專利名稱：李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及食品中致病性李斯特菌的鑒定、動物李斯特菌病診斷及細菌分類進化的研究。建立基于多重PCR的鑒別李斯特菌各個種并區(qū)分單增李斯特菌毒力強弱的快速檢測技術(shù)，即李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
李斯特菌屬(Listeria)細菌分布廣泛，對環(huán)境的耐受性較強。根據(jù)基因組序列、毒力及分解糖的能力等，可將其分為6個種，即單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，簡稱單增李斯特菌)、無害李斯特菌(Listeria innocua)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)、威氏李斯特菌(Listeriawelshimeri)和格氏李斯特菌(Listeria grayi)，其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌為主要的致病種。單增李斯特菌是重要的食源性人獸共患病原菌，可引發(fā)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等，2000年即被WHO食品安全工作計劃列為檢測的食源性致病菌之一，其危害嚴重性可見一斑。但單增李斯特菌菌株間的毒力差異較大，弱毒株具有一些獨特的分子特征。而伊氏李斯特菌主要危害動物，特別是反芻獸，常表現(xiàn)為敗血癥和流產(chǎn)。無害李斯特菌、塞氏李斯特菌和格氏李斯特菌也曾有引起人嚴重菌血癥、化膿性腦膜炎和眼結(jié)膜炎的報道，但不常見。在食品中任何一種李斯特菌的存在，均被認為是衛(wèi)生狀況不良的指示，但危害嚴重性不同。李斯特菌家族并不龐大，且不同種的毒力與基因組區(qū)別明顯，因此李斯特菌又是研究毒力分子進化的優(yōu)良模型。
李斯特菌檢測方法有微量生化反應(yīng)和血清學(xué)方法等，均存在操作費時、費力，且試驗結(jié)果差異較大等弊端。目前國內(nèi)外已建立了一些檢測李斯特菌屬及單增李斯特菌的分子生物學(xué)方法，但對非單增李斯特菌及單增李斯特菌不同毒力株鑒別的研究極少，迄今為止，可同時鑒定李斯特菌各個種并區(qū)分單增李斯特菌毒力強弱的方法尚無報道。本發(fā)明通過對新基因lmo0038的分析、引物的選擇以及檢測條件的優(yōu)化，設(shè)計一種準確、靈敏、快速的多重PCR檢測試劑盒，以期填補上述的空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測試劑盒，由四個含有不同成分的凍存管和100個PCR管及加樣及檢測步驟說明組成，可進行100次檢測。
本發(fā)明的李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒由代號為A、B、C、D、E、F、G、H、I和J十個含不同成分的凍存管和100個PCR反應(yīng)管及檢測步驟說明書組成；凍存管A裝有Taq DNA polymerase，10×buffer，dNTP，引物；凍存管B裝有裂解buffer溶液1mL；凍存管C～I分別裝有0.5mL不同的陽性對照溶液，C管為單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)強毒滅活株，D管為單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)弱毒滅活株，E管為無害李斯特菌(Listeria innocua)，F(xiàn)管為伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)，G管為塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)，H管為威氏李斯特菌(Listeriawelshimer)，I管為格氏李斯特菌(Listeria grayi)；凍存管J裝有0.58mL稀釋液。上述引物L(fēng)M、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038-1、lmo0038-2的序列如下LM AAACTGCTAACACAGCTACTLN TAGCACTCCAGTTGTTAAACLS CACAAGCGGCTCCTGCTCAACLGUCTGCGAAACCAGCAGTTTCTLVSW AACTGAGGTAGCGAGCGAALd ATACGCGACCGAAGCCAAClmo0038-1 TTTCAATTATGTACGCCCAGGTGTlmo0038-2 