專利名稱：紅法夫酵母菌株的復合誘變方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種紅法夫酵母菌株的誘變方法，尤其涉及通過低溫復合誘變獲得紅 法夫酵母誘變高產(chǎn)菌株的方法。
背景技術：
蝦青素(Astaxanthin)為3，3，- 二羥基_4，4，- 二酮基-β，β，胡蘿卜素，是一 種酮式類胡蘿卜素。色澤為艷麗紅色，具有脂溶性。蝦青素具有許多其它的生理功能，如具 有高度猝滅單原子氧和清除自由基的作用；抗氧化作用，其抗脂肪氧化的能力比胡蘿 卜素高10倍，比維生素高100倍，可有效地防止組織。細胞和DNA被氧化損傷，增強免疫功 能，抗癌作用，保護心血管健康等。蝦青素作為功能色素在醫(yī)藥、食品、飼料及化妝品等工業(yè) 中具有廣闊的應用前景，近年來受國內(nèi)外研究人員和各行業(yè)的關注。目前國際市場的價格為每千克2500美元，全球每年有10億以上的市場容量。因 此，加緊蝦青素產(chǎn)品的開發(fā)，特別是天然蝦青素產(chǎn)品的生產(chǎn)，具有很高的市場價值和十分廣 闊的市場前景?，F(xiàn)在，天然蝦青素所占的市場份額很小。就目前的生產(chǎn)和市場情況而言，天 然蝦青素由于產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高而很難與化學合成的蝦青素在價格上進行競爭。但是隨 著生產(chǎn)技術的改進和優(yōu)化以及生產(chǎn)成本的降低及公眾文化素質(zhì)的提高，認可并要求購買含 天然蝦青素的水產(chǎn)品或立法上要求使用天然色素添加劑，天然蝦青素與合成蝦青素相比就 具備了一個特殊的價格優(yōu)勢。紅法夫酵母是研究最多的微生物，其具有作為蝦青素生物來源的一些必要特征 蝦青素是主要的類胡蘿卜素，大約占到40-95%，能夠利用多種糖作為碳源進行異養(yǎng)代謝； 培養(yǎng)時間短；不需要光照；能夠在發(fā)酵罐中實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。因而紅法夫酵母被認為是一 種最具研究價值的蝦青素大規(guī)模生產(chǎn)的來源。紅法夫酵母中蝦青素的含量雖然是甲殼類動物蝦青素含量的5-50倍，但只有雨 生紅球藻中蝦青素含量的-10%，要想利用紅法夫酵母來進行蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)，選 育高產(chǎn)菌株是應用的關鍵。


圖1是本發(fā)明所采用技術方案流程示意圖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在通過復合誘變得到一株遺傳性狀穩(wěn)定的高產(chǎn)蝦青素菌株，為紅 法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的工業(yè)化奠定基礎。為了達到上述目的，本發(fā)明一種紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，包括如下步 驟Si、取紅法夫酵母種子培養(yǎng)液，稀釋后涂平板；S2、一次紫外誘變在黑暗環(huán)境下，用紫外燈照射平板后，在20_25°C下培養(yǎng)4-5 天；
S3、二次紫外誘變篩選色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株，重復涂平板及步驟S2 ；S4、低溫處理篩選色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株，制得種子液，保存于1_5°C環(huán) 境下2-4天；S5、單線態(tài)氧處理將種子液轉移到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，提取菌 株的單細胞狀態(tài)，分別加入濃度為10-15mmol/L的H2O2，振蕩混勻后置于1_5°C環(huán)境中培養(yǎng) 10-18小時；S6、單線態(tài)氧處理后的菌株，經(jīng)洗滌、稀釋后涂平板在20_25°C下培養(yǎng)7_10天。優(yōu)選方式下，本發(fā)明紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，在上述步驟S5中，菌株培 養(yǎng)至對數(shù)期的方法為將菌株從斜面移到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36-60小時，再轉入新鮮液體 培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48小時，至對數(shù)生長中后期。在上述步驟S5中，提取菌株的單細胞狀態(tài)的 方法為用無菌離心管取1毫升菌液，以3500轉/分鐘離心5分鐘收集菌體，用緩沖液洗滌 兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30秒，使菌體散開成為單細胞狀 態(tài)。此外，優(yōu)選方式下，步驟Sl的具體過程為將篩選培養(yǎng)基加熱滅菌后，趁熱倒平 板，15-20ml/板，凝固待用；取紅法夫酵母種子培養(yǎng)液，用滅菌水稀釋IO5-IO7倍，量取稀釋 液涂平板。而制平板的培養(yǎng)基優(yōu)先選用葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麥芽汁3 克，瓊脂20克，水1升；滅菌冷卻至45°C后，加入適量經(jīng)過過濾除菌濃度為50-80 μ mol/L的 二苯胺溶液。