專利名稱：牛奶中致瀉型大腸桿菌pcr快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物監(jiān)測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
大腸埃希氏菌是流行性兼性厭氧菌，寄生在人類的結(jié)腸部位，是嬰兒出生一小時(shí)內(nèi)在胃腸道定居的典型微生物。其后，大腸埃希氏菌通常與其宿主保持共生關(guān)系。大腸埃希氏菌在正常情況下被局限在狹窄的腸道內(nèi)不致病，但是當(dāng)宿主過(guò)度疲勞或免疫力下降時(shí)，或當(dāng)正常胃腸道壁被破壞時(shí)。以致正常“良性”大腸埃希氏菌株也可引起感染。致瀉性大腸埃希氏菌是引起感染性腹瀉的病原菌之一。目前，根據(jù)致瀉性大腸埃希氏菌的毒力因子，致病機(jī)理及其遺傳控制，國(guó)際上將其分為五類——腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(ETEC)、腸集聚性大腸埃希氏菌(EAggEC)，其中ETEC菌株通過(guò)LT和ST致病基因的作用引起腹瀉。這些菌株可只表達(dá)LT?；蛑槐磉_(dá)ST，或二者都表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中的所采用標(biāo)準(zhǔn)菌株44247(ETEC，O6:K15:H16)被Jav Sarantuya等人報(bào)道只含ST。EPEC是在發(fā)展中國(guó)家已被同嬰兒腹瀉聯(lián)系在一起的一種重要的致腹瀉大腸桿菌分類，其致病性與LEE毒力島上的eaeA毒力基因有關(guān)。EIEC的侵襲機(jī)制是研究最為清楚的，其侵襲性是因?yàn)榫哂星忠u性質(zhì)粒引起的，在侵襲性質(zhì)粒上含有ipaH毒素基岡。目前采用的檢測(cè)食品中這幾種致瀉型大腸桿菌的分離培養(yǎng)法陽(yáng)性率低。且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需幾周時(shí)間才能報(bào)告結(jié)果。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)技術(shù)具有減少檢驗(yàn)時(shí)間、方法簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，為大腸桿菌的快速檢測(cè)提供了有力手段，但目前尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)幾種腹瀉致病菌的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種分別以ST、eaeA、ipaH毒素基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物。應(yīng)用多重PCR同時(shí)擴(kuò)增主要致病性大腸桿菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，建立一種牛奶中致瀉型大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的 多重PCR快速檢測(cè)試劑盒的組成包括 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI33.0μl

DNA模板5.0μl ddH2O29.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl Total50.0μl 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒還可以包括這樣一些特征 1、所述的引物的濃度為 2、所述的模板DNA，是將樣品或(ETEC、EPEC和EIEC)標(biāo)準(zhǔn)菌株混合物分別接種于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化鈉，pH7.5的液體培養(yǎng)基中。200rpm/min、37±1℃搖床培養(yǎng)2.5h，采取裂解法或者試劑盒方法提取提取的DNA。
3、PCR反應(yīng)條件為 95℃ 5min； 94℃ 40S，51.3℃ 40S，72℃ 1min，循環(huán)30次，再72℃延伸1Omin。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用這樣的方法來(lái)制備的 1、細(xì)菌的增菌培養(yǎng) 將ETEC、EPEC和EIEC標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化鈉，pH7.5的液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2、模板DNA的提取及定量 采取裂解法或者試劑盒方法提取提取DNA,應(yīng)用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的吸光值，先用去離子水洗4次石英比色皿，將提取的原DNA用去離子水稀釋60倍。將3000μl去離子水的比色杯放入儀器中讀取零值作參照。將稀釋60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)公式核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280計(jì)算DNA濃度將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液做10倍遞增稀釋，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度。吸取該稀釋度1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿，及時(shí)將涼至46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿10-15ml，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板。置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，按照中國(guó)人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢測(cè)菌落總數(shù)測(cè)定(GB4789.2-94)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)； 3、引物的設(shè)計(jì)與合成 引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 4、建立單個(gè)PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)在0.5ml Eppendorf管中進(jìn)行，采用50μl反應(yīng)體系，各反應(yīng)成分為 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI3 3.0μl 引物P1 1.0μl 引物P2 1.0μl DNA模板 5.0μl ddH2O 33.5μl TaqDNA聚合酶(5U/Ll) 0.5μl Total 50.0μl 引物濃度為 5、本發(fā)明的多重PCR反應(yīng)條件為 95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
