專利名稱：一種快速檢測對蝦桃拉病毒試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對蝦養(yǎng)殖中對蝦桃拉病毒快速檢測試劑盒。
對蝦養(yǎng)殖業(yè)是我國海水養(yǎng)殖的支柱性產(chǎn)業(yè)，也是亞洲和美洲許多發(fā)展中國家的支柱性海洋產(chǎn)業(yè)。我國的對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖規(guī)模曾在八十年代末至九十年代初居于世界首位，年產(chǎn)量達(dá)20多萬噸，年產(chǎn)值近百億元，產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，為我國沿海農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。但是，1993年養(yǎng)殖對蝦病害的暴發(fā)性流行，導(dǎo)致了整個(gè)對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重滑坡，1994年我國的養(yǎng)殖對蝦產(chǎn)量僅有4萬噸，不僅對蝦養(yǎng)殖業(yè)本身經(jīng)濟(jì)損失巨大，而且相關(guān)的對蝦加工和外貿(mào)出口等行業(yè)也受到嚴(yán)重影響。近幾年來，我國加強(qiáng)了對蝦病害防治和養(yǎng)殖高新技術(shù)的研究與應(yīng)用，同時(shí)也積極引進(jìn)原產(chǎn)于南美洲的凡納對蝦(Litopenaeus vannamei，俗稱南美白對蝦)和細(xì)角對蝦(Litopenaeus stylirostris，俗稱藍(lán)對蝦)等新的蝦種進(jìn)行養(yǎng)殖，特別是我國華南地區(qū)采用高位池和過濾海水防病養(yǎng)蝦系統(tǒng)等高新技術(shù)進(jìn)行凡納對蝦和斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖取得了顯著的成功，促進(jìn)了我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的迅速回升。1992年桃拉病毒就被證實(shí)是凡納對蝦和細(xì)角對蝦等養(yǎng)殖對蝦的主要病原，可引起高達(dá)90％的累積死亡率，對養(yǎng)殖對蝦業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。由于該病毒粒子微小(直徑30nm)，即使用透射電鏡也很難發(fā)現(xiàn)。
目前全國各地，尤其是我國南方地區(qū)，群眾爭相競養(yǎng)，產(chǎn)業(yè)規(guī)模迅猛擴(kuò)大，但由于在凡納對蝦親蝦和幼體的引進(jìn)過程中，危害嚴(yán)重的桃拉病毒也隨之帶入我國對蝦養(yǎng)殖地區(qū)。目前尚沒有能快速找出桃拉病毒的快速檢測方法以有效控制該病毒的流行。
本發(fā)明的目的是提供一種能快速檢測對蝦桃拉病毒的試劑盒，以快速、靈敏、準(zhǔn)確地判斷各種對蝦苗種、幼蝦、成蝦及親蝦是否攜帶桃拉病毒。
該試劑盒主要由以下幾種試劑組成試劑A組織裂解液；試劑BRNA提取液；試劑C桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其中含有特定引物TSV-R1，其序列為5’-TCACCAGGCAGTCCGGCATAAG；試劑DPCR反應(yīng)液，其中含有特定引物TSV-F1，其序列為5’-CGAAAGTTGGGTACACGGCAGA。
試劑C與試劑D中分別所含的特定引物TSV-R1和TSV-F1，應(yīng)有足夠的含量，一般應(yīng)不少于8pm。
本發(fā)明所提供的對蝦桃拉病毒檢測試劑盒的使用方法如下1.桃拉病毒RNA的提取待檢對蝦組織100-200mg搗碎，依次加入下列溶液500ul試劑A，650ul試劑B，混勻并在冰上放置15’。將每份樣品轉(zhuǎn)至1.5ml的離心管中。在4℃以12000g離心15’。將水相(上層)轉(zhuǎn)至一個(gè)新的1.5ml離心管中。加入500ul異丙醇后-20℃30’沉淀。12000g離心10’。用200ul試劑A。加入200ul異丙醇和60ul乙酸鈉(2mol/l，Ph4)后-20℃30’沉淀。12000g離心20’.用75％乙醇淋洗RNA沉淀然后離心5’。晾干。用50ul無RNA酶的水溶解，得到桃拉病毒RNA溶液。
