì)細(xì)胞遷移進(jìn)行定量，表示為均數(shù)+/-SD。圖13C.抗體抑制細(xì)胞遷移作用的逆轉(zhuǎn)。所有的抗體，mAb E19(抗DPPIV)和mAb C37(抗gp-90)，用量為5μg/ml。3天后，除去3種抗體，抗體抑制作用即逆轉(zhuǎn)。圖13D.創(chuàng)傷激活細(xì)胞局部清除熒光膠原作用的直方圖。膠原降解量通過測(cè)定遷移細(xì)胞清除的熒光膠原面積表示。mAb E19(抗DPPIV)抑制了遷移細(xì)胞清除膠原的作用，而對(duì)照mAb C37(抗-gp-90)則無此抑制作用。所有的抗體均使用5μg/ml的劑量。對(duì)于每種抗體，均進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)，記錄均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差。圖13E.稀疏培養(yǎng)的遷移細(xì)胞對(duì)膠原的降低。膠原降解通過測(cè)定遷移W138細(xì)胞從膠原凝膠中由釋放的熒光膠原肽量獲得。用細(xì)菌膠原酶作為熒光肽釋放的陽性對(duì)照。所有的抗體均使用5μg/ml的劑量。對(duì)于每種抗體，均進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)，記錄均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差。
圖14A-B.W138細(xì)胞在膠原基底層上的的粘附和擴(kuò)散，主要由β1整聯(lián)蛋白而非DPPIV介導(dǎo)。圖14A.mAb C27(抗β1整聯(lián)蛋白)抑制WI38細(xì)胞在膠原底層上的擴(kuò)散，mAb E19(抗DPPIV)或mAb C37(抗-gp-90)沒有這種抑制作用。圖14B.mAb C27(抗pi整聯(lián)蛋白)抑制WI38細(xì)胞在膠原基底層上粘附，mAb E19(抗DPPIV)或mAb C37(抗-gp-90)沒有這種抑制作用。
此處的每個(gè)數(shù)值都是三次獨(dú)立測(cè)量的均值+/-標(biāo)準(zhǔn)差。重復(fù)實(shí)驗(yàn)得出類似的結(jié)果。
圖15.Seprase與DPPIV位于遷移到膠原凝膠中的WI38細(xì)胞的侵入偽足上。遷移到I型膠原凝膠內(nèi)的W138細(xì)胞中，侵入偽足(空心箭頭指示處)的相差成像(a)。直接以抗DPPIV的TRITC-mAb E19標(biāo)記的侵入偽足(空心箭頭指示處)內(nèi)的DPPIV的免疫熒光圖像(b)。直接以抗seprase的FITC-mAb D28標(biāo)記的侵入偽足(空心箭頭指示處)內(nèi)的seprase的免疫熒光圖像(c)。圖片b和c的拼接圖像顯示Seprase與DPPIV位于遷移到膠原凝膠中的WI38細(xì)胞的侵入偽足上。(空心箭頭指示處)(d)。標(biāo)尺＝10μm。
圖16.Seprase和DPPIV在人惡性乳腺癌結(jié)締組織中的分布，對(duì)石蠟包埋后的腫瘤組織進(jìn)行連續(xù)切片免疫組化分析。在與侵襲性乳腺癌緊鄰的結(jié)締組織中成纖維樣細(xì)胞內(nèi)存在有seprase和DPPIV，但在遠(yuǎn)處的正常組織中并未發(fā)現(xiàn)這兩種酶(未顯示)。箭頭所示為成纖維細(xì)胞seprase或DPPIV的陽性棕色染色。癌細(xì)胞團(tuán)也呈seprase陽性(在中間及底部圖片中的大細(xì)胞聚集團(tuán))和DPPIV陽性(頂部圖片中的大細(xì)胞聚集團(tuán))。乳腺癌和毗鄰正常組織的石蠟切片被制成同一張切片，以抗seprase的mAb D8染色(中間及底部的圖片)或抗DPPIV的mAb E26染色(頂部的圖片)。標(biāo)尺＝100μm。
圖17.seprase與DPPIV在愈合中的人齒齦傷口粘膜細(xì)胞中的分布。愈合中的粘膜傷口，在第3天(a，b，c，d，g)以及第7天(e，f及h)時(shí)的冰凍切片，以蘇木精-伊紅染色(a與e)，用抗seprase的TRITC-mAb D28(b-d，以及f)處理，或抗DPPIV的mAb E19處理，然后用TRITC抗大鼠第二抗體(g與h)染色。在第3天的傷口(a-d，以及g)，結(jié)締組織(CT)內(nèi)含有seprase(b，c，以及d)及DPPIV(g)抗體強(qiáng)染色的細(xì)胞。共聚焦顯微鏡成像顯示，在結(jié)締組織中(圖片d)，seprase位于以線狀偽足形式或成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的胞體形式的侵入偽足上(箭頭)。在第7天的傷口(e，f以及h)，傷口的肉芽組織(GT)中發(fā)現(xiàn)有seprase染色(f)，而未發(fā)現(xiàn)DPPIV染色(h)。點(diǎn)狀線表示肉芽組織與結(jié)締組織的邊界。字母E表示傷口的上皮細(xì)胞；CT，為結(jié)締組織；FC，為纖維蛋白凝塊；GT，為肉芽組織。標(biāo)尺＝200μm。
圖18.seprase與DPPIV同位于人惡性乳腺導(dǎo)管癌的侵襲性前沿的內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞以及癌細(xì)胞上。將甲醛固定，石蠟包埋的人惡性乳腺導(dǎo)管癌樣本，制成連續(xù)切片，seprase被mAb D8染成棕色(左側(cè)三張圖片)，毗鄰切片上DPPIV被mAb E26染色(右側(cè)三張)，觀察二者分布。
最上面的兩張圖片顯示的是距腫瘤所在部位約2cm的正常乳腺組織。在其上皮細(xì)胞(黑色空心箭頭)，纖維細(xì)胞(黑色箭頭)和內(nèi)皮細(xì)胞(黑色空心箭頭尖)內(nèi)觀察到其seprase和DPPIV染色為陰性。
中間的兩張圖片顯示的是分化較差(高分級(jí))的癌細(xì)胞，在癌細(xì)胞(橙色空心箭頭)，成纖維細(xì)胞(橙色箭色)和部分內(nèi)皮細(xì)胞(橙色空心箭頭尖)中可見明顯的seprase或DPPIV棕色，而在部分大血管的細(xì)胞中未見被染色(黑色空心箭頭)。上面和中間圖片中的箭頭表示比例尺為100μm。
最下面的兩張圖片顯示的是低倍鏡下分化較差(高分級(jí))的癌細(xì)胞，在癌細(xì)胞(橙色空心箭頭)，成纖維細(xì)胞(橙色箭色)和部分內(nèi)皮細(xì)胞(橙色空心箭頭尖)中可見明顯的seprase或DPPIV棕色。seprase及DPPIV特別在侵襲前沿處的癌細(xì)胞中有表達(dá)，如該視野中的大部分癌細(xì)胞所示；但在腫瘤中心，如該視野中所示，卻未發(fā)現(xiàn)有seprase及DPPIV的表達(dá)。最下面的圖片中的箭頭表示比例尺為800μm。
圖19.MDA-MB-436細(xì)胞的蛋白酶表達(dá)與膠原降解能力之間的關(guān)系。A，差異表達(dá)seprase與DPPIV的MDA-MB-436細(xì)胞釋放熒光膠原肽。膠原降解的測(cè)定通過母細(xì)胞(Parent)，轉(zhuǎn)染載體(pAII)的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染seprase cDNA(pA15)的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染DPPIV核糖酶的細(xì)胞(pZ8)所釋放的熒光膠原肽完成。對(duì)于每種細(xì)胞進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)，記錄均數(shù)+/-標(biāo)準(zhǔn)差。星號(hào)”*”表示p＜0.05，pA15 seprase sense以及pZ8 DPPIV核糖酶轉(zhuǎn)染子與母細(xì)胞和pAI1載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比較。B，seprase和DPPIV在上述的MDA-MB-436細(xì)胞中的差異表達(dá)。以RIPA緩沖液浸提細(xì)胞，用mAb D8(抗-seprase)mAb F4(抗-DPPIV)進(jìn)行免疫印跡法分析。
5.本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明涉及制備細(xì)胞粘附基質(zhì)的新方法，這種基質(zhì)可用于從癌癥患者的樣品中分離和檢測(cè)具有侵襲性及轉(zhuǎn)移性的活性癌細(xì)胞亞群。具體地說，所述方法利用膠原性基質(zhì)系統(tǒng)來分離并檢測(cè)癌細(xì)胞。在以下的各節(jié)中，本發(fā)明進(jìn)一步描述了一種體外檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移性的高靈敏度方法。這種方法的一個(gè)重要特點(diǎn)是適用于血液、骨髓、腹水、體液以及腫瘤組織中的癌細(xì)胞，以及任何一種已確立的癌細(xì)胞系。
本發(fā)明提供了一種捕獲癌細(xì)胞的“細(xì)胞粘附基質(zhì)”，可以從全血、白細(xì)胞層、外周血干細(xì)胞制品或骨髓中有效地大量清除活性癌細(xì)胞。本發(fā)明的細(xì)胞分離方法可用于癌癥診斷，癌癥早期檢測(cè)，藥物及手術(shù)治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)，及對(duì)腫瘤發(fā)展的預(yù)后。本發(fā)明的細(xì)胞分離方法還可用于癌癥的預(yù)防及治療，包括作為血液過濾器用來捕獲癌細(xì)胞，或用于基因及細(xì)胞遺傳分析，或用于發(fā)現(xiàn)新藥靶標(biāo)，以及開發(fā)癌疫苗等。
本發(fā)明的體外試驗(yàn)系統(tǒng)還提供一種篩選方法，可用于鑒定抗轉(zhuǎn)移藥物。此類藥物可用于癌癥患者體內(nèi)一致癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散。另外，該方法還可用于篩選具有抗轉(zhuǎn)移作用的核酸分子。例如，可篩選能抑制轉(zhuǎn)移的反義分子和核糖酶分子。本發(fā)明的另一用途是用于檢測(cè)seprase或DPPIV活性，以判斷癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。
5.1本發(fā)明的基質(zhì)本發(fā)明提供了一種新型的天然細(xì)胞粘附基質(zhì)系統(tǒng)，可用于分離和檢測(cè)癌癥患者樣品中的癌細(xì)胞。本發(fā)明的天然細(xì)胞粘附基質(zhì)與血源性細(xì)胞粘附成分具有特異性結(jié)合親和力，包括但不限于纖維連接蛋白，層粘連蛋白以及玻連蛋白。本發(fā)明的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)移性癌癥患者循環(huán)中的癌細(xì)胞會(huì)粘附于組織碎片，形成較大的細(xì)胞團(tuán)，這提示天然的結(jié)構(gòu)支架與血源性粘附分子之間具有較高的親和力，因此可促進(jìn)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的粘附。另外，已發(fā)現(xiàn)天然纖維，包括I型/III型膠原，纖維蛋白，純棉，以及組織培養(yǎng)塑料的機(jī)械刮擦表面易吸附血源性粘附成分從而促進(jìn)癌細(xì)胞的粘附。
本發(fā)明的細(xì)胞粘附基質(zhì)包括膠原纖維，纖維蛋白凝膠，純棉或塑料纖維，可用作為細(xì)胞基底層來檢測(cè)和分離人體內(nèi)的活細(xì)胞，這些細(xì)胞包括但不限于癌細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞以及組織細(xì)胞。各種各樣市售的膠原性材料可用于制備這種膠原基質(zhì)，包括但不限于人胎盤I型膠原，購(gòu)自Calbiochem-Novabiochem Co.(La Jolla，CA)；以及大鼠尾I型膠原，購(gòu)自Collaborative Biomedical Products(Becton andDickinson Labware，Bedford，MA)。也可以用任何一種得自膠原表達(dá)重組宿主細(xì)胞(包括細(xì)菌、酵母菌或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞)的重組膠原。
I型膠原易于被組裝或重新組裝成任何形式，也可以通過聚合及解聚過程包被于血管表面。例如，已知I型膠原單體在濃度達(dá)到0.3mg/ml以上時(shí)會(huì)在天然pH值及溫度(25-37℃)下在含生理鹽水的介質(zhì)中發(fā)生聚合，并在pH2-4，低溫(2-10℃)以及低鹽介質(zhì)中解聚(Klasson，S.C.，et al.1986，Coll.Relat.Res.6397)。這種細(xì)胞粘附基質(zhì)可以沿微毛細(xì)血管壁形成，在細(xì)胞分離柱、組織培養(yǎng)板或微小網(wǎng)孔中形成，用來捕獲生物液體中的癌細(xì)胞。
本發(fā)明的基質(zhì)，其構(gòu)架可由天然纖維組成，包括但不限于膠原，纖維蛋白以及純棉。這些基質(zhì)構(gòu)架的共同特性是，其表面對(duì)血源性粘附分子有親和力，血源性粘附分子包括但不限于纖連蛋白，玻連蛋白以及層粘連蛋白?；|(zhì)的構(gòu)架被以全血、血漿或血清中的細(xì)胞粘附分子包被時(shí)，可以提供一個(gè)粘附表面供高密度的細(xì)胞群中的癌細(xì)胞及組織細(xì)胞粘附。這些細(xì)胞群可能來自血液，淋巴液，骨髓以及腫瘤組織，可能包括多種不同的細(xì)胞類型。
在此描述一種制備膠原性基質(zhì)的方法。通過減少血漿中的抗凝血?jiǎng)┖吭诠鼙砻嬷苽淞艘环N由纖維蛋白纖維組成的基質(zhì)構(gòu)架。先以Dulbecco改進(jìn)的Eagle＇s液(DMEM)將動(dòng)物或人血漿稀釋到10-20％，然后加入細(xì)胞分離管或分離孔中。將分離管或孔在CO2孵育箱中37°孵育30分鐘，使纖維蛋白纖維在分離管表面聚合。將純棉纖維簡(jiǎn)單地懸浮于含10-20％牛血清的DMEM中，接種于細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，讓有細(xì)胞粘附分子包被。相似的，將玻璃及塑料纖維也懸浮在含10-20％牛血清的DMEM中，以細(xì)胞粘附分子包被。以Eppendorf移液管尖端刮擦細(xì)胞培養(yǎng)板以制備基質(zhì)構(gòu)架。應(yīng)該注意的是，在將全血或白細(xì)胞層加于基質(zhì)構(gòu)架上時(shí)，無需預(yù)先以細(xì)胞粘附分子對(duì)基質(zhì)構(gòu)架進(jìn)行包被。
