專利名稱：釀酒酵母cwy132及其在微生物發(fā)酵制備2－苯乙醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株釀酒酵母誘變株——釀酒酵母CWY132，及其在微生物發(fā)酵制備2-苯乙醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2-苯乙醇是一種具有玫瑰花香的芳香醇，大量應(yīng)用于日用化學(xué)和食品工業(yè)中玫瑰香型和其他類型的香精配方，也是所有花香型調(diào)和香料以及高級(jí)香水中不可或缺的成分。從上世紀(jì)末以來(lái)，消費(fèi)者對(duì)“天然”產(chǎn)品的要求越來(lái)越高，國(guó)際市場(chǎng)上，對(duì)天然2-苯乙醇的需求量非?？捎^，價(jià)格高達(dá)1000$/kg；國(guó)內(nèi)由于化工產(chǎn)品長(zhǎng)期占據(jù)主導(dǎo)地位，故化學(xué)合成的2-苯乙醇仍占絕大部分，但化學(xué)合成2-苯乙醇使用苯和苯乙烯等致癌物質(zhì)作為原料，對(duì)人體健康和環(huán)境都有巨大危害，此外，化學(xué)合成的2-苯乙醇中常含有一些難以除去的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響了產(chǎn)品質(zhì)量。
近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，特別是我國(guó)加入世界貿(mào)易組織，人們?cè)絹?lái)越重視產(chǎn)品的安全性，追求有機(jī)、生態(tài)、綠色產(chǎn)品已成為一種時(shí)尚。天然2-苯乙醇也必將順應(yīng)此趨勢(shì)，不斷提高其在日常生活中所占的比例。微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇，具有發(fā)酵周期短、發(fā)酵效率高、低成本、高收益、環(huán)境友好等優(yōu)勢(shì)，開發(fā)生產(chǎn)的潛力巨大。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了提供一株可發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇，且發(fā)酵周期短、發(fā)酵效率高、低成本、收率高的釀酒酵母誘變株——釀酒酵母CWY132，及其在微生物發(fā)酵制備2-苯乙醇中的應(yīng)用。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是釀酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏編號(hào)CCTCC NOM206136。
所述釀酒酵母CWY132由如下方法獲得對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的多株不同種類的酵母(包括釀酒酵母、路德類酵母、畢赤酵母、紅酵母等)進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇的試驗(yàn)，篩選得到2-苯乙醇產(chǎn)量最高的菌株釀酒酵母AS2.516(Saccharomyces cerevisiae AS2.516，可以在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心買到)，上述菌種先后經(jīng)過(guò)紫外線15W照射75秒，20KeV N+離子束注入1.2×1013ions/cm2和20KeV H+離子束注入0.8×1013ions/cm2處理，篩選高產(chǎn)2-苯乙醇的突變株，2-苯乙醇產(chǎn)量經(jīng)過(guò)高效液相色譜驗(yàn)證，獲得突變菌株CWY132。
所述釀酒酵母CWY132菌落特征和生化特性如下該菌株在固體YEPD或YPAD培養(yǎng)基上形成乳白色圓形飽滿菌落，具有酵母特有的酒香味，以芽殖方式進(jìn)行無(wú)性繁殖，可以同化和發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和果糖，不同化木糖，其最適生長(zhǎng)溫度為28～35℃，最適生長(zhǎng)pH值為5.0～6.0。
所述的釀酒酵母CWY132主要用于微生物發(fā)酵制備2-苯乙醇。
所述應(yīng)用具體為將所述釀酒酵母CWY132接種于含有底物L(fēng)-苯丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述的2-苯乙醇。通常，將發(fā)酵液過(guò)濾收集上清液，自上清液中蒸餾即可獲得2-苯乙醇。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸濃度高于6g/L時(shí)，為提高收率，可在培養(yǎng)基中添加聚丙二醇，發(fā)酵結(jié)束后分層，收集聚丙二醇相、自聚丙二醇相中蒸餾即可得到所述的2-苯乙醇。所添加的聚丙二醇對(duì)水相發(fā)酵體系中產(chǎn)生的2-苯乙醇具有高效抽提的作用，由于2-苯乙醇對(duì)多種細(xì)菌和真菌具有抑制作用，其對(duì)酵母細(xì)胞的致死濃度為3.8g/L；當(dāng)培養(yǎng)基中添加的L-苯丙氨酸量高于6g/L時(shí)，所產(chǎn)生的2-苯乙醇量將達(dá)到細(xì)胞的致死濃度，非常不利于產(chǎn)量的進(jìn)一步提高；本發(fā)明通過(guò)添加聚丙二醇，將發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的2-苯乙醇及時(shí)抽提到聚丙二醇相，使水相中的2-苯乙醇濃度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中一直處于較低水平，不影響細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)，且2-苯乙醇在聚丙二醇相和水相中的分配系數(shù)大于30，保證了所產(chǎn)生的2-苯乙醇絕大部分都位于聚丙二醇相中，發(fā)酵結(jié)束后直接回收聚丙二醇即可。聚丙二醇的另一優(yōu)勢(shì)是它已被美國(guó)FDA列為可食用級(jí)別的溶媒，可直接作為食品添加劑使用，安全可靠。
所述發(fā)酵培養(yǎng)在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)36～72小時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸3～26g/L，磷酸二氫鉀2～10g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH4.5～7.0。
所述釀酒酵母CWY132接種量為5×106～2×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基。優(yōu)選為1×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基。