AATATTTCCGCCGCCAAGTAA李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒的檢測步驟如下(1)將凍存管J中0.58mL溶液加至凍存管A，重懸；(2)將凍存管B中的溶液10μL加入PCR反應(yīng)管，再將凍存管C～I中的陽性對照溶液5μL或待檢樣品(菌液或模板均可)5μL加至同一PCR反應(yīng)管，混合均勻，最后將(1)中凍存管A的溶液5.8μL加入上述同一PCR反應(yīng)管，立即檢測；(3)將PCR反應(yīng)管按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進行擴增95℃ 3min；95℃ 45s，62℃30s，72℃ 1min，25個循環(huán)；72℃ 5min；(4)將擴增后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠0.5×TBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析；(5)結(jié)果判定檢測后，待檢樣品與陽性對照溶液C同時擴增出720bp、403bp兩條條帶的為Listeria monocytogenes強毒株陽性(圖1-A)；待檢樣品與陽性對照溶液D同時擴增出720bp條帶的為Listeria monocytogenes弱毒株陽性(圖1-B)；待檢樣品與陽性對照溶液E同時擴增出986bp條帶的為Listeria innocua陽性(圖1-C)；待檢樣品與陽性對照溶液F同時擴增出1357bp、403bp兩條條帶的為Listeria ivanovii陽性(圖1-D)；待檢樣品與陽性對照溶液G同時擴增出1108bp條帶的為Listeria seeligeri陽性(圖1-E)；待檢樣品與陽性對照溶液H同時擴增出1363bp條帶的為Listeria welshimeri陽性(圖1-F)；待檢樣品與陽性對溶液I同時擴增出479bp條帶的為Listeria grayi陽性(圖1-G)；陽性對照溶液出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為待檢樣品陰性(圖1-H)；兩者均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對照溶液無條帶的需重新檢測并判定(圖1-I，J)。


圖1為結(jié)果判定示意圖
M.2000bp DNALadder Marker，1.陽性對照品，2.待檢樣品。
圖2lmo0035-lmo0042長距離PCR擴增產(chǎn)物電泳圖(一)M.2000bp DNA Ladder Marke，1.單增李斯特菌強毒滅活株，2.伊氏李斯特菌，3.無害李斯特菌，4.單增李斯特菌弱毒滅活株，5.塞氏李斯特菌，6.威氏李斯特菌，7.格氏李斯特菌。
圖3lmo0035-lmo0042長距離PCR擴增產(chǎn)物電泳圖(二)M.2000bp DNA Ladder Marker，1.無害李斯特菌，2.單增李斯特菌弱毒滅活株(F2525)，3.單增李斯特菌弱毒滅活株(54006)，4.單增李斯特菌強毒滅活株(EGD-e)。
圖4lmo0029-lmo0042長距離PCR擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNALadder Marker，1.威氏李斯特菌，2.塞氏李斯特菌，3.格氏李斯特菌。
圖5為多重PCR擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.單增李斯特菌強毒滅活株，2.無害李斯特菌，3.伊氏李斯特菌，4.威氏李斯特菌，5.塞氏李斯特菌，6.格氏李斯特菌，7.格氏李斯特菌默氏亞種，8.單增李斯特菌弱毒滅活株。
圖6為本試劑盒檢測靈敏度-單增李斯特菌不同細菌量擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.109CFU/mL，2.108CFU/mL，3.107CFU/mL，4.106CFU/mL，5.105CFU/mL，6.104CFU/mL，7.103CFU/mL，8.102CFU/mL，9.10CFU/mL。
圖7為本試劑盒檢測靈敏度-無害李斯特菌不同細菌量擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.1.7×109CFU/mL，2.1.7×108CFU/mL，3.1.7×107CFU/mL，4.1.7×106CFU/mL，5.1.7×105CFU/mL，6.1.7×104CFU/mL，7.1.7×103CFU/mL，8.1.7×102CFU/mL，9.1.7×10CFU/mL。
圖8為本試劑盒檢測靈敏度-伊氏李斯特菌不同細菌量擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.9×109CFU/mL，2.9×108CFU/mL，3.9×107CFU/mL，4.9×106CFU/mL，5.9×105CFU/mL，6.9×104CFU/mL，7.9×103CFU/mL，8.9×102CFU/mL，9.9×10CFU/mL。
圖9為本試劑盒檢測靈敏度-威氏李斯特菌不同細菌量擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.1.1×109CFU/mL，2.1.1×108CFU/mL，3.1.1×107CFU/mL，4.1.1×106CFU/mL，5.1.1×105CFU/mL，6.1.1×104CFU/mL，7.1.1×103CFU/mL，8.1.1×102CFU/mL，9.1.1×10CFU/mL。