然而，需用抗凝劑處理全血或白細(xì)胞層，以防止在細(xì)胞分離過程中出現(xiàn)凝結(jié)。特別注意，需預(yù)先以等體積的含0.5mM EDTA的介質(zhì)或以含肝素50單位/ml的10％抗凝劑右旋糖檸檬酸鹽(ACD；Baxter Healthcare Corporation，IL)對(duì)血液或白細(xì)胞層進(jìn)行稀釋。
為了便于對(duì)結(jié)合在膠原基質(zhì)上的癌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，為了測(cè)定這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性，可以用各種不同的試劑對(duì)基質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，這些試劑包括但不限于熒光染料，生物素，染色劑，以及放射活性探針。例如，膠原纖維可通過直接偶聯(lián)染色劑來標(biāo)記，這樣可以保護(hù)膠原內(nèi)的聚合位點(diǎn)免于被標(biāo)記。膠原纖維(可以用這種方法進(jìn)行標(biāo)記，也可以不進(jìn)行標(biāo)記)很容易解聚成可溶性的膠原單體，然而可在管道表面裝配成任何形狀。宜用于標(biāo)記膠原的染料包括Bodipy-rhodamine或熒光素染料(Molecular Probes公司，為猝滅熒光染料)。如圖1A、1B所示，當(dāng)兩個(gè)染料分子在膠原上緊靠在一起時(shí)，Bodipy-rhodamine的熒光信號(hào)(黃色)減弱，但當(dāng)膠原降解或被酶裂解成兩個(gè)分開的染料分子時(shí)，熒光信號(hào)(紅色)增強(qiáng)。標(biāo)記基質(zhì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。同樣地，將細(xì)胞毒性化合物與這種膠原纖維結(jié)合，可提供一種新的載體，將藥物送達(dá)特定的癌細(xì)胞。例如，將一種與細(xì)胞毒素結(jié)合的膠原微球注入癌癥患者體內(nèi)，可以特異性地殺傷癌細(xì)胞。
基質(zhì)構(gòu)架的表面再用血源性的粘附分子包被。多種市售的含血源性粘附分子的溶液均可用于包被上述基質(zhì)，這包括但不限于小牛血清，胎牛血清(Collaborative Research，Inc.，Bedford，MA)；人血清(Sigma)以及人血漿纖維連接蛋白，層粘連蛋白以及玻連蛋白(Collaborative Research，Inc.，Bedford，MA)。可以應(yīng)用10-20％的小牛血清，胎牛血清，或人血清(或血漿)，或0.01-0.5mg/ml的人血漿纖維連接蛋白，層粘連蛋白以及玻連蛋白包被這種基質(zhì)構(gòu)架的表面。
本發(fā)明可較好地達(dá)到預(yù)期目的，即提供一種細(xì)胞分離系統(tǒng)，提供預(yù)防及干預(yù)轉(zhuǎn)移瘤形成的方法。具體地說，本發(fā)明提供了一種分離癌癥患者的癌細(xì)胞的方法，包括(1)將癌癥患者的癌細(xì)胞樣品接種在細(xì)胞粘附基質(zhì)上；(2)癌細(xì)胞樣品孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使癌細(xì)胞粘附于基質(zhì)上，然后除去非粘附細(xì)胞；(3)體外擴(kuò)增基質(zhì)上結(jié)合的癌細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞分離方法可用于體內(nèi)及體外來源的各種癌細(xì)胞群，所述來源包括但不限于體液，如循環(huán)血液、尿液、骨髓、腦脊液及胸膜液，腹水，唾液；離體的腫瘤組織樣本；以及培養(yǎng)的癌細(xì)胞。關(guān)于各種癌細(xì)胞群的示例，包括但不限于以下癌細(xì)胞前列腺，乳腺，結(jié)腸，腦，肺，頭頸部，卵巢，膀胱，腎及睪丸，黑色素瘤，淋巴瘤，肝，胰腺以及其它胃腸道癌。具體地說，各種癌的癌細(xì)胞群包括，肺癌細(xì)胞，肺腺瘤細(xì)胞，結(jié)腸腺癌細(xì)胞，腎癌細(xì)胞，直腸腺癌細(xì)胞，回盲部腺癌細(xì)胞，胃腺癌、胰腺癌、肝細(xì)胞瘤細(xì)胞，肝細(xì)胞癌細(xì)胞，前列腺腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞，乳腺癌、卵巢畸胎瘤、惡性黑色素瘤細(xì)胞，子宮頸、喉及口腔源性的鱗狀細(xì)胞癌；惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，子宮內(nèi)膜腺癌，星狀細(xì)胞瘤，伯基特淋巴瘤細(xì)胞，以及非何杰金淋巴瘤細(xì)胞。
可用各種方法檢測(cè)結(jié)合在基質(zhì)上的癌細(xì)胞，這些方法包括利用癌細(xì)胞的功能性、免疫表型、以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行檢測(cè)。另外，可根據(jù)細(xì)胞攝取經(jīng)標(biāo)記的膠原性基質(zhì)來檢測(cè)結(jié)合在基質(zhì)上的細(xì)胞。
5.2本發(fā)明在腫瘤治療及預(yù)防中的應(yīng)用本發(fā)明所提供的細(xì)胞分離方法的用途包括例如清除血液或骨髓中的惡性癌細(xì)胞，以及富集造血祖代細(xì)胞作為骨髓移植的供體細(xì)胞。細(xì)胞分離方法之后，可可用與腫瘤抗原表位(如上皮細(xì)胞的標(biāo)記物)反應(yīng)的抗體，或與內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)的抗體如抗-CD31或抗-CD34分別富集癌細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞群。
在一種實(shí)施方式中，可以通過本發(fā)明的細(xì)胞分離方法，從全血中富集不同腫瘤的癌細(xì)胞，經(jīng)體外擴(kuò)增后，與樹突狀細(xì)胞反應(yīng)，可利用所述的方法研制成一種有效的抗腫瘤疫苗(Brugger et al.，1999，Annals of the New York Academy ofScience 872363-371)。
在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方式中，從一例癌癥患者體內(nèi)分離出循環(huán)性癌細(xì)胞，然后在體外接受一系列化療藥物處理，以確定各治療方案的療效。隨后可給予患者有效劑量的藥物或聯(lián)合用藥(設(shè)計(jì)藥物)。
在本發(fā)明的另一項(xiàng)實(shí)施方式中，結(jié)合了細(xì)胞毒素的膠原微球被注入一例轉(zhuǎn)移瘤患者的體內(nèi)，以選擇性殺傷癌細(xì)胞。體內(nèi)癌細(xì)胞特異性的粘附并內(nèi)吞毒性膠原，可提供一種新型的抗癌治療方法。
本發(fā)明還提供了纖維化合物，包括但不限于血源性粘附分子包被的膠原、纖維蛋白、棉及塑料纖維，可作為細(xì)胞粘附基質(zhì)用于治療轉(zhuǎn)移瘤患者的血液過濾器。所述細(xì)胞粘附基質(zhì)的用途包括將患者血液灌注通過這種細(xì)胞粘附基質(zhì)。在血液灌注方案中，抽出患者的血液，與細(xì)胞粘附基質(zhì)接觸。在通過細(xì)胞粘附基質(zhì)的過程中，患者血液內(nèi)的癌細(xì)胞將優(yōu)先粘附在細(xì)胞基質(zhì)上，于是從患者循環(huán)中清除。
要制備這種細(xì)胞粘附基質(zhì)，可在一管道內(nèi)進(jìn)行膠原或上文所述某種材料的成形，這包括但不限于柱子，組織培養(yǎng)板，微毛細(xì)管，或微網(wǎng)孔，用來捕獲生物液體中的癌細(xì)胞。
供患者血液通過的管道，有一個(gè)入口和一個(gè)出口。在本發(fā)明的實(shí)施方式之一中，細(xì)胞粘附基質(zhì)在容器管道(包括血液輸入管路，可聯(lián)用一傳統(tǒng)蠕動(dòng)泵)內(nèi)成型。管道還包括輸出管路。輸入、輸出管路與適當(dāng)?shù)膭?dòng)靜脈瘺管相連接，例如，可將這種動(dòng)靜脈瘺管植入患者的前臂。另外，血液成分分采后的外周血回輸也可與上述的細(xì)胞粘附基質(zhì)癌細(xì)胞分離術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。血液成分分采法可以將白細(xì)胞計(jì)數(shù)回收到1×109/L以上?？梢詰?yīng)用Cobe Spectra細(xì)胞分離裝置(Lakewood，Colo.)，以80ml/min的速率進(jìn)行血液成分分采或白細(xì)胞分采，進(jìn)行200分鐘(總體積16L)。本發(fā)明細(xì)胞粘附基質(zhì)的應(yīng)用提供了一種從患者血循環(huán)中清除那些具有較高轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞的方法。
5.3測(cè)定癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的試驗(yàn)本發(fā)明目的之一是提供一種方法，用于鑒定轉(zhuǎn)移性較高的癌癥患者。
本發(fā)明提供了一種方法，利用本發(fā)明以膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)系統(tǒng)，通過檢測(cè)受試者癌細(xì)胞侵襲能力，即粘附、降解及攝入膠原基質(zhì)的能力來評(píng)價(jià)癌轉(zhuǎn)移性。檢查并判斷癌細(xì)胞的血管生成傾向，細(xì)胞活度及增殖能力，為腫瘤預(yù)后提供新的方法。
本發(fā)明所述細(xì)胞分離及試驗(yàn)方法可用于各種診斷目的。這些用途包括早期檢測(cè)，藥物及手術(shù)治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)，以及腫瘤發(fā)展的預(yù)后所需的形態(tài)學(xué)、分子、生化或免疫試驗(yàn)方法。例如，可制備循環(huán)性癌細(xì)胞的RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，DNA微陣列分析和基因表達(dá)的系列分析(SAGE)以及鑒定作為癌癥診斷標(biāo)志或控制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物的靶標(biāo)的差異表達(dá)的基因。另外，可應(yīng)用蛋白組學(xué)(proteomics)分析得出分離所得的癌細(xì)胞的蛋白圖譜，用來發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)移標(biāo)記和藥物靶標(biāo)。分離得到的癌細(xì)胞可用上皮細(xì)胞特異性抗原，seprase及DPPIV抗原或內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行染色，定量測(cè)定，確定存在的癌細(xì)胞數(shù)目，以評(píng)價(jià)癌癥的轉(zhuǎn)移性。作為腫瘤的常規(guī)病理學(xué)評(píng)價(jià)，可以對(duì)分離得到的癌細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)估。將分離所得的癌細(xì)胞在無菌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)分析，以檢測(cè)是否存在染色體異?；蛲蛔??？捎肈NA微陣列，PCR以及FISH使分離所得的癌細(xì)胞與分子探針反應(yīng)，從而更靈敏地檢測(cè)突變。這些方法避免了在此之前須采用的損傷更重、更為昂貴的手術(shù)操作。
本發(fā)明可較好地達(dá)到預(yù)期目的，即為評(píng)價(jià)癌癥患者的預(yù)后提供一種方法，為鑒定那些易于發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者提供一種方法。
具體地說，本發(fā)明包括了一種利用本發(fā)明的細(xì)胞粘附基質(zhì)確定自患者分離所得癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的功能性試驗(yàn)方法。
具體地說，本發(fā)明涉及一種測(cè)定癌癥患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的方法，該方法包括(1)將癌癥患者的癌細(xì)胞樣本接種在細(xì)胞粘附基質(zhì)上；(2)將癌細(xì)胞樣本孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)育以使癌細(xì)胞粘附、遷移穿越基質(zhì)或攝取基質(zhì)；(3)檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)材料的粘附、遷移穿越或攝取，發(fā)生所述粘附、遷移或攝取是癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移性的標(biāo)志。
本發(fā)明的試驗(yàn)方法涉及一種人造基質(zhì)，癌細(xì)胞可以接種在這種人造基質(zhì)上?？梢越臃N在這種基質(zhì)上的細(xì)胞包括但不限于血細(xì)胞，癌細(xì)胞系和哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞，后者包括癌癥患者的細(xì)胞，如腫瘤組織活檢標(biāo)本等。
將癌細(xì)胞被接種于基質(zhì)上后，可將該基質(zhì)孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使細(xì)胞粘附、攝取或侵入基質(zhì)中。
接種時(shí)間將根據(jù)所接種的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的不同而不同。