特別的，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的L-苯丙氨酸濃度高于6g/L時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中還可含有體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.1～1倍的聚丙二醇，發(fā)酵結(jié)束后離心或靜置分層，收集聚丙二醇相、蒸餾得到所述的2-苯乙醇。所述聚丙二醇可在發(fā)酵之前添加，也可在發(fā)酵過(guò)程中添加。
所述聚丙二醇優(yōu)選為聚丙二醇1000～2000，最優(yōu)選為聚丙二醇1500。
為使發(fā)酵的效果更好，所述釀酒酵母CWY132在接種至發(fā)酵培養(yǎng)基之前可先進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)先將釀酒酵母CWY132斜面培養(yǎng)活化，培養(yǎng)為固體平皿菌種，再將固體平皿中的單菌落培養(yǎng)為液體菌種，液體菌種經(jīng)過(guò)至少二級(jí)液體種子培養(yǎng)后，再接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
具體的，所述的應(yīng)用按如下順序步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132菌種接種于YEPD或YPAD固體斜面上，在28～35℃條件下培養(yǎng)36～60小時(shí)，得斜面活化種子，4℃下保存?zhèn)溆茫?2)固體平皿培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的斜面活化種子劃線接種于YEPD或YPAD固體平皿上，在28～35℃條件下培養(yǎng)36～48小時(shí)，長(zhǎng)出單菌落，即為固體平皿菌種；(3)液體培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的固體平皿菌接種于YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)12～20小時(shí)，即為液體菌種；(4)種子放大培養(yǎng)將液體菌種按5～15％體積比的接種量接入YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)12～20小時(shí)，即為一級(jí)種子培養(yǎng)液；將一級(jí)種子培養(yǎng)液按5～30％體積比接種入種子培養(yǎng)基中，在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)20～30小時(shí)，即為二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30～60g/L、L-苯丙氨酸3～5g/L、磷酸二氫鉀2～10g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH 5.5；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以5×106～2×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量，將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積1/3的聚丙二醇1000～2000，28～35℃下攪拌培養(yǎng)36～72小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸6～26g/L，磷酸二氫鉀2～10g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH4.5～7.0；(6)分離純化發(fā)酵液離心或靜置分層，取聚丙二醇相，蒸餾，得到所述2-苯乙醇。
優(yōu)選的，所述的應(yīng)用按如下順序步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132菌種接種于YEPD或YPAD固體斜面上，在28℃條件下培養(yǎng)60小時(shí)，得斜面活化種子，4℃下保存?zhèn)溆茫?2)固體平皿培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的斜面活化種子劃線接種于YEPD或YPAD固體平皿上，在28℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)，長(zhǎng)出單菌落，即為固體平皿菌種；(3)液體培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的固體平皿菌接種于YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，接種量為1環(huán)/100mL培養(yǎng)基，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，即為液體菌種；(4)種子放大培養(yǎng)將液體菌種按8％體積比的接種量接入YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，即為一級(jí)種子培養(yǎng)液；將一級(jí)種子培養(yǎng)液按10％體積比的接種入種子培養(yǎng)基中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)20小時(shí)，即為二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30g/L、L-苯丙氨酸3g/L、磷酸二氫鉀6g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH5.5；
(5)發(fā)酵培養(yǎng)以1×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量，將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積1/3的聚丙二醇1500，32℃下攪拌培養(yǎng)60小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30g/L，L-苯丙氨酸15g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH5.0；(6)分離純化發(fā)酵液離心或靜置分層，取聚丙二醇相，蒸餾，得到所述2-苯乙醇。
本發(fā)明的誘變株——釀酒酵母CWY132，經(jīng)過(guò)多次誘變，具有高效轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸生產(chǎn)天然2-苯乙醇的特性。當(dāng)所添加的L-苯丙氨酸量小于6g/L時(shí)，摩爾轉(zhuǎn)化率可達(dá)90％以上；當(dāng)所添加的L-苯丙氨酸量高于6g/L時(shí)，向培養(yǎng)基中加入聚丙二醇，最終的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)50％～90％，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明使用的發(fā)酵底物是葡萄糖和L-苯丙氨酸，適當(dāng)添加磷酸二氫鉀和硫酸鎂，即可進(jìn)行正常生產(chǎn)，所添加的聚丙二醇也價(jià)格低廉，方法簡(jiǎn)單，成本低廉。而天然2-苯乙醇國(guó)際市場(chǎng)的價(jià)格為1000$/kg，具有很好的市場(chǎng)前景。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在發(fā)酵周期短，正常發(fā)酵的溫度范圍較寬，該方法對(duì)發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般的醇類發(fā)酵工廠的設(shè)備和條件均可生產(chǎn)，生產(chǎn)投資較少，收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。