圖10為本試劑盒檢測靈敏度-塞氏李斯特菌不同細菌量擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.109CFU/mL，2.108CFU/mL，3.107CFU/mL，4.106CFU/mL，5.105CFU/mL，6.104CFU/mL，7.103CFU/mL，8.102CFU/mL，9.10CFU/mL。
圖11為本試劑盒檢測靈敏度-格氏李斯特菌不同細菌量擴增產(chǎn)物電泳圖M.2000bp DNA Ladder Marker，1.4.6×109CFU/mL，2.4.6×108CFU/mL，3.4.6×107CFU/mL，4.4.6×106CFU/mL，5.4.6×105CFU/mL，6.4.6×104CFU/mL，7.4.6×103CFU/mL，8.4.6×102CFU/mL，9.4.6×10CFU/mL。
圖12為多重PCR抗干擾試驗電泳圖(一)M.2000bp DNA Ladder Marker，1.單增李斯特菌/無害李斯特菌，2.單增李斯特菌/伊氏李斯特菌，3.單增李斯特菌/威氏李斯特菌，4.單增李斯特菌/塞氏李斯特菌，5.單增李斯特菌/格氏李斯特菌，6.伊氏李斯特菌/無害李斯特菌，7.伊氏李斯特菌/威氏李斯特菌，8.伊氏李斯特菌/塞氏李斯特菌。
圖13為多重PCR抗干擾試驗電泳圖(二)M.2000bp DNA Ladder Marker，1.無害李斯特菌/威氏李斯特菌，2.無害李斯特菌/塞氏李斯特菌，3.威氏李斯特菌/塞氏李斯特菌，4.無害李斯特菌/格氏李斯特菌，5.伊氏李斯特菌/格氏李斯特菌，6.威氏李斯特菌/格氏李斯特菌，7.塞氏李斯特菌/格氏李斯特菌，8.空白對照。
具體實施例方式
一、凍存管組成A管為凍干粉，含有10×buffer(市購)，dNTP(市購)；引物(序列由發(fā)明人設(shè)計，見表1)LM、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038-1、lmo0038-2；Taq DNA polymerase(市購)。保存于-20℃。
B管含有裂解buffer溶液1mL，保存于-20℃。
C-I管含有0.5mL溶液，為七種陽性對照品，保存于-20℃。
D管含有0.58mL溶液，為稀釋液。
二、加樣及檢測步驟說明1、將D管中0.58mL溶液加至A管，重懸。
2、將B管溶液10μL加入PCR反應(yīng)管，再次將C-I管中陽性對照溶液5μL或待檢樣品(菌液或模板均可)5μL加至同一PCR反應(yīng)管，混合均勻，最后將1中的溶液5.8μL加入上述同一PCR反應(yīng)管，立即檢測。
3、將1按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進行擴增95℃ 3min；95℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，25個循環(huán)；72℃ 5min。
4、將2反應(yīng)后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠0.5×TBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。
下面通過試驗對本發(fā)明的使用效果進行論證和描述。
1材料與方法1.1菌株及培養(yǎng)李斯特菌參考菌株部分購自ATCC、NCTC及中國藥品生物制品檢定所，部分由丹麥國立獸醫(yī)研究所M.Jakobsen博士惠贈(詳見表1)。119株經(jīng)李斯特菌選擇性顯色培養(yǎng)基(CHROMagar，法國科瑪嘉)初步篩選出的李斯特菌食品相關(guān)分離株分離自中國浙江、福建、江蘇等地，由浙江大學(xué)動物預(yù)防醫(yī)學(xué)研究所保存。與李斯特菌親緣關(guān)系較近、G+C含量低的革蘭氏陽性菌(G+low)如蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、豬鏈球菌(Streptococcussuis)、馬鏈球菌獸疫亞種(C群)(Streptococcus.equi subsp.zooepidemicus)、嗜酸性乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus)、彎曲乳酸桿菌(Lactobacillus crispatus)以及其他12種陰性對照菌株亦由本研究所保存(詳見表1)。各菌株接種于5mL BHI(DIFCO)培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。
表1 李斯特菌參考菌株及陰性對照菌株