使用時(shí)取0.5ml奶樣加到4.5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm/min、37±1℃搖床培養(yǎng)2.5h，取36μl LB培養(yǎng)液，加入到1.5ml離心管中，在加入4μl的10×TE和60μl的2×蛋白酶K，56℃金屬浴90min，95℃水浴10min，10,000×g離心1min，取上清做模板，制成試樣，-20℃保存?zhèn)溆谩０凑誔CR快速檢測(cè)試劑盒反應(yīng)體系的組成，即10×PCRbuffer 5.0μl；10mMdNTP 1.0μl；25mM MgCl2 3.0μl；引物P1各1.0μl；引物P2各1.0μl；DNA模板5.0μl；TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl，其余用超純水加至反應(yīng)總體積為50.0μl。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。再進(jìn)行結(jié)果判定將50×TAE電泳緩沖液20ml加雙蒸水稀釋至1000ml(1×TAE)待用，14ml 1×TAE緩沖液于三角瓶中，加入3.5g瓊脂糖加熱溶解，冷至50℃左右后加入溴化乙錠(0.5μg/ml)0.5μl，倒人準(zhǔn)備好的電泳平板上，電泳槽中加入1×TAE緩沖液，取PCR終產(chǎn)物按5∶1的比例加入溴酚藍(lán)點(diǎn)樣110V電泳25min，取出然后置于300nm的紫外透射儀上觀察，樣品出現(xiàn)和陽(yáng)性對(duì)照在同一水平位置上的紅橙色熒光帶即為陽(yáng)性，否則為陰性。
本發(fā)明的原理為 致瀉性E.coli通過(guò)本身的致病基因引起腹瀉，如ETEC菌株通過(guò)LT和ST致病基因致病。這些菌株可只表達(dá)LT，或只表達(dá)ST，或二者都表達(dá)。EPEC的致病性與LEE毒力島上的eaeA毒力基因有關(guān)。EIEC的侵襲機(jī)制是研究最為清楚的，其侵襲性是因?yàn)榫哂星忠u性質(zhì)粒引起的，在侵襲性質(zhì)粒上含有ipaH毒素基因。本發(fā)明分別以ST、eaeA、ipaH毒素基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，證明這三對(duì)基因?qū)ο鄳?yīng)致病菌是特異性的，且敏感性很高。所以，應(yīng)用多重PCR技術(shù)在一次反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增主要致病性大腸桿菌EPEC、EIEC和ETEC的毒力基因，以建立一種快速檢測(cè)牛奶中致瀉性大腸桿菌的PCR擴(kuò)增方法。
本發(fā)明對(duì)牛奶中常見的腹瀉致病性大腸桿菌即致病性大腸桿菌(EPEC)、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)和腸侵襲性E.coli(EIEC)進(jìn)行基因檢測(cè)研究，建立了快速樣品處理和多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)診斷方法，在一次PCR反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增這三種菌的致病基因ETEC的ST基因、EPEC的eaeA毒力基因和EIEC的侵襲性質(zhì)粒上的ipaH毒素基因，建立了一種快速檢測(cè)牛奶中致瀉型大腸桿菌的PCR擴(kuò)增方法。
本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)在于建立一種快速樣品處理和多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)診斷方法。本發(fā)明與目前常用的分離培養(yǎng)法相比具有以下優(yōu)點(diǎn) 1.快速本方法檢測(cè)整個(gè)過(guò)程所需時(shí)間包括樣品前處理3h，PCR擴(kuò)增需3.5h，瓊脂糖電泳觀察需0.5h，全程僅需7小時(shí)左右。普通的活菌計(jì)數(shù)和生化分離鑒定方法耗時(shí)2周左右。
2.檢出率高現(xiàn)行的診斷血清不包括所有致瀉型大腸桿菌的血清類型，但是通過(guò)毒素基因的檢測(cè)可以檢測(cè)到診斷血清不能檢測(cè)到的卻攜帶毒素基因的致瀉型E.coli。本試驗(yàn)證明，血清學(xué)玻片凝集反應(yīng)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)陽(yáng)性菌株用多重PGR方法均能檢出含有毒素基因，并且在生化鑒定篩選出的，血清學(xué)玻片凝集反應(yīng)陰性、動(dòng)物致病性試驗(yàn)陽(yáng)性的E.coli疑似菌中也發(fā)現(xiàn)含有攜帶毒素基因的分離菌株。說(shuō)明本法檢測(cè)率高于普通培養(yǎng)法。
3.靈敏度高 本方法靈敏度EPEC、EIEC、ETEC分別為4.3×103、1.5×103、2.6×104CFU/m，低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1×105CFU/ml。
具體實(shí)施例方式 下面舉例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)地描述 1大腸桿菌ETEC、EPEC和EIEC單PCR檢測(cè)方法的建立 1.1細(xì)菌的增菌培養(yǎng) 標(biāo)準(zhǔn)菌株44247(ETEC，O6:K15:H16)、44706(EPEC)、44350(EIEC)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所將ETEC、EPEC和EIEC標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于LB(10％蛋白胨，5％酵母提取物，10％氯化鈉，pH7.5)液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
1.2模板DNA的提取及定量 1.2.1裂解法提取DNA 將36μl LB過(guò)夜培養(yǎng)液，加入4μl(10×TE)液和60μl(2×蛋白酶K)。56℃水浴90min，再95℃水浴10min，10,000×g離心1min，取上清做模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.2.2試劑盒方法提取DNA DNA質(zhì)粒小提試劑盒由北京天為時(shí)代科技有限公司生產(chǎn)。
(1)取1～5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，13,000rpm/min離心1min，盡量吸除上清； (2)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。
(3)向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解。向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻。13,000rpm/min離心10min，用移液器將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中。
(4)將上一步所得上清液加入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，室溫放置1～2min，13,000rpm/min離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
(5)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm/min離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸剛柱重新放回收集管中。
(6)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm/min離心30～60秒，棄掉收集管中的廢液。
(7)將吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000rpm/min離心2min，將吸附柱中殘余的漂汰液去除。
(8)將吸附柱CB3置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，以徹底涼干吸附材料中殘余的漂洗液。