釀酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏編號(hào)CCTCC NOM206136。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1利用釀酒酵母CWY132發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇，步驟如下1、斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132接種于YPAD固體斜面上，在28℃條件下培養(yǎng)60小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、固體平皿培養(yǎng)將斜面保存的釀酒酵母CWY132用接種環(huán)挑一環(huán)劃線接種于YPAD固體平皿上，在28℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)，形成成熟單菌落，即為固體平皿菌種；3、液體培養(yǎng)將固體平皿上的釀酒酵母CWY132，用接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落接種于裝有100毫升YPAD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，即為液體菌種；4、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按8％的接種量接入裝有500毫升YPAD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；5、二級(jí)液體種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)液按10％的接種量接入裝有3升種子培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)罐，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)20小時(shí)，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基各組分終濃度為葡萄糖30g/L、L-苯丙氨酸3g/L、磷酸二氫鉀6g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH為5.5；6、發(fā)酵培養(yǎng)二級(jí)種子培養(yǎng)液按1×107個(gè)細(xì)胞/毫升的接種量接入裝有8升發(fā)酵培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)36小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基各組份終濃度葡萄糖濃度30g/L，L-苯丙氨酸濃度5g/L，磷酸二氫鉀濃度6g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿(武漢天源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，下同)0.17g/L，培養(yǎng)基的pH為5.5；7、分離純化將得到的發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，收集上清液；上清液蒸餾獲得2-苯乙醇，最終的摩爾轉(zhuǎn)化率為95.3％。
實(shí)施例2利用釀酒酵母CWY132發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇，步驟如下1、斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132接種于YEPD固體斜面上，在30℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、固體平皿培養(yǎng)將斜面保存的釀酒酵母CWY132用接種環(huán)挑一環(huán)劃線接種于YEPD固體平皿上，在30℃條件下培養(yǎng)36小時(shí)，形成成熟單菌落，即為固體平皿菌種；3、液體培養(yǎng)將固體平皿上的釀酒酵母CWY132，用接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落接種于裝有100毫升YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃條件下攪拌培養(yǎng)14小時(shí)，即為液體菌種；4、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按10％體積比的接種量接入裝有500毫升YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在30℃條件下攪拌培養(yǎng)14小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；5、二級(jí)液體種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)液按15％體積比的接種量接入裝有3升種子培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)罐，在30℃條件下攪拌培養(yǎng)20小時(shí)，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基各組份終濃度為葡萄糖40g/L、L-苯丙氨酸5g/L、磷酸二氫鉀6g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH為5.5；6、發(fā)酵培養(yǎng)將二級(jí)種子培養(yǎng)液按5×106個(gè)細(xì)胞/毫升的接種量接入裝有7升發(fā)酵培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐中，再向其中加入1.5升聚丙二醇1000；將上述發(fā)酵體系在30℃條件下攪拌培養(yǎng)50小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基各組份終濃度為葡萄糖40g/L，L-苯丙氨酸濃度9g/L，磷酸二氫鉀濃度6g/L，添加0.5g/L硫酸鎂，0.17g/L去除了氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿，培養(yǎng)基的pH為6.0；7、分離純化將發(fā)酵液離心，使水相和聚丙二醇相分層，收集聚丙二醇相，蒸餾獲得2-苯乙醇，最終的摩爾轉(zhuǎn)化率為72.3％。