1.2 DNA模板制備取1mL培養(yǎng)物，離心收集沉淀，雙蒸水(Millipore)吹洗后，用等體積2×TZ和雙蒸水重懸，-20℃靜置45min。于沸水中作用8min后立即置冰浴中冷卻7min，12000rpm 4℃離心1min，取上清保存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 1.3小鼠LD506-8周齡ICR雌性小鼠(20-22g)購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，適應(yīng)3天后攻毒。每一菌株設(shè)6個劑量組，每組6只。細菌過夜培養(yǎng)后，8000rpm離心以收集菌體，用PBS(0.01M，pH7.2)調(diào)整細菌數(shù)至1010左右，并進行一系列的十倍梯度稀釋，以0.1mL的劑量腹腔注射；同時，設(shè)一對照組注射0.1mL PBS，另一對照組不注射。攻毒后連續(xù)觀察10天，根據(jù)各組的小鼠死亡率、按改良寇氏法計算出各菌株的LD50。
1.4 lmo0038全基因及其兩側(cè)序列的測定及分析設(shè)計引物擴增單增李斯特菌lmo0038及伊氏李斯特菌同源區(qū)(i-lmo0038)的全長序列。擴增產(chǎn)物割膠回收純化后，按照T-A克隆策略連接至pMD18-T載體中，并熱擊法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α。重組質(zhì)粒通過PCR和EcoR I、HindIII雙酶切鑒定后，將陽性克隆送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。所測序列由Clustal X(version 1.8)軟件分析。
單增李斯特菌lmo0035-0042、lmo0029-0042及其他種的同源區(qū)序列通過長距離PCR擴增，長距離酶(LA Taq DNA polymerase)購自TaKaRa生物技術(shù)有限公司。引物詳見表2。
表2 引物序列及產(chǎn)物長度(一)

注v表示產(chǎn)物長度因種別不同而變化1.5 PCR體系建立1.5.1引物設(shè)計根據(jù)測出的lmo0038全序列，設(shè)計引物lmo0038-1/lmo0038-2。通過對iap序列內(nèi)保守區(qū)和可變區(qū)的分析，并參照相關(guān)文獻，設(shè)計五條上游引物(LM、LN、LVSW、LGU、LS)與下游引物(Ld)競爭結(jié)合。引物序列詳見表3。
1.5.2 PCR反應(yīng)體系及條件通過PCR體系及條件的優(yōu)化，確定多重PCR反應(yīng)體系為10×Taq Buffer(含Mg2+)3μL，10mmol/L dNTP Mix 0.6μL，50μM引物各0.6μL，DNA模板(或菌液)2μL，Taq DNApolymerase 0.8μL，加ddH2O補足體積至30μL；反應(yīng)條件為95℃ 3min；95℃ 45s，62℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)；72℃ 5min。
1.5.3 PCR產(chǎn)物測序鑒定按1.3所述方法，將PCR產(chǎn)物進行克隆、測序。
1.5.4特異性試驗以蠟狀芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種(C群)、嗜酸性乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌等20種細菌以及雙蒸水作為陰性對照和空白對照，用建立的PCR方法進行擴增。
1.5.5敏感性試驗李斯特菌各個種的參考菌株在BHI中37℃過夜培養(yǎng)后，取1mL菌液離心并用PBS(0.01M，pH7.2)重懸，調(diào)整菌液濃度至109CFU/mL(OD600約為0.18-0.2)，作10倍連續(xù)梯度稀釋。選取10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度進行平板計數(shù)，并取各稀釋度的菌液進行PCR檢測。
1.5.6抗干擾試驗將任意兩種或三種李斯特菌的模板(約109CFU/mL)等量混合，前者共有15種組合，后者共9種組合，用建立的PCR體系進行擴增，以確定該方法同時鑒定多種李斯特菌的能力。
1.6食品相關(guān)分離株鑒定119株疑似李斯特菌食品相關(guān)分離株分離自華南地區(qū)的海產(chǎn)品、奶制品、肉制品、蔬菜及食品加工廠器具、污水等。這些分離株均用本試劑盒進行檢測，并同時用API系統(tǒng)(Biomerieux，F(xiàn)rance)鑒定。
1.7種別確證試驗選取16S rRNA、23S rRNA及單增李斯特菌特異性基因hly、mpl、InlB、lmo0733為靶基因，對待檢菌株及參考菌株進行PCR擴增并測序。序列經(jīng)NCBIBLAST對比，以確證該菌株的種別。引物詳見表2。
1.8加樣及檢測步驟1.8.1將試劑盒D管中0.58mL溶液加至A管，重懸。
1.8.2將B管溶液10μL加入PCR反應(yīng)管，再次將C管(或待檢樣品)5μL加至同一PCR反應(yīng)管，混合均勻，最后將1.6.1重懸溶液5.8μL加入上述同一PCR反應(yīng)管，立即檢測。