接種后，可用各種不同的方法檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附和/或攝取。
例如，可用試劑對(duì)膠原性基質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，所述實(shí)際例如熒光染料，生物素，染料以及放射活性探針等。癌細(xì)胞攝入這種標(biāo)記后的基質(zhì)造成細(xì)胞被標(biāo)記。可用各種已知方法檢測(cè)表達(dá)了所標(biāo)記的標(biāo)志物的癌細(xì)胞，這些方法包括但不限于熒光顯微鏡檢，熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或液閃計(jì)數(shù)器測(cè)定放射活性。用這些標(biāo)記可對(duì)細(xì)胞粘附及攝入基質(zhì)材料的程度進(jìn)行定量，以確定細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。
此外，對(duì)用本發(fā)明基質(zhì)分離所得的癌細(xì)胞可用各種已知方法測(cè)定其轉(zhuǎn)移性。例如，可以將癌細(xì)胞樣品與標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?acLDL+)進(jìn)行孵育，接種在膠原凝膠板上，使形成毛細(xì)血管網(wǎng)，或以內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的抗體進(jìn)行染色，這些標(biāo)記包括但不限于CD31+，F(xiàn)IkI+，以及因子VIII(F8+)，充分反應(yīng)一段時(shí)間后，測(cè)定癌細(xì)胞獲得的內(nèi)皮表型。另外，可用一種凋亡試驗(yàn)試劑盒(Molecular Probes，Inc.)，檢測(cè)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的傾向。癌細(xì)胞簇可與抗白細(xì)胞標(biāo)記抗體反應(yīng)，這些標(biāo)記物包括但不限于CD45，CD19，CD8和CD4，充分反應(yīng)一段時(shí)間后，可對(duì)癌細(xì)胞的活性，與免疫細(xì)胞(白細(xì)胞，T-細(xì)胞與殺傷細(xì)胞)的相關(guān)性，以及對(duì)細(xì)胞或補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解過程的耐受性等進(jìn)行定量檢測(cè)。將癌細(xì)胞在含有10-20％人血漿的組織培養(yǎng)液中增殖1-5周，可測(cè)定分離的癌細(xì)胞在培養(yǎng)基中形成群落的能力。
本發(fā)明的試驗(yàn)系統(tǒng)還可被用于監(jiān)測(cè)抗癌藥物在治療過程的療效。例如，可在治療前后測(cè)定癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。比較整個(gè)治療過程中癌細(xì)胞的數(shù)量和轉(zhuǎn)移性，由此可測(cè)定藥物的療效。有效的抗癌藥是指那些能夠使可檢測(cè)到的癌細(xì)胞對(duì)膠原性基質(zhì)的粘附、降解或攝取水平降低的藥物，或使可檢測(cè)到的癌細(xì)胞的活性降低的藥物，以及使可檢測(cè)到的癌細(xì)胞形成群落的能力降低的藥物。
5.4鑒定抗轉(zhuǎn)移藥物的體外篩選方法本發(fā)明還提供了藥物篩選方法，用于鑒定能夠抑制癌細(xì)胞自原發(fā)腫瘤部位擴(kuò)散形成轉(zhuǎn)移灶的藥物。根據(jù)本發(fā)明，可對(duì)藥物抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力進(jìn)行篩選。用本發(fā)明試驗(yàn)方法鑒定藥物的抗轉(zhuǎn)移作用時(shí)，將待測(cè)藥物與癌細(xì)胞一起接種膠原基質(zhì)上。將待測(cè)藥物存在下癌細(xì)胞對(duì)膠原基質(zhì)的粘附、攝取和/或降解作用與溶劑對(duì)照存在下癌細(xì)胞對(duì)膠原基質(zhì)的粘附、攝取和/或降解作用進(jìn)行比較。如果藥物能夠抑制癌細(xì)胞對(duì)膠原基質(zhì)的粘附、攝取和/或降解，則可認(rèn)定其具有抗轉(zhuǎn)移作用。
具體來說，本發(fā)明包括了一種鑒定藥物是否能抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括(1)將癌細(xì)胞樣品與待測(cè)藥物或溶劑對(duì)照一起接種在細(xì)胞粘附基質(zhì)上，(2)孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使癌細(xì)胞粘附、降解和/或攝取基質(zhì)；(3)檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附、降解和/或攝取，與溶劑對(duì)照存在下的癌細(xì)胞比較，如果在待測(cè)藥物存在下癌細(xì)胞對(duì)膠原基質(zhì)的粘附、攝取和/或降解作用降低了，則提示這種化合物具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。
可用本發(fā)明可以進(jìn)行篩選的藥物包括但不限于無機(jī)化合物，肽，抗體及其片段，以及其它有機(jī)化合物(擬肽類)，這些藥物能夠抑制癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤部位擴(kuò)散為轉(zhuǎn)移灶。這些藥物包括但不限于肽類，如可溶性肽類，包括但不限于隨機(jī)肽文庫(kù)的成員；(例如，參見Lam，K.S.et al.，1991，Nature 35482-84；Houghten.R.et al.，1991，Nature 35484-86)，以及由D-和/或L-構(gòu)型的氨基酸、磷肽(包括但不限于磷肽文庫(kù)隨機(jī)或部分降解的成員；例如，參見Songyang，Z.et.al.，1993，Cell 72767-778)組成的組合化學(xué)衍生的分子文庫(kù)。
用本發(fā)明方法鑒定的藥物可用于了解癌細(xì)胞是否能夠成功地遷移和侵襲，并有助于抑制癌癥患者體內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的形成。
為測(cè)定篩選鑒定所得化合物的效果，可在動(dòng)物模型系統(tǒng)中檢測(cè)轉(zhuǎn)移灶的形成?？蓪⒋祟悇?dòng)物模型作為試驗(yàn)基礎(chǔ)來鑒定對(duì)癌轉(zhuǎn)移有效的藥物、醫(yī)療產(chǎn)品、療法及干預(yù)措施。
本發(fā)明的試驗(yàn)方法還可用于篩選能夠抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的核酸序列。此類核酸序列包括含有蛋白編碼序列或反義序列的分子?？梢栽跈z測(cè)之前，將這些核酸分子通過以下方法通過例如電穿孔法，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法，磷酸鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或病毒感染等方法轉(zhuǎn)移到癌細(xì)胞內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，可用一種試驗(yàn)系統(tǒng)篩選可調(diào)節(jié)絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶(包括DPPIV和seprase)的活性從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的藥物。據(jù)此，可用內(nèi)源性表達(dá)DPPIV和seprase的細(xì)胞篩選此類藥物?；蛘?，某些細(xì)胞系，如293細(xì)胞，COS細(xì)胞，CHO細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等經(jīng)遺傳工程改造而表達(dá)DPPIV和seprase，因而可用于篩選此類藥物。較好的是，對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，使其表達(dá)DPPIV和seprase，這種宿主細(xì)胞可用作為此項(xiàng)試驗(yàn)的終點(diǎn)；例如，檢測(cè)它在化學(xué)，物理，生物或表型等方面的改變。
在應(yīng)用此類細(xì)胞系統(tǒng)時(shí)，表達(dá)DPPIV和seprase的細(xì)胞與待測(cè)化合物或與溶劑對(duì)照接觸。接觸后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定DPPIV和seprase蛋白酶的表達(dá)和/或活性。例如，在接觸后，對(duì)細(xì)胞溶解產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定明膠分解活性(seprase)，或含有毗鄰于脯氨氨的磷酸化殘基的底物，如H-Gly-Pro-p-硝基苯胺或氨甲基香豆素(DPPIV與seprase)以及Z-Gly-Pro-p-硝基苯胺或氨甲基香豆素(seprase)(Kaspari et al.，1996)。待測(cè)化合物使DPPIV和/或seprase蛋白酶活性水平降低到以溶劑對(duì)照液處理的細(xì)胞中所觀察到的活性水平以下，表明該待測(cè)化合物抑制了DDPIV及seprase相關(guān)性蛋白酶的活性。
此外，所述試驗(yàn)方法還可用于鑒定那些可拮抗DPPIV與seprase相互作用從而抑制這種蛋白酶復(fù)合物活性的藥物。在鑒定此類藥物時(shí)，在有或沒有待測(cè)化合物的條件下，對(duì)DPPIV和seprase蛋白進(jìn)行孵育，然后檢測(cè)復(fù)合物形成的量。復(fù)合物形成下降，表明待測(cè)藥物能夠拮抗DPPIV與seprase之間的相互作用。
本發(fā)明的內(nèi)容之一是在無細(xì)胞試驗(yàn)中重組表達(dá)、標(biāo)記及利用可溶性DPPIV與seprase，以鑒定可抑制DPPIV與seprase相互作用的化合物。在此類試驗(yàn)中，DPPIV或seprase均可通過已知方法粘附于固體基質(zhì)如試管或微滴定孔上。然后對(duì)鑒定待測(cè)藥物抑制DPPIV或seprase在固體基質(zhì)上相互作用的能力。
5.5成分與用途本發(fā)明涉及一種新的癌細(xì)胞捕獲系統(tǒng)，可對(duì)癌癥患者血和/或組織中的侵襲性癌細(xì)胞進(jìn)行迅速有效地檢測(cè)和選擇。本發(fā)明涉及用作細(xì)胞粘附基質(zhì)的纖維性組合物，包括血源粘附分子包被的膠原、纖維蛋白、棉纖維以及塑料纖維等。本發(fā)明還涉及了用此類包被有纖維檢測(cè)癌癥患者體內(nèi)轉(zhuǎn)移性細(xì)胞，以及用此類包被纖維過濾轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液?？捎糜诎┌Y患者的細(xì)胞粘附基質(zhì)包括在前文5.1.-5.2中所提及的物質(zhì)。
本發(fā)明還提供了用本發(fā)明的細(xì)胞粘附基質(zhì)分離所得的細(xì)胞成分。此類細(xì)胞成分包括一小部分的具有轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞亞群，以及血液中可以引起腫瘤晚期相關(guān)性器官功能不全的癌細(xì)胞集落。所富集的癌細(xì)胞群可用于例如研究新的藥物靶標(biāo)，探討有關(guān)的遺傳缺陷，檢測(cè)這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，以及探討最有效的治療方案。所富集的細(xì)胞還可用于與樹突狀細(xì)胞融合，以開發(fā)腫瘤疫苗。
本發(fā)明提供了通過給予調(diào)節(jié)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的藥物來治療增殖性疾病如腫瘤的方法?？山o予癌癥患者的化合物包括用前文5.3.中所述方法鑒定出來的那些藥物。
本發(fā)明實(shí)施方式之一鑒定出了組織侵襲性表型所需要的關(guān)鍵性蛋白酶。例如，已發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞遷移與侵襲需要絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶如seprase和DPPIV的活化。因此，可用此類蛋白酶的抑制劑抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性。此類抑制劑包括seprase或DPPIV的免疫特異性的抗體(圖13A-E)?；蛘?，向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)seprase或DPPIV的反義RNA或核糖酶的載體，用來降低癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力(圖19)。
另外，也可用蛋白酶抑制劑來抑制癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤擴(kuò)散形成轉(zhuǎn)移灶。如第7部分實(shí)施例2所示，DPPIV抑制劑，即抗DPPIV抗體，可抑制癌細(xì)胞遷移。癌細(xì)胞向體內(nèi)其它部位轉(zhuǎn)移的癌癥可用能夠抑制癌細(xì)胞遷移和組織侵襲的藥物進(jìn)行治療。此類癌癥包括諸如乳腺癌和前列腺癌等。
鑒定出的用于預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的化合物在用于人體之前可在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)，這類動(dòng)物模型包括但不限于犬、大鼠、小鼠、雞、牛、猴、家兔等。對(duì)于體內(nèi)試驗(yàn)，在用于人類之前，可采用任何一種已經(jīng)較成熟的動(dòng)物模型。