實(shí)施例3利用釀酒酵母CWY132發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇，步驟如下1、斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132接種于YPAD固體斜面上，在32℃條件下培養(yǎng)40小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、固體平皿培養(yǎng)將斜面保存的釀酒酵母CWY132用接種環(huán)挑一環(huán)劃線接種于YPAD固體平皿上，在32℃條件下培養(yǎng)30小時(shí)，形成成熟單菌落，即為固體平皿菌種；3、液體培養(yǎng)將固體平皿上的釀酒酵母CWY132，用接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落接種于裝有100毫升YPAD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在32℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，即為液體菌種；4、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按12％體積比的接種量接入裝有500毫升YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在32℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，得到一級(jí)種子培養(yǎng)液；5、二級(jí)液體種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)液按20％體積比的接種量接入裝有3升種子培養(yǎng)基的種子培養(yǎng)罐，在32℃條件下攪拌培養(yǎng)25小時(shí)，得到二級(jí)液體種子培養(yǎng)物；所述種子培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖50g/L、L-苯丙氨酸5g/L、磷酸二氫鉀8g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH 5.5；6、發(fā)酵培養(yǎng)將二級(jí)液體種子培養(yǎng)物按1×107個(gè)細(xì)胞/毫升的接種量接入裝有6升發(fā)酵培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐中，再向其中加入2升聚丙二醇2000；將上述發(fā)酵體系在32℃條件下攪拌培養(yǎng)60小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基各組份終濃度為葡萄糖50g/L，L-苯丙氨酸濃度15g/L，磷酸二氫鉀濃度8g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH5.0；7、分離純化將發(fā)酵液靜置24h，使水相和聚丙二醇相分層，收集聚丙二醇相，蒸餾，獲得2-苯乙醇，最終的摩爾轉(zhuǎn)化率為79.1％。
實(shí)施例4利用釀酒酵母CWY132發(fā)酵生產(chǎn)天然2-苯乙醇，步驟如下1、斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132接種于YPAD固體斜面上，在35℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，放入4℃冰箱保存；2、固體平皿培養(yǎng)將斜面保存的釀酒酵母CWY132用接種環(huán)挑一環(huán)劃線接種于YPAD固體平皿上，在35℃條件下培養(yǎng)36小時(shí)，形成成熟單菌落，即為固體平皿菌種；
3、液體培養(yǎng)將固體平皿上的釀酒酵母CWY132，用接種環(huán)挑取一個(gè)單菌落接種于裝有100毫升YPAD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在35℃條件下攪拌培養(yǎng)20小時(shí)，即為液體菌種；4、一級(jí)液體種子培養(yǎng)將液體菌種按15％體積比的接種量接入裝有500毫升YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在35℃條件下攪拌培養(yǎng)20小時(shí)，得到一級(jí)液體種子培養(yǎng)液；5、二級(jí)液體種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)液按30％體積比的接種量接入裝有3升種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐，在35℃條件下攪拌培養(yǎng)30小時(shí)，得到二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基各組份終濃度為葡萄糖60g/L、L-苯丙氨酸5g/L、磷酸二氫鉀10g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH為5.5；6、發(fā)酵培養(yǎng)將二級(jí)液體種子培養(yǎng)物按2×107個(gè)細(xì)胞/毫升的接種量接入裝有5升發(fā)酵培養(yǎng)基的10升發(fā)酵罐中，再向其中加入3升聚丙二醇1500；將上述發(fā)酵體系在35℃條件下攪拌培養(yǎng)72小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基各組份終濃度為葡萄糖60g/L，L-苯丙氨酸濃度20g/L，磷酸二氫鉀濃度10g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH為6.5；7、將發(fā)酵液離心，使水相和聚丙二醇相分層，收集聚丙二醇相蒸餾，獲得2-苯乙醇，最終的摩爾轉(zhuǎn)化率為82.4％。
權(quán)利要求
1.釀酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏編號(hào)CCTCC NOM206136。
2.如權(quán)利要求1所述的釀酒酵母CWY132在微生物發(fā)酵制備2-苯乙醇中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將所述釀酒酵母CWY132接種于含有底物L(fēng)-苯丙氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)分離純化得到所述的2-苯乙醇。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)36～72小時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸3～26g/L，磷酸二氫鉀2～10g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH4.5～7.0。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述釀酒酵母CWY132接種量為5×106～2×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積0.1～1倍的聚丙二醇，發(fā)酵結(jié)束后離心或靜置分層，收集聚丙二醇相、蒸餾得到所述的2-苯乙醇。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述聚丙二醇為聚丙二醇1000～2000。