1.8.3將1.6.1按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進行擴增94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 40s，72℃ 50s，30個循環(huán)；72℃ 5min。
1.8.4將1.6.2反應(yīng)后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠0.5×TBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析。
2結(jié)果2.1小鼠LD50如表4所示，參考菌株F2525、54006為弱毒株(對小鼠的LD50＞108)，而EGD、ScottA、10403S均為標準強毒株。
2.2 lmo0038全基因其兩側(cè)序列的測定及分析單增李斯特菌lmo0038及伊氏李斯特菌同源區(qū)(i-lmo0038)序列全長為1092bp，同源性為83.9％。lmo0035-0042長距離PCR擴增結(jié)果表明，單增李斯特菌強毒株和伊氏李斯特菌兩個致病種可擴增出7538bp條帶，單增李斯特菌弱毒株和無害李斯特菌均擴增出876bp條帶且同源性為78.6-82％，其余種均無擴增(圖2，3)；lmo0029-0042長距離PCR擴增結(jié)果表明，威氏李斯特菌和塞氏李斯特菌可擴增出750bp條帶，而格氏李斯特菌無任何條帶擴增(圖4)。以上結(jié)果提示李斯特菌各個種在該區(qū)段的基因排布不同，lmo0038僅存在于致病種。
2.3多重PCR和試劑盒檢測結(jié)果利用試劑盒對李斯特菌各個種的參考菌株進行擴增，如圖5所示，單增李斯特菌強毒株可得到720bp和403bp的目的條帶，而弱毒株僅得到720bp條帶；無害李斯特菌可得到986bp條帶，伊氏李斯特菌可得到1357bp和403bp兩條條帶，威氏李斯特菌可得到1363bp條帶，塞氏李斯特菌可得到1108bp條帶，格式李斯特菌及默氏亞種均得到479bp條帶。
2.4 PCR產(chǎn)物的測序鑒定PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BLAST比對后，結(jié)果顯示，各個種的iap序列與已知序列的同源性為98.2％-100％；lmo0038與已知序列的同源性為100％，與i-lmo0038序列的同源性為79.4％(網(wǎng)上尚無i-lmo0038序列)。表明該PCR方法具有較高的準確性。
2.5特異性試驗利用本試劑盒分別對20種其他細菌進行擴增，結(jié)果顯示無任何條帶，表明該PCR反應(yīng)擴增李斯特菌基因片段具有良好的特異性。
2.6敏感性試驗利用試劑盒對各稀釋度的李斯特菌菌液進行檢測，結(jié)果見圖6-圖11。當(dāng)各個種分別含有約102CFU/mL細菌時，可見相應(yīng)的目的條帶產(chǎn)物，表明該方法對李斯特菌各個種的敏感性均可達102CFU/mL。
2.7抗干擾試驗如圖12、13所示，將兩種李斯特菌的模板等量混合后，15種組合均可同時擴增出清晰的目的條帶，不產(chǎn)生干擾。而將三種李斯特菌的模板等量混合后，僅能擴增出較小的片段，如lmo0038及格氏李斯特菌的iap片段，因此該方法不適用于三個種的同時檢測。
2.8食品相關(guān)分離株鑒定及種別確證在119株來自華南地區(qū)的食品相關(guān)分離株中，通過本試劑盒的鑒定，86株為單增李斯特菌，其中牛奶分離株mLm4僅擴增出iap條帶(圖3)，而鹽焗雞分離株L92擴增出的iap條帶較小(約600-650bp)。LD50結(jié)果(表4)表明，在20株單增李斯特菌分離株中，除mLm4毒力與標準弱毒株F2525、54006相當(dāng)外，其余均為強毒株，與試劑盒檢測結(jié)果吻合。其余27株為無害李斯特菌，1株為塞氏李斯特菌，1株為威氏李斯特菌，4株為非李斯特菌。API結(jié)果也與其完全符合。
通過種別確證試驗發(fā)現(xiàn)，mLm4、L92均可擴增出與單增李斯特菌參考菌株相同的hly、mpl、InlB、lmo0733條帶，確證兩者為單增李斯特菌。而通過16S rRNA、23S rRNA基因的PCR、測序及序列分析，在4株非李斯特菌中3株為糞腸球菌，1株為較為少見的綠淺氣球菌(Aerococcus viridans)。以上結(jié)果均證實該多重PCR快速檢測試劑盒的可靠性。
表3 引物序列及產(chǎn)物長度(二)

表4 單增李斯特菌參考菌株及分離株來源與小鼠LD50

序列表LM AAACTGCTAACACAGCTACTLN TAGCACTCCAGTTGTTAAACLS CACAAGCGGCTCCTGCTCAACLGU CTGCGAAACCAGCAGTTTCTLVSW AACTGAGGTAGCGAGCGAALd ATACGCGACCGAAGCCAAClmo0038-1TTTCAATTATGTACGCCCAGGTGTlmo0038-2AATATTTCCGCCGCCAAGTAA
權(quán)利要求