(9)將吸附柱CB3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空清加50～100μl經(jīng)65～70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液TE，室溫放置2min，13,000rpm/min離心1min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
1.2.3DNA定量 (1)紫外可見分光光度計(jì)法進(jìn)行DNA定量 應(yīng)用Spectrun-756P型紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的吸光值。先用去離子水洗4次石英比色皿。將提取的原DNA用去離子水稀釋60倍。將3000μl去離子水的比色杯放入儀器中讀取零值作參照。將稀釋60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)公式 核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280計(jì)算DNA濃度[5]。
(2)計(jì)算LB液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)菌液的細(xì)菌濃度(CFU) 將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液做10倍遞增稀釋，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，吸取該稀釋度1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。及時(shí)將涼至46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使混合均勻。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。按照中國(guó)人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢測(cè)菌落總數(shù)測(cè)定(GB4789.2-94)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。
1.3引物的設(shè)計(jì)與合成 進(jìn)行eaeA、ipaH和ST引物設(shè)計(jì)，各引物均由寶泰克公司合成。引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度 1.4PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)在0.5ml Eppendorf管中進(jìn)行，采用50μl反應(yīng)體系，各反應(yīng)成分為 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.0μl 25mM MgCI33.0μl 引物P1 1.0μl 引物P2 1.0μl DNA模板5.0μl ddH2O 33.5μl TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl Total 50.0μl 引物濃度 1.5PCR反應(yīng)條件 采用熱蓋反應(yīng)，按以下溫度條件進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
1.6 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定 采用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行電泳。瓊脂糖凝膠濃度為2.5％，含溴化乙錠0.25μg/ml，緩沖液為1×TAE，以110V衡壓電泳20min左右行紫外燈下觀察結(jié)果。
1.7特異性片段膠回收 將PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在紫外掃描儀下切下特異性片段，用博日膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收。
1.8 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 在微型離心管中加入下列溶液 pMD18-18T Veceor 0.5μl Control Insert DNA 4.5μl Ligation Solution 5.0μl Total 100.0μl 14℃～16℃反應(yīng)30min。從-70℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)(Dh5 a)。放在冰上使之慢慢熔化，加入10μl的連接產(chǎn)物，用預(yù)冷的Tip頭輕輕混合。放于冰上靜止30min。42℃水浴90S，放于冰上冷卻2～4min。加入200μl液體LB，37℃搖床溫育1h。取出后加X-gal(20mg/ml)35μl。IPTG(100mmol)33μl。在Amp+(60μg/ml)LB固體瓊脂平板上涂菌。置37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)12～16h。次日取出平板放入4℃冰箱顯色。挑取白色菌落搖菌。應(yīng)用質(zhì)粒小提試劑盒提取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌中的質(zhì)粒DNA做模板，進(jìn)行PCR鑒定。
1.9 PCR反應(yīng)特異性片段測(cè)序 將確定為重組、轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的已經(jīng)報(bào)到的毒素基因[gi|2809547|gb|AF043226.1|、gi|24080789|gb|AE005674.1|、gi|148029|gb|M29255.1|ECOTOXHS]序列進(jìn)行同源性比較分析。
判斷PCR產(chǎn)物的特異性。
1.10 PCR敏感性實(shí)驗(yàn) 對(duì)LB過(guò)夜培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)提取DNA的吸光值，計(jì)算其濃度，然后倍倍稀釋，進(jìn)行PCR敏感性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。
2、多重PCR的構(gòu)建與反應(yīng)條件的優(yōu)化 2.1多重PCR反應(yīng)體系 10×PCR buffer 5.0μl 10mM dNTP 1.Oμl 25mM MgCI33.0μl

DNA模板5.0μl ddH2O 29.5μl Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl Total 50.0μl 多重PCR引物濃度說(shuō)明 2.2多重PCR反應(yīng)條件 95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
權(quán)利要求
1、一種牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征是其組成包括
10×PCR buffer 5.0μl
10mM dNTP1.0μl
25mM MgCl2 3.0μl
DNA模板即LB培養(yǎng)菌液提取的DNA 5.0μl
ddH2O 29.5μl
Taq DNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl
Total50.0μl
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征是所述的引物的濃度為
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征是所述的LB培養(yǎng)菌液提取的DNA，是將樣品或作陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化鈉，pH7.5的液體培養(yǎng)基中，200rpm/min、37±1℃搖床培養(yǎng)2.5h，采取裂解法或者試劑盒方法提取的DNA。