8.如權(quán)利要求2～7之一所述的應(yīng)用，其特征在于先將釀酒酵母CWY132斜面培養(yǎng)活化，培養(yǎng)為固體平皿菌種，再將固體平皿中的單菌落培養(yǎng)為液體菌種，液體菌種經(jīng)過(guò)至少二級(jí)液體種子培養(yǎng)后，再接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用按如下順序步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132菌種接種于YEPD或YPAD固體斜面上，在28～35℃條件下培養(yǎng)36～60小時(shí)，得斜面活化種子，4℃下保存?zhèn)溆茫?2)固體平皿培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的斜面活化種子劃線接種于YEPD或YPAD固體平皿上，在28～35℃條件下培養(yǎng)36～48小時(shí)，長(zhǎng)出單菌落，即為固體平皿菌種；(3)液體培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的固體平皿菌接種于YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)12～20小時(shí)，即為液體菌種；(4)種子放大培養(yǎng)將液體菌種按5～15％體積比的接種量接入YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)12～20小時(shí)，即為一級(jí)種子培養(yǎng)液；將一級(jí)種子培養(yǎng)液按5～30％體積比接種入種子培養(yǎng)基中，在28～35℃條件下攪拌培養(yǎng)20～30小時(shí)，即為二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30～60g/L、L-苯丙氨酸3～5g/L、磷酸二氫鉀2～10g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH5.5；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以5×106～2×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量，將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積1/3的聚丙二醇1000～2000，28～35℃下攪拌培養(yǎng)36～72小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30～60g/L，L-苯丙氨酸6～26g/L，磷酸二氫鉀2～10g/L，硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH4.5～7.0；(6)分離純化發(fā)酵液離心或靜置分層，取聚丙二醇相，蒸餾，得到所述2-苯乙醇。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用按如下順序步驟進(jìn)行(1)斜面培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132菌種接種于YEPD或YPAD固體斜面上，在28℃條件下培養(yǎng)60小時(shí)，得斜面活化種子，4℃下保存?zhèn)溆茫?2)固體平皿培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的斜面活化種子劃線接種于YEPD或YPAD固體平皿上，在28℃條件下培養(yǎng)48小時(shí)，長(zhǎng)出單菌落，即為固體平皿菌種；(3)液體培養(yǎng)將釀酒酵母CWY132的固體平皿菌接種于YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，接種量為1環(huán)/100mL培養(yǎng)基，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，即為液體菌種；(4)種子放大培養(yǎng)將液體菌種按8％體積比的接種量接入YEPD或YPAD液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，即為一級(jí)種子培養(yǎng)液；將一級(jí)種子培養(yǎng)液按10％體積比的接種入種子培養(yǎng)基中，在28℃條件下攪拌培養(yǎng)20小時(shí)，即為二級(jí)種子培養(yǎng)液；所述種子培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30g/L、L-苯丙氨酸3g/L、磷酸二氫鉀6g/L、硫酸鎂0.5g/L，不含氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH5.5；(5)發(fā)酵培養(yǎng)以1×107個(gè)細(xì)胞/mL培養(yǎng)基的接種量，將二級(jí)種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，并加入體積為發(fā)酵培養(yǎng)基體積1/3的聚丙二醇1500，32℃下攪拌培養(yǎng)60小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分終濃度為葡萄糖30g/L，L-苯丙氨酸15g/L，磷酸二氫鉀6g/L，硫酸鎂0.5g/L，不合氨基酸和硫酸銨的酵母氮堿0.17g/L，pH5.0；(6)分離純化發(fā)酵液離心或靜置分層，取聚丙二醇相，蒸餾，得到所述2-苯乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株釀酒酵母誘變株——釀酒酵母CWY132，及其在微生物發(fā)酵制備2－苯乙醇中的應(yīng)用。所述釀酒酵母CWY132(Saccharomyces cerevisiae CWY132)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2006年12月15日，保藏編號(hào)CCTCC NOM206136。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在發(fā)酵周期短，正常發(fā)酵的溫度范圍較寬，該方法對(duì)發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般的醇類發(fā)酵工廠的設(shè)備和條件均可生產(chǎn)，生產(chǎn)投資較少，收率高，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P7/02GK101016517SQ20071006688
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月23日
發(fā)明者崔志峰, 楊霄, 汪琨, 朱廷恒 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)