2.桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄取1ul桃拉病毒RNA溶液加入含試劑C的反應(yīng)管，在PCR儀中進(jìn)行以下反應(yīng)42℃ 30分鐘99℃ 5分鐘5℃5分鐘3.PCR反應(yīng)在以上反應(yīng)管中加入各加入一管試劑D，混勻后在PCR儀中進(jìn)行以下反應(yīng)94℃ 2分鐘 72℃ 5分鐘15℃ 停止反應(yīng)結(jié)束后取5-10ul加4ul溴酚藍(lán)混勻后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，確定擴(kuò)增產(chǎn)物。如出現(xiàn)約360bp的反應(yīng)產(chǎn)物，說明待檢樣品攜帶桃拉病毒。
本發(fā)明的試劑盒，按本發(fā)明所提供的方法，能快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測出各種對蝦苗種、幼蝦、成蝦及親蝦是否攜帶桃拉病毒。已經(jīng)用本發(fā)明對凡納對蝦、細(xì)角對蝦和斑節(jié)對蝦等是否被桃拉病毒感染進(jìn)行檢測，得出有效、可靠的檢測結(jié)果。
實(shí)施例凡納對蝦和細(xì)角對蝦幼苗用對蝦桃拉病毒檢測試劑盒檢測。按該試劑盒提供的方法進(jìn)行檢測試劑A組織裂解液。其組成為4M異硫氰酸，25mM檸檬酸鈉，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.1Mβ-巰基乙醇。
試劑BRNA提取液。其組成為水飽和酚∶氯仿∶2M乙酸鈉＝10∶2∶1。
試劑C桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。每管組成為2mM MgCl2，2ul 10XRNA PCR緩沖液，8.5ul RNase Free dH2O，1mM dNTP Mixture，1u Rnase抑制劑，1u Reverse Transcriptase，10pm TSV-R1試劑DPCR反應(yīng)液。每管組成為2mM MgCl2，8ul 10XRNA PCR緩沖液，64.5ul ddH2O，2u Taq，10pm TSV-F1。
按本發(fā)明所提供的對蝦桃拉病毒檢測試劑盒的使用方法，提取桃拉病毒RNA，桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取5-10ul加4ul溴酚藍(lán)混勻后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)部分幼苗攜帶有桃拉病毒。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測對蝦桃拉病毒試劑盒，其特征在于該試劑盒由以下幾種試劑組成試劑A組織裂解液；試劑BRNA提取液；試劑C桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其中含有特定引物TSV-R1，其序列為5’-TCACCAGGCAGTCCGGCATAAG；試劑DPCR反應(yīng)液，其中含有特定引物TSV-F1，其序列為5’-CGAAAGTTGGGTACACGGCAGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測對蝦桃拉病毒試劑盒，其特征在于所說的試劑C桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，每管組成為2mM MgCl2，2ul 10XRNA PCR緩沖液，8.5ul RNaseFree dH2O，1mM dNTP Mixture，1u Rnase抑制劑，1u Reverse Transcriptase，10pm TSV-R1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測對蝦桃拉病毒試劑盒，其特征在于所說的試劑DPCR反應(yīng)液，每管組成為2mM MgCl2，8ul 10XRNA PCR緩沖液，64.5ul ddH2O，2u Taq，10pm TSV-F1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種快速檢測對蝦桃拉病毒的試劑盒，該試劑盒主要由以下幾種試劑組成試劑A組織裂解液；試劑BRNA提取液；試劑C桃拉病毒RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，其中含有特定引物TSV－R1 5’－TCACCAGGCAGTCCGGCATAAG；試劑DPCR反應(yīng)液，其中含有特定引物TSV－F1 5’－CGAAAGTTGGGTACACGGCAGA。使用本試劑盒，按本發(fā)明所提供的方法，可快速、靈敏、準(zhǔn)確地檢測并判斷各種對蝦苗種、幼蝦、成蝦及親蝦是否攜帶桃拉病毒。
文檔編號C12Q1/70GK1410550SQ0112787
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者沈琪, 胡超群, 任春華, 張呂平 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所