優(yōu)選方式下，紫外誘變的具體過程為用15w的紫外燈在距離20cm處照射，照射時 間為10-100秒。此外，本發(fā)明上述步驟S1-S6過程中，選用無菌水進行稀釋；緩沖液優(yōu)先選 用 pH5. 0 的 0. 2mol/L 磷酸。而上述步驟中的篩選方法，包括如下步驟S31、經(jīng)誘變培養(yǎng)完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單菌 落，用接菌環(huán)挑取涂到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)保存；S32、復篩將初篩的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，測定其生物量和色素含量，選取其中色素產(chǎn)量 最高的菌種。本發(fā)明一種篩選紅法夫酵母高產(chǎn)菌株的方法。首先紅法夫酵母菌株兩次紫外誘 變，得到一株五代內(nèi)遺傳性狀穩(wěn)定的突變株，然后又將此突變株低溫處理。經(jīng)低溫處理的突 變株，又經(jīng)過單線態(tài)氧誘變處理，得到一株在10代內(nèi)有良好的遺傳穩(wěn)定性的突變株。將突 變株發(fā)酵培養(yǎng)，測定其生物量和色素含量，均高于原始菌株。本發(fā)明通過低溫復合誘變得到 一株蝦青素產(chǎn)量較高的紅法夫酵母誘變菌株，為下一步紅法夫酵母工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。
具體實施例方式如圖1所示本發(fā)明所采用技術方案采用重復紫外照射與單線態(tài)氧誘變結合的方 式對該酵母進行誘變選育，通過帶有二苯胺的篩選培養(yǎng)基對各突變進行篩選，選取最優(yōu)正 向突變。通過連續(xù)傳代，考察突變株的穩(wěn)定性。并用薄層層析的方法對色素進行純化。實 踐證明紫外誘變、經(jīng)低溫處理后和單線態(tài)氧(過氧化氫)復合誘變處理后，得到突變菌株， 不僅遺傳性狀穩(wěn)定，色素含量和生物量均高于原始菌株。本發(fā)明的具體實施工藝如下一、紫外誘變
將篩選培養(yǎng)基加熱滅菌后，趁熱倒平板，15-20ml/板左右，凝固待用。取種子培養(yǎng) 液，用滅菌水稀釋IO5-IO7倍，準確量取稀釋液0.2ml涂平板。然后用15w的紫外燈在距離 20cm處照射，照射時間為10-100S。將處理后的平板在20_25°C下培養(yǎng)4_5天，這些操作在 黑暗中進行。 其中，篩選培養(yǎng)基的配置最優(yōu)方案為葡萄糖IOg;蛋白胨5g，酵母膏3g，麥芽汁 3g，瓊脂20g，水1L。滅菌冷卻至45°C后，加入適量經(jīng)過過濾除菌的二苯胺溶液，是二苯胺的 終濃度 50-80 μ mo 1/L。上述紫外誘變過程重復操作兩次。此外，上述紫外誘變燈源的選擇根據(jù)需要設定燈的瓦數(shù)、照射距離及時間。本發(fā)明 僅提供一中優(yōu)選方案，其他經(jīng)過兩次紫外誘變的方案均為本發(fā)明的等同方案。同理，篩選培 養(yǎng)基的選擇也根據(jù)需要選擇常規(guī)篩選培養(yǎng)基或特制篩選培養(yǎng)基均可。二、低溫處理將所選突變株的種子液保存于1_5°C環(huán)境下，2-4天。將上述種子液轉移到發(fā)酵培 養(yǎng)基中培養(yǎng)96小時，測色素產(chǎn)量和生物量。三、單線態(tài)氧誘變選取經(jīng)低溫處理的紫外誘變的正突變菌株進行單線態(tài)氧處理。具體方法為將 菌株從斜面移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36-60小時，再轉入新鮮液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48小時到 對數(shù)生長中后期，用無菌離心管取Iml菌液3500r/min離心5min收集菌體，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30s， 使菌體散開而成為單細胞狀態(tài)。再分別加入3% H2O2 (最終濃度為10-15mmol/L)振蕩混勻 后置于4°C冰箱內(nèi)保存10-18小時，離心棄去上清液再用緩沖液洗滌1-2次還原到原體積， 稀釋后涂平板。20-25°C培養(yǎng)7-10天計數(shù)。四、誘變菌株色素分析1、經(jīng)誘變培養(yǎng)完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單菌落， 用接菌環(huán)挑取涂到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)保存。2、復篩將初篩的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，測定其生物量和色素含量，選取其中色素產(chǎn)量最 高的菌種。實施例1A、第一次紫外誘變將篩選培養(yǎng)基加熱滅菌后，趁熱倒平板，15_20ml/板左右，凝 固待用。取種子培養(yǎng)液，用滅菌水稀釋IO5倍，準確量取稀釋液0.2ml涂平板。然后用15w 的紫外燈在距離20cm處照射，照射時間為70S。將處理后的平板在20-25°C下培養(yǎng)4-5天， 這些操作在黑暗中進行。