在具體實(shí)施例中，癌癥患者的癌細(xì)胞被證實(shí)其轉(zhuǎn)移性有所增高后，可給予抑制癌轉(zhuǎn)移的化合物。有所增高的轉(zhuǎn)移性很容易被檢測(cè)出來收集血樣(或患者的活檢組織)，用本發(fā)明的細(xì)胞分離及檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)分離的細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。
本發(fā)明提供了通過給予有效量的能抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性的化合物來治療癌癥的方法。接受者宜為動(dòng)物，哺乳動(dòng)物較好，最好是人類。
本發(fā)明還提供了可與細(xì)胞粘附基質(zhì)結(jié)合或與本發(fā)明中分離的細(xì)胞成分結(jié)合藥物組合物。這些藥物組合物包括可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞遷移及侵襲的治療有效量的組合物以及藥學(xué)上可接受的載體。在具體實(shí)施例中，所謂“藥學(xué)上可接受的”一詞是指獲得聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或在美國(guó)藥典中列出的，或其它被廣為認(rèn)可的藥典列出的，適用于動(dòng)物，特別是人體?！拜d體”一詞是指與組合物一起給予的稀釋劑、輔佐劑、賦形劑或溶劑。這類藥學(xué)載體可以是無菌液體，如水和油，包括那些石油、動(dòng)物、蔬菜或合成的油，如花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。所述藥物組合物經(jīng)由靜脈給予時(shí)，水是優(yōu)選的載體。生理鹽水溶液，右旋糖水溶液和甘油溶液等也可作為液態(tài)載體，特別是對(duì)注射用溶液而言。
6.實(shí)施例分離血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)性循環(huán)性癌細(xì)胞以下所述表明，用新的細(xì)胞粘附基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞的分離與檢定可將活性癌細(xì)胞從轉(zhuǎn)移性癌癥患者的外周血中分離出來。這些細(xì)胞獲得了血管生成和轉(zhuǎn)移所必需的分子決定簇。
于來自原發(fā)腫瘤的細(xì)胞相比，這些活性循環(huán)性癌細(xì)胞代表了癌細(xì)胞群中一個(gè)能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)移的小亞群。
6.1材料和方法6.1.1采集血液標(biāo)本活體采集的血液或細(xì)胞應(yīng)在采集后相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞分離，否則這些細(xì)胞可能失去活性。為了獲得癌細(xì)胞的最佳分離，宜將采集的血液、腹水或組織標(biāo)本保存于4℃，不超過24小，最好在4小時(shí)之內(nèi)。
在盛有抗凝劑肝素鋰的真空管(Becton Dickinson，頂端綠色，每管裝7毫升)中，每次采集大約10-20毫升的血液?；颊叩哪挲g，性別，診斷日期，治療干預(yù)，臨床狀況以及活組織檢查報(bào)告都可以從患者的記錄圖表中追溯。實(shí)驗(yàn)方案通過了研究機(jī)構(gòu)審察委員會(huì)的批準(zhǔn)。
6.1.2分離血液或腫瘤組織中的癌細(xì)胞制備膠原聚合溶液，然后將其調(diào)整到預(yù)測(cè)濃度，使每毫升Dulbecco＇s modifiedEagle＇s(DMEM)培養(yǎng)液含1-2毫克膠原，在膠凝于試管底部之前，迅速置于冰塊上(圖1A)。具體地說，在4℃將I型膠原溶液(大鼠尾I型膠原，4.0mg/ml，合作生物制品，Becton和Dickinson Labware，Bedford，MA)與等體積的DMEM混合。
在4℃下，將混合物薄薄的一層覆蓋到96-孔微量滴定板或6孔培養(yǎng)板各孔的底部。為了形成膠原纖維凝膠，37℃下培養(yǎng)30分鐘，讓膠原層聚合。
6.1.3分離血液、腹水或腫瘤組織中的癌細(xì)胞為了分離細(xì)胞群中的癌細(xì)胞，首先要在細(xì)胞培養(yǎng)基上覆蓋膠原基質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)基的組成為1∶1的Dulbecco＇s modified Eagle＇s培養(yǎng)液和RPMI1640，并添加有10％的牛血清，15％的Nu-血清，2毫摩的L-谷氨酰胺，0.1毫摩的非必需氨基酸，1毫摩的丙酮酸鈉，1單位/毫升的青霉素，以及10μg/ml鏈霉素。然而，也可以直接從全血中分離癌細(xì)胞，而不必包被血中的其他粘附分子。
在4℃，從標(biāo)本中分離血漿和細(xì)胞。
離心血液標(biāo)本，得到血漿，用含2％牛血清和0.5毫摩爾EDTA的PBS稀釋細(xì)胞傳動(dòng)到最初的溶液體積，接著用Ficoll-Paque(Pharmacia)分級(jí)收集單核細(xì)胞。根據(jù)對(duì)細(xì)胞粘附基質(zhì)的差異粘附，進(jìn)一步篩選單核細(xì)胞中的活性和侵襲性癌細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將單核細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)基中(與血液體積相同)。接種一部分單核細(xì)胞，即，在96孔微量滴定板中每孔0.1毫升，或在6孔組織培養(yǎng)板(NUNC)中每孔1到10毫升，兩板均包被有膠原膠質(zhì)，培養(yǎng)15分到1小時(shí)。接著，輕輕地用培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)物，去除未粘附的細(xì)胞。為進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和功能測(cè)定，在操作開始前，將微滴定板中的細(xì)胞培養(yǎng)12-24小時(shí)。為進(jìn)行細(xì)胞分離研究，用胰蛋白酶/EDTA溶液(GIBCO)處理5分鐘，或者，簡(jiǎn)單地用磷酸鹽緩沖液(PBS)劇烈沖洗，使粘附到基質(zhì)上的細(xì)胞懸浮。接著，將洗液中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)6孔組織培養(yǎng)板上，置于CO2培養(yǎng)箱中，在37C下培養(yǎng)12小時(shí)到24天。
需注意的是，如果患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)很高，即患者患淋巴癌或白血病，應(yīng)用完全培養(yǎng)液稀釋單核細(xì)胞至6孔組織培養(yǎng)板中每孔中有1-2百萬個(gè)細(xì)胞。癌細(xì)胞的回收取決于基質(zhì)上的細(xì)胞濃度(見下)。用臺(tái)盼藍(lán)排除法或凋亡試驗(yàn)來評(píng)估細(xì)胞活性。
另外，也可使全血通過包被有一層細(xì)胞粘附基質(zhì)(如I型膠原或純棉過濾器)的細(xì)胞培養(yǎng)珠，而直接除去全血中的活行和侵襲性癌細(xì)胞。具體地說，用充填了純棉或膠原包裹珠的一根30毫升消過毒的移液管，每10毫升的血液用0.1毫升膠原包被珠。血液應(yīng)用等體積的含0.5毫摩爾的EDTA培養(yǎng)液預(yù)先稀釋或用含50單位/ml肝素的10％檸檬酸鹽右旋糖抗凝劑(ACD，Bakter Healthcare Corporation，IL)預(yù)先稀釋。
用含10％人血漿或血清的培養(yǎng)液預(yù)先洗柱。
流速為每分鐘0.1到0.7毫升，捕獲的細(xì)胞同上述底層法所得的細(xì)胞具有共同特征。
6.1.4標(biāo)記膠原基質(zhì)和測(cè)量細(xì)胞侵襲表型在使用生物素、熒光素或羅丹明標(biāo)記之前，將膠原聚合，這樣聚合部位不會(huì)受干擾。將標(biāo)記了的膠原纖維溶于酸化水中(pH2.0)，但在實(shí)驗(yàn)室條件下又會(huì)很容易聚合成以前的膠原纖維。具體地說，將10毫升I型膠原溶液(大鼠尾I型膠原，4.0mg/ml，合作生物制品，Becton和Dickinson Labware，Bedford，MA)與10毫升DMEM混合，4℃加到10厘米的組織培養(yǎng)皿中，37℃下孵育30分鐘，以促進(jìn)膠原纖維聚合(膠凝)。
用30毫升pH9.3(Sigma)的雙份硼酸緩沖液沖洗凝膠30分鐘，然后在25℃與30毫升含有3毫克硫-NSH-生物素(Pierce)，鹽酸異硫氰酸熒光素(FITC)，四甲基羅丹明，異硫氰酸鹽(TRITC)(Research Organics Inc，Cleveland，OH)或者含有1毫克Bodipy-羅丹明或熒光素染料(分子探索Inc.，)的硼酸緩沖液，在震蕩器上進(jìn)行孵育。用PBS洗滌3次以終止交連，接著用50毫升PBS洗滌2天，再用50毫升蒸餾水洗滌兩天。用酸化水(0.02當(dāng)量醋酸)溶解標(biāo)記了的膠原纖維，至最終濃度1毫克/毫升。接著，將標(biāo)記了的膠原單體與等量未標(biāo)記的膠原溶液混合，并用2倍體積的DMEM稀釋，再將其覆蓋在管表面以形成很薄的一層，最后，在37℃下孵育30分鐘以形成凝膠。
用標(biāo)記了的膠原基質(zhì)包被16孔微量滴定板載玻璃片(在96-孔微量滴定板格里；Lab-Tek，Rochester，NY)，或包被6孔組織培養(yǎng)皿(NUNC)。將一部分單核細(xì)胞，即96孔微量滴定板中每孔0.1毫升，或6孔組織培養(yǎng)皿(NUNC)中每孔1.6毫升，接種在該底層上，并培養(yǎng)15分鐘到1小時(shí)，以捕獲粘附細(xì)胞。在洗去未粘附細(xì)胞后，使細(xì)胞在標(biāo)記了的基質(zhì)上生長(zhǎng)12到24小時(shí)，然后用Nikon Eclipse E300倒置光學(xué)顯微鏡以及SONY DC5000貓眼成像系統(tǒng)，或用分子儀器fMax熒光素微板閱讀器和如圖1A，1B.所述的SOFTmaxPRO 1.2F for Windows軟件電腦分析測(cè)定細(xì)胞的侵襲性。在16孔培養(yǎng)箱中制備如上所述的Bodipy-熒光膠原底層，使細(xì)胞培養(yǎng)和顯微鏡成像分析達(dá)到最佳狀態(tài)，以便分析和確定基質(zhì)分離的細(xì)胞的特性(圖1A)。優(yōu)化96-孔微量滴定板的底物制備。最佳參數(shù)包括可實(shí)行的標(biāo)本吞吐量，以及精確定量的分辨率。
6.1.5其他的細(xì)胞功能測(cè)定按照操作手冊(cè)(L-3485，分子探索，OR，美國(guó))。用乙酰低密度脂蛋白(acLDL)Bodipy FL偶合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活性進(jìn)行功能測(cè)定。為了分辨基質(zhì)上同時(shí)分離的血細(xì)胞是凋亡還是壞死，固定之前應(yīng)用Vybrant凋亡試驗(yàn)試劑盒#5Hoechst/prodidium iodide(V-13244，分子探索，OR，美國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。
6.1.6細(xì)胞系和培養(yǎng)從American Type Culture Collection(Rockville，MD)獲得人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436和Hs578T，從挪威奧斯陸Norwegian Radium醫(yī)院癌癥研究所的，Oystein Fodstad教授獲得人無黑素性黑素瘤細(xì)胞系LOX。將細(xì)胞置于1∶1的Dulbecco＇s modified Eagle＇s培養(yǎng)液和RPMI1640的混合液中進(jìn)行培養(yǎng)，并添加10％牛血清，15％Nu-血清，2毫摩L-谷氨酰胺，0.1毫摩非必需氨基酸，1毫摩丙酮酸鈉，1單位/毫升青霉素和10皮克/毫升鏈霉素。用這些細(xì)胞來評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)試劑和判斷功能試驗(yàn)的靈敏度。
6.1.7免疫細(xì)胞化學(xué)的溶液標(biāo)本的制備用標(biāo)記了的膠原基質(zhì)包被16孔培養(yǎng)室載玻片，并在37℃于CO2培養(yǎng)箱中在相同底層上培養(yǎng)12-24小時(shí)，使癌癥患者血液的單核細(xì)胞被膠原基質(zhì)捕獲。為了計(jì)數(shù)血液中轉(zhuǎn)化的上皮細(xì)胞，并與白細(xì)胞和外周血液組織細(xì)胞進(jìn)行比較，將單核細(xì)胞固定，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。用于該研究的第一單抗包括如下小鼠單克隆殼體，它能識(shí)別人上皮特異抗原(ESA；clone W-1D9，NeoMarkers，CA，USA；SIGMA，MS，USA)，Muc-1上皮膜糖蛋白(Muc-1；clone E29，NeoMarkers，CA，USA)，細(xì)胞角蛋白4，5，6，8，10，13，和18(PCK；clone C-11，SIGMA，MS，USA)；CD31/PECAM-1內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志(CD31；Clone JC/70A，NeoMarkers，CA，USA)，F(xiàn)lk-1，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(Flk-1，Clone sc-6251，Santa Cruz，USA)，VE-cadherin內(nèi)皮標(biāo)志(VE-cad；Clone sc 9989，Santa Cruz，USA)，CD34外周血液干細(xì)胞標(biāo)志物(CD34；clone 581，Pharmingen，USA)，CD45白細(xì)胞共同抗原(CD45；clone T29/33，DAKO，Denmark)，CD8；抑制性T細(xì)胞標(biāo)志(CD8；clone c8/144B，NeoMarkers，CA，USA)，CD43 T細(xì)胞標(biāo)志(CD43；clone 84-3C1，NeoMarkers，CA，USA)，前列腺特異性酸性磷酸酶(PSAP；clone PASE/4LJ，NeoMarkers，CA，USA)，前列腺特異性抗原(PSA；cloneER-PR8，NeoMarkers，CA，USA)，c-erbB-2/Her-2/neu腫瘤蛋白(erB-2；clone e2-4001+3B5，NeoMarkers，CA，USA)，c-erbB-2(Clone TAB250，Zymed，CA，USA)，CA19-9/sialyl Lewis GI腫瘤標(biāo)志(CA19-9；clone 121 SLE，NeoMarkers，CA，USA)，p53腫瘤抑制蛋白(p53；clone DO-7+BP53-12，NeoMarkers，CA，USA)。此外，除了上述的抗其他細(xì)胞標(biāo)志的第一抗體外，還采用熒光素偶聯(lián)的抗Muc-1上皮細(xì)胞標(biāo)志(DAKO，Denmark)的抗體和抗因子VIII內(nèi)皮標(biāo)志(F8；Atlantic)的羊抗體熒光素偶聯(lián)物，分別進(jìn)行癌瘤和內(nèi)皮細(xì)胞的雙重染色。而且，也使用本實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的大鼠單克隆抗體D28(抗seprase)，E19，E26(抗DPPIV)和C27(抗β1整合素)。