4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒，其特征是PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
5、一種牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征是
(1)、細(xì)菌的增菌培養(yǎng)
將ETEC、EPEC和EIEC標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種于LB，即10％蛋白胨、5％酵母提取物、10％氯化鈉，pH7.5的液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
(2)、模板DNA的提取及定量
采取裂解法或者試劑盒方法提取提取DNA；應(yīng)用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的吸光值，先用去離子水洗4次石英比色皿，將提取的原DNA用去離子水稀釋60倍，將3000μl去離子水的比色杯放入儀器中讀取零值作參照，將稀釋60倍后的DNA液加入到石英比色皿中上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)公式核酸(μg/ml)＝62.9×A260-36×A280計(jì)算DNA濃度；將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液做10倍遞增稀釋，選擇2-3個(gè)適宜稀釋度，吸取該稀釋度1ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿，及時(shí)將涼至46℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿10～15ml，同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液的滅菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，按照中國(guó)人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢測(cè)菌落總數(shù)測(cè)定(GB4789.2-94)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；
(3)、引物的設(shè)計(jì)與合成
引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度
(4)、建立單個(gè)PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)在0.5ml Eppendorf管中進(jìn)行，采用50μl反應(yīng)體系，各反應(yīng)成分為
10×PCR buffer 5.0μl
10mM dNTP1.0μl
25mM MgCI3 33.0μl
引物P1 1.0μl
引物P2 1.0μl
DNA模板 5.0μl
ddH2O 33.5μl
TaqDNA聚合酶(5U/L1) 0.5μl
Total50.0μl
引物濃度為
(5)建立多重PCR法應(yīng)體系及反應(yīng)條件
10×PCR buffer 5.0μl
10mM dNTP 1.0μl
25mM MgCl23.0μl
終濃度各1、0.5、1uM引物P1(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl
終濃度各1、0.5、1uM引物P2(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl
DNA模板5.0μl
ddH2O 29.5μl
TaqDNA聚合酶(5U/L1)0.5μl
Total 50.0μl
PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。
6、根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征是所述的裂解法提取DNA是將36μl LB過(guò)夜培養(yǎng)液，加入4μl(10×TE)液和60μl(2×蛋白酶K)，56℃水浴90min，再95℃水浴10min，10,000×g離心1min，取上清做模板，-20℃保存。
7、根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征是所述的試劑盒方法提取DNA是
(1)取1～5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，13,000rpm/min離心1min，盡量吸除上清；
(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀；
(3)向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解。向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，13,000rpm/min離心10min，用移液器將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中；
(4)將上一步所得上清液加入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，室溫放置1～2min，13,000rpm/min離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；
(5)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW，13,000rpm/min離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸剛柱重新放回收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm/min離心30～60秒，棄掉收集管中的廢液；
(7)將吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000rpm/min離心2min，將吸附柱中殘余的漂汰液去除；
(8)將吸附柱CB3置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，以徹底涼干吸附材料中殘余的漂洗液；
(9)將吸附柱CB3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空清加50～100μl經(jīng)65～70℃水浴預(yù)熱的洗脫緩沖液TE，室溫放置2min，13,000rpm/min離心1min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。
全文摘要
本發(fā)明提供的是一種牛奶中致瀉性大腸桿菌PCR快速檢測(cè)試劑盒及其制備方法。試劑盒的組成包括10×PCR buffer5.0μl、10mM dNTP1.0μl、25mM MgCl23.0μl、終濃度各1、0.5、1uM引物P1(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl、終濃度各1、0.5、1uM引物P2(eaeA、ipaH、ST)各1.0μl、DNA模板5.0μl、ddH2O29.5μl、TaqDNA聚合酶(5U/Ll)0.5μl、Total50.0μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，51.3℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。本發(fā)明具有檢測(cè)速度快、檢出率高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1974788SQ200510127340
公開日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者李繼昌, 霍貴成, 張鐵男 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)