B、選擇這期間所得的深紅色菌株，作為目的菌株，進行培養(yǎng)，測其生物量、色產(chǎn)量 和遺傳穩(wěn)定性。選擇色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株進行第二次紫外誘變。C、將所選突變株的種子液保存于4°C環(huán)境下，3天。D、選取經(jīng)過低溫處理的紫外誘變的正突變菌株進行單線態(tài)氧處理。具體方法為 將次菌株從斜面移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時，再轉入新鮮液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時到 對數(shù)生長中后期，用無菌離心管取Iml菌液3500r/min離心5min收集菌體，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30s，使菌體散開而成為單細胞狀態(tài)。再分別加入3% H2O2(最終濃度為lOmmol/L)振蕩混勻后 置于4°C冰箱內(nèi)保存過夜，離心棄去上清液再用緩沖液洗滌1-2次還原到原體積，稀釋后涂 平板，20-25°C培養(yǎng)7-10天計數(shù)。E、初篩經(jīng)誘變培養(yǎng)完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單 菌落，用接菌環(huán)挑取涂到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)保存。復篩將初篩的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，測定其生 物量和色素含量。經(jīng)過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內(nèi)有 良好的遺傳穩(wěn)定 性的突變株，此突變株的色素產(chǎn)量為5. llmg/L，生物量為10. 7g/L，分別比出發(fā)菌株紅法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 94. 2%和 13. 8% 0實施例2與例1的不同之處在于A、B兩次紫外誘變的時間為80秒；C、將所選突變株的種子液保存于3°C環(huán)境下，3天。D、單線態(tài)氧誘變處理時，H2O2最終濃度為15mmol/L ；其他均與例1相同。經(jīng)過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內(nèi)有良好的遺傳穩(wěn)定 性的突變株，此突變株的色素產(chǎn)量為5. 56mg/L，生物量為12g/L，分別比出發(fā)菌株紅法夫酵 母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 111%和 28% 0實施例3.A、B兩次紫外誘變的時間為75秒；C、將所選突變株的種子液保存于5°C環(huán)境下，4天。D、單線態(tài)氧誘變處理時，H2O2最終濃度為lOmmol/L ；其他均與例1相同。經(jīng)過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內(nèi)有良好的遺傳穩(wěn)定 性的突變株，此突變株的色素產(chǎn)量為5. 47mg/L，生物量為10. 2g/L，分別比出發(fā)菌株紅法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 108%和 8.5%。實施例4.Si、篩選培養(yǎng)基加熱滅菌后，趁熱倒平板，18ml/板，凝固待用；取紅法夫酵母種子 培養(yǎng)液，用滅菌水稀釋IO6倍，量取稀釋液涂平板。在黑暗環(huán)境下，用紫外燈照射平板后，在 23°C下培養(yǎng)4天；S2、篩選色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株，重復涂平板及上述步驟；S3、篩選色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株，制得種子液，保存于4°C環(huán)境下4天；S4、將種子液轉移到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，提取菌株的單細胞狀 態(tài)，分別加入濃度為12mmol/L的H2O2，振蕩混勻后置于4°C環(huán)境中培養(yǎng)12小時；S5、選取經(jīng)低溫處理的紫外誘變的正突變菌株進行單線態(tài)氧處理。具體方法為 將菌株從斜面移到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)55小時，再轉入新鮮液體培養(yǎng)基培養(yǎng)45小時到對 數(shù)生長中后期，用無菌離心管取2ml菌液3000轉/分鐘離心7分鐘收集菌體，用pH5. 0的 0. 2mol/L磷酸緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器上振蕩20-30秒， 使菌體散開而成為單細胞狀態(tài)。再分別加入3% H2O2振蕩混勻后置于1°C冰箱內(nèi)保存11小時，離心棄去上清液再用緩沖液洗滌2次還原到原體積，稀釋后涂平板，20°C培養(yǎng)9天計數(shù)。經(jīng)過兩次紫外誘變、低溫處理和H2O2處理，得到一株在10代內(nèi)有良好的遺傳穩(wěn)定 性的突變株，此突變株的色素產(chǎn)量為5. lmg/L，生物量為10. 9g/L，分別比出發(fā)菌株紅法夫 酵母 AS2. 1557(2. 63mg/L，9. 4g/L)提高了 93. 9%和 20%。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其 發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