抗體染色包括，在用2％BSA封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)30分鐘后，加入第一抗體和/或熒光素-F8或熒光素-Muc-1到載玻片上。然后，室溫下培養(yǎng)標(biāo)本20分鐘，以PBS洗滌兩次，每次5分鐘，然后第二抗體兔抗小鼠免疫球蛋白20分鐘。再洗滌兩次，然后將標(biāo)本和堿性磷酸酶-抗-堿性磷酸酶(APAAP)小鼠免疫球蛋白復(fù)合物一起孵育15分鐘。最后，加入酶底物[NewFuchsin(Dako)]，生成紅色沉淀。用Nikon Eclipse E300倒置光學(xué)顯微鏡和SONY DC5000貓眼成像系統(tǒng)記錄數(shù)據(jù)，并將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在電腦服務(wù)器上，以供以后參考。
6.1.8用于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的標(biāo)本的制備通過包被6孔組織板上的膠原基質(zhì)捕獲了血液中的轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞，未來計(jì)數(shù)，按照制造商的操作說明，用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析基質(zhì)底層釋放的單核細(xì)胞。該程序類似于免疫細(xì)胞化學(xué)程序，固定前用Vybrant凋亡檢測(cè)試劑盒#5Hoechst/prodidium iodide(V-13244，Molecular Probes，OR，USA)染色，判斷細(xì)胞凋亡還是壞死。簡(jiǎn)言之，用含有熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗細(xì)胞角蛋白4，5，6，8，10，13，18(PCK；Sigma)的小鼠單克隆抗體或抗Muc-1(DAKO)熒光殼體，藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗-CD31內(nèi)皮標(biāo)志(CD31；Becton-Dickinson)，以及peridinin葉綠素蛋白(PerCP)-標(biāo)記的抗-CD45(CD31；Becton-Dickinson)的溶液染色單核細(xì)胞15分鐘。在孵育和洗滌后，將集得的細(xì)胞重懸于0.5毫升中，在FACScan或FACSVantage流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Becton Dickinson)上對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分析。
6.2結(jié)論6.2.1使用細(xì)胞粘附基質(zhì)分離癌細(xì)胞血源性細(xì)胞粘附分子的作用表I顯示當(dāng)人血漿中的纖連蛋白、層粘連蛋白和玻連蛋白以及人和牛血清存在時(shí)，從一名頭頸癌患者分離的LOX人惡性黑素瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞能粘附于各種不同的天然纖維表面。在包被了不同量的純化血漿蛋白質(zhì)(0.1～1μg每孔)或者是10％血清的96孔板(Nunc公司，Naperville，IL)上分析人癌細(xì)胞的粘附，操作如前所述(Nomizu等，1995)。通過計(jì)算一個(gè)微量滴定孔1.27mm2面積內(nèi)保持粘附區(qū)域中的細(xì)胞數(shù)量來確定天然纖維的細(xì)胞粘附性。在人或者牛血清或纖連蛋白+層粘連蛋白+玻連蛋白存在時(shí)，LOX黑素瘤細(xì)胞在純化后膠原、纖維蛋白和棉纖維以及劃線的塑料表面上粘附力比在平坦的塑料表面上更強(qiáng)，并有更多的保持粘附細(xì)胞。(表1)類似地，與在平坦的塑料表面上相比，頭頸癌細(xì)胞在劃線塑料表面上以及凈化膠原、纖維蛋白和棉纖維上的粘附更強(qiáng)，并且保持粘附的細(xì)胞更多(表2)。這些結(jié)果提示，細(xì)胞粘附基質(zhì)表面通過其對(duì)血源行粘附分子的結(jié)合親合力發(fā)揮了其對(duì)癌細(xì)胞的粘附作用。
表1.LOX黑素瘤細(xì)胞對(duì)不同細(xì)胞粘附基質(zhì)表面的粘附主要是通過基質(zhì)與血源性細(xì)胞粘附分子的相結(jié)合而介導(dǎo)的。
4×103/孔的細(xì)胞(計(jì)算一個(gè)1.27mm2面積的微量滴定孔上保持粘附區(qū)域內(nèi)細(xì)胞數(shù))接種在96孔-板(Nunc公司，Naperville，IL)中的各種基質(zhì)表面上，該96孔-板用10％人類血清(Sigma)，10％牛血清(協(xié)作調(diào)查公司，貝德福德，MA)或10μg/ml人血漿纖連蛋白+層粘連蛋白+玻連蛋白(FN+LM+VN；Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)包被。沒有被蛋白質(zhì)覆蓋的孔用作陰性對(duì)照。根據(jù)下面描述的程序，在微量滴定孔的底部形成I型膠原纖維。
纖維蛋白纖維是通過在微量滴定孔中以Dulbecco＇s modified Eagle＇s培養(yǎng)液中配制的20％人血漿凝結(jié)而成。將純化的棉纖維懸浮于Dulbecco＇s modified Eagle＇s培養(yǎng)液中，接種到微量滴定孔中培養(yǎng)?！皠澗€的塑料表面”表示微量滴定孔的表面用一個(gè)Eppendorf移液管尖端刮擦過。每個(gè)數(shù)值代表三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
表2.頭頸癌細(xì)胞對(duì)不同細(xì)胞粘附基質(zhì)表面的粘附，主要是通過基質(zhì)與血源性細(xì)胞粘附分子的結(jié)合而介導(dǎo)的。
2×103/孔的細(xì)胞(計(jì)算一個(gè)1.27mm2面積的微量滴定孔上保持粘附區(qū)域內(nèi)細(xì)胞數(shù))接種在96孔-板(Nunc公司，Naperville，IL)中各種的基質(zhì)表面上，該96孔-板用10％人類血清(Sigma)，10％牛血清(協(xié)作調(diào)查公司，貝德福德，MA)或10μg/ml人血漿纖連蛋白+層粘連蛋白+玻連蛋白(FN+LM+VN；Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)包被。沒有被蛋白質(zhì)覆蓋的孔則被用作陰性對(duì)照。根據(jù)下面描述的程序，在微量滴定孔的底部形成I型膠原纖維。
纖維蛋白纖維是通過在微量滴定孔中以Dulbecco＇s modified Eagle＇s培養(yǎng)液配制的20％人血漿凝結(jié)而成。純化后的棉纖維也懸浮于Dulbecco＇s modified Eagle＇s培養(yǎng)液中懸浮，并接種得到微量滴定孔中培養(yǎng)?！皠澗€的塑料表面”表示微量滴定孔的表面用Eppendorf移液管尖端刮擦過。每個(gè)數(shù)值代表三次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)。
6.2.2細(xì)胞分離方法的敏感度用人侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436和Hs578T(美國(guó)型培養(yǎng)收藏中心，Rockville，MD)來測(cè)定細(xì)胞分離方法的敏感度，并用來評(píng)估免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑(參照下述內(nèi)容)。將這些乳腺癌細(xì)胞用熒光染料標(biāo)記，用來測(cè)定分離過程的敏感度。圖3A-G顯示正常血液標(biāo)本和膀胱癌血液標(biāo)本的分析，在這些血液標(biāo)本中加入了不同量的用PKH26紅色熒光細(xì)胞Linker(∑)標(biāo)記的Hs578T乳腺癌細(xì)胞。如圖所示，癌細(xì)胞可與其他血細(xì)胞區(qū)分出來。乳腺癌細(xì)胞的回收在以下頻率范圍上是一致的，即介于1和500個(gè)，Hs578T細(xì)胞接種到正常獻(xiàn)血者的1-ml血液中(含1千萬-2千萬個(gè)單核細(xì)胞/ml)中時(shí)，細(xì)胞的回收率在75和100％之間。但是，當(dāng)Hs578T乳腺癌細(xì)胞接種到膀胱癌獻(xiàn)血者的血液(少于1千萬個(gè)單核細(xì)胞/ml)中時(shí)，Hs578T細(xì)胞的回收率則介于95和100％之間，這提示，細(xì)胞密度是細(xì)胞粘附基質(zhì)的一個(gè)抑制因素。此外，將19個(gè)紅色熒光標(biāo)記的Hs578T細(xì)胞接種到膀胱癌獻(xiàn)血者的1-ml血液中時(shí)，用抗-細(xì)胞角蛋白抗體CI1陽性染色鑒定了分離的Hs578T細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞圖3E-3F)。在1ml血液中檢測(cè)到了16個(gè)熒光標(biāo)記的Hs578T細(xì)胞和468個(gè)膀胱癌細(xì)胞。這些結(jié)果提示，基質(zhì)捕獲方法的敏感度水平為每毫升血液1個(gè)活性癌細(xì)胞，而回收率可達(dá)到85％。
6.2.3利用細(xì)胞粘附基質(zhì)進(jìn)行的癌細(xì)胞分離為了檢測(cè)血液中的癌細(xì)胞，將一薄層羅丹明-膠原溶液包被16孔載玻片(Lab-Tek，羅切斯特，NY)或者96孔培養(yǎng)皿(NUNC)，隨意與含有血源性粘附分子的牛血清一起培養(yǎng)，成為“基質(zhì)”的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例。將1.6ml全血白血病層中的單核細(xì)胞(每份0.1ml)接種到16-孔載玻片的每一個(gè)孔中37℃培養(yǎng)10分鐘到18小時(shí)，根據(jù)細(xì)胞對(duì)膠原基質(zhì)的差異粘附選出癌細(xì)胞。
圖4A-D顯示用以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)對(duì)循環(huán)性癌細(xì)胞團(tuán)塊與組織碎片進(jìn)行的分離。這種不同大小的細(xì)胞集落常見于晚期轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血液中，這些疾病包括頭頸鱗狀細(xì)胞癌(圖4A-C)和前列腺癌(Figure 4D)。據(jù)估計(jì)，在第III-IV期癌癥患者的血液中有大量的癌細(xì)胞集落，其數(shù)量為每立方厘米血液幾百個(gè)到兩萬個(gè)。
然而，在正常獻(xiàn)血者和早期癌癥患者的血液中沒有發(fā)現(xiàn)這樣的細(xì)胞集落。而且，纖維蛋白纖維(圖4E)，塑料刮片(圖4F-G)，純化的棉纖維(圖4H-I)，和I型膠原纖維(圖5A-H)捕獲的循環(huán)性癌細(xì)胞能在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并表現(xiàn)出上皮細(xì)胞的形態(tài)。這些材料的表面吸附了血源性細(xì)胞粘附分子，這些分子隨后促進(jìn)了癌細(xì)胞的粘附和擴(kuò)散(見上面表II)。通過包被的膠原基質(zhì)與抗纖連蛋白、玻連蛋白和層粘連蛋白的單克隆抗體一起孵育，進(jìn)一步證明了細(xì)胞粘附分子的作用。這種處理降低了基質(zhì)捕獲細(xì)胞的能力。
圖5A-H顯示當(dāng)血源性粘附分子存在時(shí)，循環(huán)性細(xì)胞和它們下面的以I型膠原為基礎(chǔ)的細(xì)胞粘附基質(zhì)的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。這些癌細(xì)胞在接觸后的10分鐘到60分鐘之內(nèi)優(yōu)先地粘附于膠原性基質(zhì)。然后，降解并攝取基質(zhì)，在平的底層產(chǎn)生空洞，隨后遷移到塑料表面并生長(zhǎng)(圖5A-D；6A-D)。此類癌細(xì)胞在大多數(shù)正常獻(xiàn)血者(圖7A)、良性腫瘤患者(圖7B)，或者正在接受化療的癌癥患者(圖7C-D)的血液中不存在。新鮮分離的循環(huán)性癌細(xì)胞在形狀上比較小，但比基質(zhì)上同時(shí)分離的大部分單核細(xì)胞大(圖6A)。這些推定的癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，在形態(tài)上變得更大，4天培養(yǎng)就具備了上皮形狀(圖5A-D；6A-D)。但是，同時(shí)分離的白細(xì)胞較小，培養(yǎng)基中數(shù)量減少(圖5A-D)。另外，用細(xì)胞粘附基質(zhì)從頭頸鱗狀細(xì)胞癌(SCCHN)活檢組織中(圖5E-F)分離的極少數(shù)癌細(xì)胞表現(xiàn)出侵襲性表型或循環(huán)性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，這說明循環(huán)性癌細(xì)胞代表了轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞群體中的一個(gè)獨(dú)特亞群。在這種SCCHN組織中，它們是能侵入膠原凝膠并在培養(yǎng)基中繁殖的成纖維細(xì)胞(圖5E-F)。需要指出的是，細(xì)胞分離系統(tǒng)捕獲的是那些保持有活力的細(xì)胞，例如，那些保持著粘附力的細(xì)胞，而不是那些在循環(huán)中或是在實(shí)驗(yàn)操作過程中已被破壞的細(xì)胞。