1.李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒，包括10個含不同成分的凍存管A、B、C、D、E、F、G、H、I和J和100個PCR反應(yīng)管及檢測步驟說明書，其特征在于凍存管A裝有Taq DNA polymerase，10×buffer，dNTP，引物；凍存管B裝有裂解buffer溶液1mL；凍存管C～I分別裝有0.5mL不同的陽性對照溶液，C管為單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡稱單增李斯特菌)強毒滅活株，D管為單核細胞增多性李斯特菌弱毒滅活株，E管為無害李斯特(Listeria innocua)，F(xiàn)管為伊氏李斯特菌(Listeriaivanovii)，G管為塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)，H管為威氏李斯特菌(Listeria welshimer)，I管為格氏李斯特菌(Listeria grayi)；凍存管J裝有0.58mL稀釋液。
2.按權(quán)利要求1所述李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒，其特征在于所述引物為LM、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038-1、lmo0038-2，其序列如下LM AAACTGCTAACACAGCTACTLN TAGCACTCCAGTTGTTAAACLS CACAAGCGGCTCCTGCTCAACLGU CTGCGAAACCAGCAGTTTCTLVSW AACTGAGGTAGCGAGCGAALd ATACGCGACCGAAGCCAAClmo0038-1TTTCAATTATGTACGCCCAGGTGTlmo0038-2AATATTTCCGCCGCCAAGTAA。
3.按權(quán)利要求1所述李斯特菌種別及毒力快速檢測試劑盒，其特征在于它的檢測方法為如下步驟(1)將凍存管J中0.58mL溶液加至凍存管A，重懸；(2)將凍存管B中的溶液10μL加入PCR反應(yīng)管，再將凍存管C～I中的陽性對照溶液5μL或待檢樣品5μL加至同一PCR反應(yīng)管，混合均勻，最后將(1)中凍存管A的溶液5.8μL加入上述同一PCR反應(yīng)管，立即進行以下檢測步驟；(3)將PCR反應(yīng)管按以下反應(yīng)條件在PCR儀上進行擴增95℃3min；95℃45s，62℃30s，72℃1min，25個循環(huán)；72℃5min；(4)將擴增后的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠0.5×TBE緩沖液中電泳，經(jīng)Goldview染色后用凝膠成像系統(tǒng)分析；(5)結(jié)果判定檢測后，待檢樣品與陽性對溶液C同時擴增出720bp、403bp兩條條帶的為單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)強毒株陽性；待檢樣品與陽性對溶液D同時擴增出720bp條帶的為單核細胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)弱毒株陽性；待檢樣品與陽性對溶液E同時擴增出986bp條帶的為無害李斯特(Listeria innocua)陽性；待檢樣品與陽性對溶液F同時擴增出1357bp、403bp兩條條帶的為伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)陽性；待檢樣品與陽性對溶液G同時擴增出1108bp條帶的為塞氏李斯特菌(Listeria seeligeri)陽性；待檢樣品與陽性對溶液H同時擴增出1363bp條帶的為威氏李斯特菌(Listeria welshimeri)陽性；待檢樣品與陽性對溶液I同時擴增出479bp條帶的為格氏李斯特菌(Listeria grayi)陽性；陽性對照溶液出現(xiàn)條帶而待檢樣品無條帶的為待檢樣品陰性；兩者均無條帶或待檢樣品出現(xiàn)條帶而陽性對照溶液無條帶的需重新檢測并判定。
全文摘要
李斯特菌種別及單核細胞增多性李斯特菌毒力強弱的快速檢測試劑盒，由四個含不同成分的凍存管和100個PCR反應(yīng)管及檢測步驟說明書組成，凍存管分別裝有Taq DNA polymerase，10×buffer，dNTP，引物L(fēng)M、LN、LS、LVSW、LGU、Ld、lmo0038－1和lmo0038－2，裂解buffer溶液，陽性對照溶液和稀釋液。本發(fā)明建立的多重PCR方法可同時鑒定李斯特菌各個種并區(qū)分單核細胞增多性李斯特菌的毒力強弱，最低檢測限可達10
文檔編號C12Q1/68GK101029331SQ20071006698
公開日2007年9月5日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月30日
發(fā)明者方維煥, 陳健舜, 江玲麗, 李肖梁, 王淑娜, 田國明, 陳寧, 吳蓓蓓 申請人:浙江大學(xué)