一種紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，包括如下步驟S1、取紅法夫酵母種子培養(yǎng)液，稀釋后涂平板；S2、一次紫外誘變在黑暗環(huán)境下，用紫外燈照射平板后，在20-25℃下培養(yǎng)4-5天；S3、二次紫外誘變篩選色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株，重復涂平板及步驟S2；S4、低溫處理篩選色素產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定的菌株，制得種子液，保存于1-5℃環(huán)境下2-4天；S5、單線態(tài)氧處理將所述種子液轉移到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期，提取菌株的單細胞狀態(tài)，分別加入濃度為10-15mmol/L的H2O2，振蕩混勻后置于1-5℃環(huán)境中培養(yǎng)10-18小時；S6、單線態(tài)氧處理后的菌株，經(jīng)洗滌、稀釋后涂平板在20-25℃下培養(yǎng)7-10天。
2.根據(jù)權利要求1所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟S5中，菌株培養(yǎng)至對數(shù)期的方法為將菌株從斜面移到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36-60 小時，再轉入新鮮液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48小時，至對數(shù)生長中后期；步驟S5中，提取菌株的單細胞狀態(tài)的方法為用無菌離心管取1毫升菌液，以3500轉 /分鐘離心5分鐘收集菌體，用緩沖液洗滌兩次，再用緩沖液還原到原體積，在漩渦振蕩器 上振蕩20-30秒，使菌體散開成為單細胞狀態(tài)。
3.根據(jù)權利要求2所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟Sl的具體過程為將篩選培養(yǎng)基加熱滅菌后，趁熱倒平板，15-20ml/板，凝固待 用；取紅法夫酵母種子培養(yǎng)液，用滅菌水稀釋IO5-IO7倍，量取稀釋液涂平板。
4.根據(jù)權利要求3所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟S2的具體過程為用15w的紫外燈在距離20cm處照射，照射時間為10-100秒。
5.根據(jù)權利要求1-4任一所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟 S1-S6過程中，選用無菌水稀釋；緩沖液選用pH5. 0的0. 2mol/L磷酸。
6.根據(jù)權利要求1-4任一所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟 S1-S6中篩選方法包括531、經(jīng)誘變培養(yǎng)完后，用肉眼觀察，在篩選平板中選取菌落較大顏色較紅的單菌落，用 接菌環(huán)挑取涂到斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)保存；532、復篩將初篩的菌種發(fā)酵培養(yǎng)，測定其生物量和色素含量，選取其中色素產(chǎn)量最高 的菌種。
7.根據(jù)權利要求6所述紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，其特征在于，步驟S1-S3平板所用培養(yǎng)基為葡萄糖10克；蛋白胨5克，酵母膏3克，麥芽汁3克，瓊 脂20克，水1升；滅菌冷卻至45°C后，加入適量經(jīng)過過濾除菌濃度為50-80 μ mol/L的二苯 胺溶液。
全文摘要
本發(fā)明一種紅法夫酵母菌株的復合誘變方法，首先紅法夫酵母菌株兩次紫外誘變，得到一株五代內(nèi)遺傳性狀穩(wěn)定的突變株，然后又將此突變株低溫處理。經(jīng)低溫處理的突變株，又經(jīng)過單線態(tài)氧誘變處理，得到一株在10代內(nèi)有良好的遺傳穩(wěn)定性的突變株。將突變株發(fā)酵培養(yǎng)，測定其生物量和色素含量，均高于原始菌株。本發(fā)明通過低溫復合誘變得到一株蝦青素產(chǎn)量較高的紅法夫酵母誘變菌株，為下一步紅法夫酵母工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。
文檔編號C12N15/01GK101818141SQ200910188300
公開日2010年9月1日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者侯娟, 葉淑紅, 王晗, 王際輝 申請人:大連工業(yè)大學