如同光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡測(cè)量(圖5E-H)所確定的那樣，膠原性基質(zhì)的厚度估計(jì)約為100μm。聚集的膠原能夠在10分鐘到1個(gè)小時(shí)內(nèi)捕獲混合細(xì)胞群中的癌細(xì)胞，混合細(xì)胞群指血液或組織活檢產(chǎn)生的細(xì)胞懸液。基質(zhì)捕獲的細(xì)胞在一至兩個(gè)星期的孵育中可以進(jìn)一步侵入基質(zhì)，而在基質(zhì)表面留下一些非侵襲性細(xì)胞，這些細(xì)胞不會(huì)繁殖(圖5E-F)。聚集的膠原纖維是直徑為70nm的精細(xì)的線，與烴的膠原束具有相似的外觀，但是沒有膠原-條帶模式(圖5G-H)。
6.2.4循環(huán)性癌細(xì)胞的功能性和免疫表型特征基質(zhì)捕獲的上皮細(xì)胞的功能和免疫表型特征與那些新生瘤細(xì)胞的特點(diǎn)一致。為了評(píng)估這些細(xì)胞的侵襲性表型特征，用羅丹明-膠原基質(zhì)分析從癌癥患者血液中分離的細(xì)胞，分析這些細(xì)胞的粘附、降解和吸收羅丹明-膠原底層的能力。圖8A-I顯示推定的癌細(xì)胞所表現(xiàn)出的廣泛的膠原-降解/攝取活性(Col+)；這些細(xì)胞也表現(xiàn)出癌細(xì)胞的免疫學(xué)和形態(tài)學(xué)特征(參照下述內(nèi)容)。
為了確定癌細(xì)胞的性質(zhì)，分析了用羅丹明-膠原基質(zhì)從癌癥患者血液中分離的細(xì)胞，使用抗上皮細(xì)胞特異性抗原(ESA)、上皮細(xì)胞膜抗原(Muc-1)和細(xì)胞角蛋白4，5，6，8，10，13，和18(PCK)的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析，推測(cè)這些細(xì)胞的上皮來源。這些ESA+，Muc-1+或PCK+反應(yīng)陽性細(xì)胞是上皮源性細(xì)胞，因而，與它們的轉(zhuǎn)移性相一致。用細(xì)胞型特異性單克隆抗體(例如那些抗上皮細(xì)胞、癌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、外周血干細(xì)胞或者白細(xì)胞的抗體)染色基質(zhì)上的包括富集的癌細(xì)胞在內(nèi)的粘附性細(xì)胞。粘附性細(xì)胞是上皮細(xì)胞標(biāo)志陽性細(xì)胞(圖8E，G，J，K)，而且能夠攝取膠原片段，Col+(圖8B，C，F(xiàn)，I，L)。
循環(huán)性癌細(xì)胞在大多數(shù)正常獻(xiàn)血者的血液中(圖8L)、良性腫瘤患者或者正在接受化療的癌癥患者的血液中很少見。與其他免疫細(xì)胞化學(xué)分析相類似，可取癌癥患者血液中的單核細(xì)胞(從基質(zhì)中釋放出來的)作為熒光-激活的細(xì)胞分選(FACS)的對(duì)象。
6.2.5循環(huán)性癌細(xì)胞獲得內(nèi)皮細(xì)胞表型除了侵襲性以外，在循環(huán)中的轉(zhuǎn)移性癌癥細(xì)胞還具有明顯的新血管生成能力。利用一個(gè)細(xì)胞粘附基質(zhì)從癌癥患者的血液中分離出來的循環(huán)性癌細(xì)胞必然獲得內(nèi)皮細(xì)胞的特征。這些頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HN，圖9A-C；9I-J)，結(jié)腸癌(CC，圖9D-E)和前列腺癌(PC，圖9G-H)的細(xì)胞是Col+染色(圖9 C，F(xiàn))，用內(nèi)皮細(xì)胞的表型，包括von Willebrand因子或第VIII因子(F8)(圖9B，E)和CD31(圖9d)陽性，摻入乙?；兔芏戎鞍?LDL)顯示了內(nèi)皮細(xì)胞的能力(圖9H，J)以及上皮細(xì)胞表面抗原(圖9G中的ESA)。此外，當(dāng)分離的癌細(xì)胞被內(nèi)化并被低密度脂蛋白熒光素標(biāo)記，然后接種在厚0.5mm的膠原凝膠上時(shí)，它們顯示出增強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞分化特點(diǎn)，包括形成細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和管狀結(jié)構(gòu)(圖9K，L)。這些結(jié)構(gòu)主要由低密度脂蛋白標(biāo)記的癌細(xì)胞組成。此外，循環(huán)性癌細(xì)胞還表現(xiàn)出其它內(nèi)皮細(xì)胞特點(diǎn)，包括表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子Flk-1和VE-鈣粘連蛋白的受體，并且不丟失以前所表達(dá)的上皮細(xì)胞標(biāo)志。這種血管生成能力僅僅限于那些進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞，而不出現(xiàn)于留在腫瘤組織中的細(xì)胞。這種血管生成表型的空間限制反映了循環(huán)性癌細(xì)胞所特有的功能性能力向外滲透、侵襲定居與血管生成合作，從而導(dǎo)致微小轉(zhuǎn)移灶的形成。
6.2.6循環(huán)性癌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)受到免疫免疫力殺傷和生長(zhǎng)循環(huán)性癌細(xì)胞與表達(dá)白細(xì)胞共同抗原CD45和T-細(xì)胞標(biāo)志CD8的白細(xì)胞(WBC)可形成集落。細(xì)胞粘附基質(zhì)能夠很容易地把表現(xiàn)出良好預(yù)后的癌癥患者的這種免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞的復(fù)合物選出的集落分離出來。盡管循環(huán)性癌細(xì)胞的總數(shù)可能預(yù)示著轉(zhuǎn)移的可能性，但是，(圖10A-1)與細(xì)胞代謝WBC反映的癌細(xì)胞的數(shù)量或者自身免疫性抗癌抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體溶細(xì)胞作用(圖10J-L)表明宿主具有抗轉(zhuǎn)移免疫力。在這些表現(xiàn)出良好預(yù)后的癌癥患者中，大多數(shù)癌細(xì)胞受到白細(xì)胞的攻擊，培養(yǎng)一天后變成了碎片，只有少數(shù)癌細(xì)胞集落生長(zhǎng)(圖10F-1)。此外，抗癌抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體溶細(xì)胞作用可發(fā)生于大部分癌癥患者體內(nèi)。對(duì)癌細(xì)胞的這種殺傷在這里是通過以10％的自身血漿培養(yǎng)同一癌癥患者血液分離的BLC細(xì)胞來證明的(圖10J-K)，但正常獻(xiàn)血者血漿中則不行(圖10L)。癌細(xì)胞是否發(fā)生溶細(xì)胞可通過裂解細(xì)胞中黑暗相物質(zhì)的形態(tài)來確定(圖10J-L)。
重要的是，大約97％的從血液中新鮮分離出的細(xì)胞是凋亡細(xì)胞，這可用Molecular Probe Inc.的凋亡和細(xì)胞溶解測(cè)定試劑盒作熒光染色來確定。雖然有些癌細(xì)胞可以在培養(yǎng)基中繁殖兩個(gè)月，但是大多數(shù)癌細(xì)胞在分離后立刻表現(xiàn)為凋亡或者溶胞，這意味著癌細(xì)胞被宿主的免疫力所殺滅。大部分白細(xì)胞在一個(gè)星期以后從培養(yǎng)基中消失，留下癌細(xì)胞的集落或群落(圖10F-L)。這樣，能抵抗免疫殺傷力的活性和侵襲性癌細(xì)胞的數(shù)量就成為高度轉(zhuǎn)移性患者最有力的指標(biāo)。
6.2.7循環(huán)性癌細(xì)胞的計(jì)數(shù)如上所述，分析了使用細(xì)胞分離方法而分離的循環(huán)性癌細(xì)胞的侵襲性、上皮特性、血管生成特性和對(duì)宿主免疫力的抗性。結(jié)果使用帶有索尼DKC5000的3CCD圖象處理系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)化Nikon倒置顯微鏡來記錄。用這種細(xì)胞分離法和本發(fā)明試驗(yàn)方法計(jì)數(shù)全血或白細(xì)胞層中的癌細(xì)胞數(shù)目提供了最高的敏感度和分辨率。檢測(cè)了200多名前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、頭頸癌、腦癌、膀胱癌、淋巴瘤、腎和睪丸癌、肝癌或胰腺癌以及其他胃腸道癌癥患者的樣品。明確為Col+，LDL+，ESA+，Muc-1+，PCK+，F(xiàn)8+，或CD31+的循環(huán)性癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移性癌癥患者全血中為每毫升兩千到兩萬。通過這項(xiàng)研究，估計(jì)在可能發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌癥患者的循環(huán)系統(tǒng)中有大約8個(gè)到8千萬個(gè)的活性癌細(xì)胞。分辨率比以前基于抗體的方法高出100倍以上(Racila，E.，Euhus，D.，Weiss，A.J.，Rao，C.，McConne11，J.，Terstappen，L.W.，和Uhr，J.W.1998，血液中癌細(xì)胞的檢測(cè)和特性分析，1995年美國(guó)國(guó)家科學(xué)院論文匯編，4589-4594)。然而，從這項(xiàng)研究所估計(jì)的轉(zhuǎn)移細(xì)胞的數(shù)量?jī)H僅代表早期調(diào)查所報(bào)道的循環(huán)性癌細(xì)胞總數(shù)的0.1％.(Glaves et al.，1988，Br.J.癌癥5732-35)。
7.實(shí)施例膠原基質(zhì)上成纖維細(xì)胞遷移規(guī)律依賴于新的細(xì)胞表面蛋白酶復(fù)合物以下信息表明，遷移性成纖維細(xì)胞的侵入性偽足上形成的新的蛋白酶復(fù)合物(包含絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶(SIMP)，包括seprase，二肽基肽酶IV(DPPIV))與膠原基質(zhì)中的細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)。
7.1材料和方法7.1.1細(xì)胞培養(yǎng)人胚肺成纖維細(xì)胞系WI38和人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)獲得。細(xì)胞培養(yǎng)在1∶1混合的DMEM和RPMI1640中，其中還補(bǔ)充了10％小牛血清，5％Nu血清(Collaborative Research Inc.，Bedford，MA)，2mM L-谷氨酰胺，1單位/毫升青霉素，10μg/ml鏈霉素，0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸鈉。大鼠單克隆抗體E26，E19和F4針對(duì)人胎盤DPPIV，大鼠單克隆抗體D8和D28針對(duì)人胎盤seprase(Goldstein LA et al.，1997，Biochim.Biophys.Acta.136111-19；Pinereiro-Sanchez，ML et al.，1997，JBiol.Chem.2727595-7601；correction(1998)JBiol.Chem.27213366)，單克隆抗體C27針對(duì)人黑色素瘤β1整聯(lián)蛋白，大鼠單克隆抗體C37針對(duì)細(xì)胞表面糖蛋白gp-90(Meuller，SC.，et al.，1999，J.Biol.Chem.27424947-24952)。小鼠抗av整聯(lián)蛋白和抗β3整聯(lián)蛋白單克隆抗體由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(L230克隆，編號(hào)HB8448；AP-3克隆，編號(hào)HB242)獲得。
7.1.2 SEPRASE-DPPIV復(fù)合物的分離將W138細(xì)胞接種于含水的I型膠原膜上(大鼠尾部注射0.2mg/ml的I型膠原，Collaborative Biomedical Products，Becton和Dickinson Labware，Bedford，MA)培養(yǎng)至90％鋪滿培養(yǎng)基。依照說明書用Suffo-NSH-生物素(Pierce，Rockford，IL)進(jìn)行W138單層細(xì)胞的表面生物素化。為收集裂解液，每一細(xì)胞培養(yǎng)板用PBS洗3次，并用125 1/cm2的RIPA溶液(pH7.5的50mM Tris緩沖液配制的1.25％的乙基苯基聚乙二醇P-40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS)提取。提取物在25℃以25rpm在旋轉(zhuǎn)振蕩器(Bellco Orbital Shaker，Vineland，NJ)上振蕩2h。取出細(xì)胞層和緩沖液，轉(zhuǎn)移至一50ml錐形管中，在4℃下進(jìn)一步振蕩孵育3h。以10,000xg的速度4℃離心20min以澄清該抽提物，用上清液進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。
為了制備免疫親和基質(zhì)，將純化的大鼠抗膜蛋白單克隆抗體(2.5mg)與1-mlCNBr-瓊脂糖凝膠4MB(Pharmacal Biotech Inc.，Piscataway，NJ)交連。用0.25-ml單克隆抗體珠免疫沉淀復(fù)合物，此復(fù)合物由25-ml細(xì)胞提取物4℃振蕩培養(yǎng)過夜得到。
用25ml抽提緩沖液洗滌3次后，將載體抗原抗體偶聯(lián)復(fù)合物的微珠重懸于0.1％甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.4)中(緩沖液體積與微珠體積相同)，樣品在4℃培養(yǎng)5min。然后，即刻將樣品轉(zhuǎn)移至Amicon過濾器中(0.45m 400l容量)，在4℃下以10,000rpm的速度在小離心管中離心10min。加入2M Trizma堿中和微珠過濾物。為了測(cè)定分離的蛋白復(fù)合物的亞單位組成，通過SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用HPR-鏈霉親和素(Sigma，St.Louis，MO)和ECL系統(tǒng)(Amersham，St.Louis，MO)分析和檢測(cè)表面生物素化復(fù)合物的免疫沉淀物。分離的蛋白復(fù)合物也可用于免疫印跡分析(使用抗seprase，-DPPI\I，β1和β3整聯(lián)蛋白單克隆抗體)，明膠酶譜分析(檢測(cè)seprase明膠酶活性)和DPPIV底物膜覆蓋分析(Pinereiro-Sanchez，ML et al.，1997，J.Biol.Chem.2727595-7601；correction(1998)J.Biol.Chem.27213366)。為了檢測(cè)蛋白是否完全從微珠上洗脫下來，可加入Laemmli樣品緩沖液(與微珠體積相同)，然后將樣品在微波爐中加熱(低火加熱2個(gè)循環(huán)，每次30秒，再用中火加熱1個(gè)循環(huán)，30秒)。然后，即刻將樣品在4℃下離心。濾出液進(jìn)行上述試驗(yàn)。
7.1.3膠原纖維的標(biāo)記在生物素，熒光素或羅丹明標(biāo)記之前聚合膠原，可以不致破壞聚合位點(diǎn)。然后將標(biāo)記的膠原纖維溶解于酸化的水中(pH2.0)，但是在實(shí)驗(yàn)條件下可能很容易聚合回復(fù)至膠原纖維。具體地說，在4℃下，將10ml I型膠原溶液(大鼠尾部I型膠原，4.66mg/ml，Collaborative Biomedical Products，Becton和DickinsonLabware，Bedford，MA)與10ml DMEM混合?；旌衔镌?7℃下孵育30min，以使膠原纖維聚合(凝膠)。用30ml pH值為9.3的交聯(lián)硼酸鹽緩沖液(Sigma)洗滌凝膠30min，然后在振蕩器上，在含有3mg Sulfo-NSH-生物素(Pierce)，熒光素異硫氰酸鹽I鹽酸(FITC)或四甲基羅丹明異硫氰酸鹽(TRITC)(Research OrganicsInc，Cleveland，OH)的30ml硼酸鹽緩沖液中25℃振蕩孵育。用PBS洗滌3次以終止偶聯(lián)反應(yīng)，然后用50ml PBS洗滌2天，再用50ml蒸餾水洗滌2天。將標(biāo)記的膠原纖維溶解于酸化的水中(0.02N乙酸)至終濃度1mg/ml。將標(biāo)記的膠原單體與等體積的DMEM或p緩沖液(300mM NaCl溶于50mM碳酸氫胺緩沖液中，pH8.4)混合，在37℃下孵育30分鐘以使凝膠形成。
7.1.4細(xì)胞遷移和熒光膠原降解試驗(yàn)熒光膠原纖維覆蓋的單層創(chuàng)傷培養(yǎng)物可用于檢驗(yàn)創(chuàng)傷愈合過程中細(xì)胞在膠原凝膠中的遷移。將WI38細(xì)胞培養(yǎng)在2孔蓋玻片上(Lab-Tek，Rochester，NY)，至細(xì)胞鋪滿。用一移液頭尖端刮擦細(xì)胞單層，以形成創(chuàng)傷邊緣。
然后用DMEM配制的TRITC-膠原替代細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)(600μg/ml；50μl/孔)，37℃下在CO2培養(yǎng)箱中孵育30min以使培養(yǎng)物形成凝膠。
然后加入含有血清或抑制性單克隆抗體的培養(yǎng)基(300μl/孔)，可使用相差顯微鏡和熒光顯微鏡(Nikon倒置顯微鏡)實(shí)時(shí)觀察培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞遷移和膠原降解的影響?？赏ㄟ^測(cè)量細(xì)胞遷移的面積和遷移性細(xì)胞清除的熒光膠原面積對(duì)細(xì)胞遷移和膠原降解作定量檢測(cè)(可采用NIH成像1.62b4/脂肪分析程序)。
發(fā)展了上析試驗(yàn)的微量滴定方法來測(cè)量遷移性細(xì)胞引起的膠原降解。在96孔組織培養(yǎng)板中(Nunc，Rochester，NY)，先加入50μl/孔TRITC膠原溶液(600μg/ml)，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min使溶液膠凝。然后將含有2×105細(xì)胞和單克隆抗體(50μg/ml)的TRITC膠原溶液每孔50μl加到TRITC膠原凝膠上，37℃時(shí)于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min使培養(yǎng)物膠凝。然后用每孔補(bǔ)充150μl新鮮培養(yǎng)基。所有的培養(yǎng)基都需不含酚紅。間或從每孔中取出100μl培養(yǎng)物用熒光微板讀數(shù)儀測(cè)量TRITC-膠原肽的釋放，544nm處激發(fā)，590nm處發(fā)射(MolecularDevices fMax熒光微板讀數(shù)儀)。加入亮氨酸以測(cè)定培養(yǎng)條件下細(xì)胞的代謝活性，其中含有2Ci/ml3H-亮氨酸的培養(yǎng)基150μl/孔地加入培養(yǎng)物中，再將細(xì)胞-膠原層溶解于5ml閃爍液體中，在閃爍計(jì)數(shù)器中記數(shù)(Beckman LS-7500)。獲得了組成型表達(dá)seprase和DPPIV的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-436穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體。依照說明書用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco/BRL)，將質(zhì)粒pAI 1(單獨(dú)pCR3.1載體)，pA15(載體加全長(zhǎng)seprase)和pZ8(DPPIV核酶構(gòu)建物)轉(zhuǎn)染入MDA-MB-436細(xì)胞系。選擇培養(yǎng)基包含G418，濃度為300μg/ml。
7.1.5SEPRASE和DPPIV的免疫熒光標(biāo)記將WI38細(xì)胞在膠原凝膠中培養(yǎng)，使用羅丹明偶聯(lián)的抗seprase單克隆抗體D28和熒光素偶聯(lián)的抗DPPIV單克隆抗體E26(Meuller，SC，et al.，1999，J.Biol.Chem.27424947-24952)，在一步中固定和免疫標(biāo)記W138細(xì)胞。在Zeiss光顯微鏡III(Carl Zeiss公司)上落射熒光顯下給染色的樣品拍照，所用物鏡為Planapo 25/1.2或63/1.4。
7.1.6人牙齦損傷和侵襲性人乳腺癌人牙齦活檢材料來自于芬蘭Turku大學(xué)。全層厚度口腔粘膜損傷來自于兩位健康志愿者，活檢材料收集于損傷后第3，7，14和28天?；顧z之后，即刻將新鮮組織塊包埋于Histoprep中(Fisher Scince，新澤西州)，并于液氮中迅速冷凍。制作冰凍切片(6μm)，-20℃丙酮固定5min，并保存于-70℃。如進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)檢查，將切片用蘇木素和伊紅染色。如進(jìn)行免疫組化染色，將切片用含有0.1％牛血清白蛋白(BSA；Sigma化學(xué)公司，St.Louis，M.O.)的PBS洗滌，潮濕柜中，與羅丹明偶聯(lián)的抗seprase的單克隆抗體D28于4℃共同孵育16h。然后用PBS/BSA和水洗滌切片，空氣干燥，使用氰基丙烯酸鹽粘合劑(Krazy Glue，Borden有限公司)封固切片。
使用Zeiss Axioskop 20亮度，熒光和共焦顯微鏡檢查染色情況，使用MC 80Zeiss顯微照相機(jī)拍照。
用羅丹明偶聯(lián)的第二抗體進(jìn)行對(duì)照染色，未顯示出特異性的染色。如上所述(Kelly T et al.，1998，Mod.Pathol.11855-863)，進(jìn)行侵襲性人乳腺癌的免疫組化染色。
7.2結(jié)果顯示的數(shù)據(jù)表明，與LOX人惡性黑色素瘤細(xì)胞(Pineiro-Snachez ML，1997，J.Biol.Chem.2727595-7601)中的seprase類似，在WI38人胚胎成纖維細(xì)胞中的絕大多數(shù)的seprase和DPPIV在非離子型去污劑中以400kDa以上的復(fù)合物形式存在，去污劑例如Triton(辛基苯氧基聚乙氧乙醇)X-100，Triton X-114，含有0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)的RIPA緩沖液，辛基葡糖苷，以及WGA瓊脂糖親和純化的物質(zhì)。在交聯(lián)葡聚糖Sephacryl S-200凝膠過濾層析時(shí)洗脫的400kDa以上復(fù)合物位于外水體積組分中。分離WGA純化的物質(zhì)后，進(jìn)行Superose 12凝膠過濾液相層析，顯示出大約200kDa(片斷17)，440kDa(片斷14)和670kDa(片斷13)(圖11A)為主要形式。由于seprase包括一個(gè)97kDa的亞單位和DPPIV的110kDa的單體，而且seprase和DPPIV在非離子型去污劑(10)中都是二聚體，凝膠過濾數(shù)據(jù)顯示seprase-DPPIV復(fù)合物出現(xiàn)在440-670kDa位置(圖11B)。
用單克隆抗體D28(抗seprase)和單克隆抗體E19(抗DPPIV)的免疫沉淀在W138細(xì)胞提取物(已表面生物素化)中鑒定到兩條主要的強(qiáng)度相似的條帶(圖12A)。這兩條條帶，經(jīng)單克隆抗體D28或E19的交叉免疫沉淀，分別表明為seprase和DPPIV的二聚體。當(dāng)樣品溶解于1％的SDS而未沸時(shí)，免疫印跡方法在上述SDS凝膠中鑒定到200kDa處的頂部或較慢的條帶為DPPIV，170kDa處下部或較快的條帶為seprase(圖12B)。在樣品溶解于SDS之后，在SDS凝膠中未檢測(cè)到350-400kDa的異質(zhì)凝聚物(圖12A，12B)，這表明異質(zhì)凝聚物已分離為兩個(gè)穩(wěn)定的二聚體，分別為200kDa的DPPIV和170kDa的seprase。在包括RIPA細(xì)胞提取物的三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，用抗seprase和DPPIV的而不是抗ββ1和β3整聯(lián)蛋白的單克隆抗體檢測(cè)到seprase和DPPIV的穩(wěn)定結(jié)合(圖12A，12B)的抗體來檢測(cè)。此外，這樣的異質(zhì)復(fù)合物可通過免疫法分離的復(fù)合物的蛋白水解活性來驗(yàn)證。用分別識(shí)別seprase或DPPIV的單克隆抗體D28或E19作親和純化從WI38 RIPA提取物中分離得到抗原，分析洗脫物為170kDa(seprase)的明膠酶(圖12C)和200kDa(DPPIV)的脯氨酸-特異性二肽氨基肽酶(圖12D)。明膠酶譜分析在抗seprase單克隆抗體D28的免疫沉淀物中(圖12C，IPseprase)或抗DPPIV單克隆抗體E19的免疫沉淀物中(圖12C，IPDPPIV)檢測(cè)到170kDa的明膠酶活性。分離的DPPIV二聚體沒有明膠酶活性，用DPPIV抗體在明膠酶譜圖中鑒定到170kDa的條帶，表明該復(fù)合物中有seprase存在。相似地，DPPIV底物覆蓋試驗(yàn)檢測(cè)到在抗seprase單克隆抗體D28(圖12D，IPseprase)或抗DPPIV單克隆抗體E19(圖12D，IPDPPIV)的免疫沉淀物中存在200kDa的脯氨酸-特異性二肽氨基肽酶活性。在av，a2，a6或β3整聯(lián)蛋白或?qū)φ彰庖叱恋砦镏?，未觀察到170kDa明膠酶或DPPIV活性。這些結(jié)果也證實(shí)了先前的觀察結(jié)果，即seprase和DPPIV在SDS緩沖液中為均二聚體，它們對(duì)熱(＞60℃)和酸敏感，在敏感條件下可分解為它們的單體亞單位。
所以，蛋白酶復(fù)合物似乎包含等量的seprase和DPPIV蛋白(圖11A，11B，12A，12B)，并且在引發(fā)170kDa明膠酶和200kDa DPPIV二肽氨基肽酶活性方面同樣有效(圖12C，12D)。
為了測(cè)定在膠原凝膠中的細(xì)胞遷移和可能的膠原降解中seprase-DPPIV復(fù)合物的作用，我們將一薄層膠原鋪在單層細(xì)胞創(chuàng)傷模型上進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查和鋪在稀疏培養(yǎng)物上進(jìn)行生化研究(圖13)。細(xì)胞在膠原凝膠中的遷移和細(xì)胞對(duì)局部膠原的攝取可通過成像分析結(jié)合相差及熒光顯微術(shù)，記數(shù)細(xì)胞遷移/膠原消失的區(qū)域面積來測(cè)量(圖13A-13D)。將單克隆抗體E19(抗DPPIV)加入創(chuàng)傷閉合模型中，可阻止細(xì)胞遷移(圖13B，13C)和細(xì)胞引起的局部膠原消失(圖13D)，然而與類型(IgG)匹配的單克隆抗體卻不能引起此種反應(yīng)(圖13B，13C，13D)。隨著加入的單克隆抗體E19的增加，抑制作用也加強(qiáng)(圖13B)，并且這種抗體抑制效應(yīng)可以通過去除E19而逆轉(zhuǎn)，所以，這種單克隆抗體是無毒的(圖13C)。
而且，活化細(xì)胞引起的局部膠原降解，可通過采用熒光分光光度法測(cè)定96孔板稀疏培養(yǎng)物中WI38細(xì)胞從熒光膠原纖維中釋出的熒光肽進(jìn)行定量測(cè)定(圖13E)。已知稀疏培養(yǎng)物中的細(xì)胞是遷移性的，這是由于較少的“接觸性遷移抑制”(Chen，W-T，1979，J.Cell Biol 81684-691)。在4天內(nèi)遷移性WI38細(xì)胞顯示出時(shí)間依賴性的膠原降解，并且單克隆抗體E19(抗DPPIV)抑制遷移性細(xì)胞的膠原降解，然而對(duì)照的單克隆抗體C37(抗gp-90)則不然(圖13E)。這些表明了seprase-DPPIV復(fù)合物在創(chuàng)傷激活的成纖維細(xì)胞引發(fā)的膠原凝膠細(xì)胞遷移和膠原降解中的作用。
由于顯示DPPIV是膠原的一種粘附受體(Bauvois B，1988，Biochem.J.252723-731；Hanski C，1988，Exp.Cell Res.17864-72；Loster K.，1995，Biochem.Biophys.Res.Commun.217341-348)或纖連蛋白的粘附受體(Cheng，HC 1998，J.Biol.Chem.27224207-24215；Johnson RC et al.，1993，J.Cell Biol 1211423-1432；Piazza，GA et al.，1989，Biochem.J.262327-334)，已確認(rèn)單克隆抗體E19(抗DPPIV)對(duì)遷移性細(xì)胞引起的膠原凝膠中的細(xì)胞遷移和膠原降解具有抑制效應(yīng)是由于該抗體對(duì)于粘附活性的影響。圖14表明，在整聯(lián)蛋白粘附和膠原纖維的平行比較中，盡管單克隆抗體E19(抗DPPIV)抑制了遷移性細(xì)胞引起的膠原凝膠中的細(xì)胞遷移和膠原降解，但并不影響WI38細(xì)胞在膠原底層上的擴(kuò)散(圖14A)和在膠原底層上的粘附(圖14B)。然而，單克隆抗體C27(抗β1整聯(lián)蛋白)可抑制W138細(xì)胞在膠原底層上的粘附和擴(kuò)散，但是單克隆抗體E19(抗DPPIV)或單克隆抗體C37(抗gp-90)則不能(圖14A和14B)。這些結(jié)果表明，β1整聯(lián)蛋白也許是W138細(xì)胞上負(fù)責(zé)與seprase-DPPIV復(fù)合物的底物結(jié)合的主要膠原受體。
為了證明seprase和DPPIV與遷移性細(xì)胞的侵入偽足相關(guān)，進(jìn)行了雙標(biāo)記免疫熒光實(shí)驗(yàn)(圖15)。結(jié)果觀察到膠原凝膠中遷移的細(xì)胞的侵入偽足(a)為抗seprase的TRITC-單克隆抗體D28(b)染色陽性，或抗DPPIV的FITC-單克隆抗體E26(c)染色陽性。疊加的影像也表明，seprase和DPPIV共同定位于在膠原凝膠中遷移的WI38成纖維細(xì)胞的侵入偽足中(d)。
為了檢驗(yàn)是否能夠在體內(nèi)找到這樣的seprase和DPPIV共同定位現(xiàn)象，在系列甲醛固定、石臘包埋的人乳腺癌組織切片上進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)(圖16和18)。與侵襲前沿的癌細(xì)胞相似，人侵襲性乳腺癌中的結(jié)締組織細(xì)胞，與抗seprase單克隆抗體D28或抗DPPIV單克隆抗體E26起強(qiáng)烈反應(yīng)(圖16，箭頭所示)。然而，在遠(yuǎn)處正常組織的結(jié)締組織細(xì)胞中檢測(cè)到這樣的seprase和DPPIV的染色(圖18)。很可能，在對(duì)腫瘤侵襲的反應(yīng)中，seprase-DPPIV的表達(dá)與結(jié)締組織細(xì)胞的激活有關(guān)；而且，seprase和DPPIV不僅共同定位于侵襲性癌細(xì)胞，也共同定位于這些激活的組織細(xì)胞。
與培養(yǎng)基的人臍帶平滑肌細(xì)胞不同(Goldstein LA et al.，1997，Biochim.Biophys.Acta.136111-19)，在人胚胎組織包括胎盤和臍帶中，seprase和DPPIV都優(yōu)先地分布于間葉細(xì)胞中，但不分化為大血管的肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。為了確定在體內(nèi)損傷愈合過程中是否引起基質(zhì)成纖維細(xì)胞中表達(dá)seprase和DPPIV，進(jìn)行了人牙齦粘膜傷口愈合的免疫組化實(shí)驗(yàn)(圖17)。在創(chuàng)傷后3天，在結(jié)締組織細(xì)胞中可觀察到seprase和DPPIV的強(qiáng)烈表達(dá)(b-d，g)。在毗鄰的正常粘膜組織中則未觀察到免疫反應(yīng)。在血纖蛋白凝血區(qū)和上皮組織中未觀察到特異性的反應(yīng)。共焦顯微鏡觀察表明，seprase(d)和DPPIV定位于結(jié)締組織細(xì)胞的突起，這表明體內(nèi)存在侵入性偽足。稍后，創(chuàng)傷后7天，在肉芽組織中只有少量細(xì)胞與抗seprase抗體(f)發(fā)生反應(yīng)，但不與抗DPPIV抗體(h)反應(yīng)。一周后，結(jié)締組織細(xì)胞中的seprase和DDPIV染色消失，創(chuàng)傷后14天或28天的細(xì)胞也不與抗體反應(yīng)。數(shù)據(jù)表明，seprase和DDPIV是成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞的激活酶，它們可能參與細(xì)胞遷移所必需的局部膠原降解過程。
采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究了seprase和DDPIV的細(xì)胞表面聯(lián)系。使用了組成性表達(dá)seprase-DPPIV復(fù)合物的MDA-MB-436乳腺癌細(xì)胞。檢測(cè)了過表達(dá)seprase的細(xì)胞或DPPIV或seprase產(chǎn)物缺陷型細(xì)胞的膠原降解和遷移活動(dòng)情況(圖19)。與親本或載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比(圖19A；親本，pAII)，在用編碼seprase的質(zhì)粒pA15轉(zhuǎn)染的MDA-MB-436細(xì)胞中觀察到TRITC-膠原肽釋放的增加(圖19A，pA15)，在經(jīng)編碼DPPIV特異性核酶的構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中觀察到肽釋放的減少(圖19A，pZ8)。而且，seprase的過表達(dá)似乎與DPPIV的輕微減少有關(guān)，用DPPIV核酶轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未產(chǎn)生可檢測(cè)到的DPPIV，并大量減少了seprase(圖19B)。
現(xiàn)在的發(fā)明并不局限于此處所描述的特定的例證范圍之內(nèi)，這些例證只是為了說明發(fā)明的各個(gè)方面，功能上等同的方法和組成部分在發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，發(fā)明的各種修正，以及那些此處表現(xiàn)和描述的內(nèi)容，都將從前述的內(nèi)容和相關(guān)的圖表中給人以啟發(fā)。這樣的修正都將在權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本發(fā)明對(duì)此處引用的各種出版物的全文進(jìn)行了參考。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)受試者體內(nèi)是否存在癌細(xì)胞的方法，包括(1)將取自上述受試者的樣品接種于包被有粘附分子的基質(zhì)上；(2)將樣品孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附在細(xì)胞粘膜基質(zhì)上；(3)檢測(cè)是否有癌細(xì)胞與基質(zhì)結(jié)合，
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品為血液樣品。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品為組織樣品。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基質(zhì)包含天然材料，所述天然材料包括膠原，纖維蛋白和棉纖維。
5.一種檢測(cè)癌癥患者的癌細(xì)胞是否具有轉(zhuǎn)移性的方法，包括(1)將癌癥患者的癌細(xì)胞接種于包被有粘附分子的基質(zhì)上；(2)將癌細(xì)胞孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附，攝取或侵入基質(zhì)；(3)檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附、攝取或侵入；如檢測(cè)到癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)有粘附、攝取或侵入，則表明癌細(xì)胞具有轉(zhuǎn)移性。
6.一種鑒定能抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的藥物的方法，包括(1)將癌細(xì)胞和待測(cè)藥物或和載體對(duì)照與包被有粘附分子的基質(zhì)接觸；(2)將此基質(zhì)孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附和攝取基質(zhì)；(3)檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附和攝??；如果在待測(cè)藥物存在的情況下癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)粘附及攝取的程度低于僅載體存在的情況下，表明該化合物能抑制轉(zhuǎn)移。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述的基質(zhì)熒光標(biāo)記。
8.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中所述的基質(zhì)以放射活性同位素標(biāo)記。
9.抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性的組合物，它是用權(quán)利要求6所述方法鑒定的。
10.抑制患者體內(nèi)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性的方法，包括給予seprase抑制劑。
11.抑制患者體內(nèi)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性的方法，包括給予二肽基肽酶IV抑制劑。
12.鑒定能抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的核酸的方法，包括(1)將核酸分子引入癌細(xì)胞樣品；(2)將所述癌細(xì)胞樣品接種到包被有粘附分子的基質(zhì)上；(3)將此基質(zhì)與癌細(xì)胞孵育足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附和攝取基質(zhì)；(4)檢測(cè)癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附與攝入情況；如果含有該核酸分子的癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)的粘附與攝入程度低于不含該核酸分子的癌細(xì)胞，表明該核酸分子能夠抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的核酸分子是反義分子。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的反義分子是seprase的反義核酸。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的反義分子是一種二肽基肽酶IV的反義核酸。
16.除去癌癥患者樣品中癌細(xì)胞的方法，包括將樣品與包被有粘附分子的基質(zhì)接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附于細(xì)胞粘附基質(zhì)上。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的樣品是腹水，淋巴液，腫瘤或尿液組織樣品。
18.除去患者血液中的癌細(xì)胞的方法，包括將所述血液與包被有粘附分子的基質(zhì)接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附于基質(zhì)上。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中將已除去了癌細(xì)胞的血液樣品重新回輸給患者。
20.除去患者骨髓中癌細(xì)胞的方法，包括將骨髓與包被有細(xì)胞粘附分子的基質(zhì)接觸足夠長(zhǎng)的時(shí)間以讓癌細(xì)胞粘附于細(xì)胞粘附基質(zhì)上。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中將已除去了癌細(xì)胞的骨髓重新回輸給患者。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于檢測(cè)、分離具有轉(zhuǎn)移性的癌細(xì)胞的新方法與新組合物。本發(fā)明還涉及檢測(cè)此類癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性的方法，以及鑒定抗轉(zhuǎn)移活性藥物的篩選方法。本發(fā)明還提供了通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞表面所表達(dá)絲氨酸膜內(nèi)在蛋白酶[SIMP，包括seprase，二肽基肽酶IV(DPPIV)]的活性來抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法及組合物。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1484709SQ01817353
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月9日
發(fā)明者W·T·陳, W T 陳 申請(qǐng)人:紐約州立大學(xué)研究基金會(huì)