專利名稱：人類免疫缺陷病毒抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種HIV抗體和抗 原聯(lián)合快速檢測(cè)的免疫層析試劑盒。
背景技術(shù)：
獲得性免疫缺陷綜合癥(Acquired Immunodeficiency synd畫e。 AIDS) 簡(jiǎn)稱艾滋病，是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV) 感染引起的一種嚴(yán)重傳染病。自美國(guó)1981年診斷出首例艾滋病患者以來， 據(jù)最新的WHO數(shù)據(jù)評(píng)估，至2007年底，全球估計(jì)共有3300萬艾滋病病毒 感染者，中國(guó)國(guó)內(nèi)有艾滋病病毒感染者約70萬。
艾滋病病毒的傳播途徑主要包括血液傳播、性接觸、毒品注射和母嬰傳 播。在人體內(nèi)的潛伏期平均為7 10年。HIV感染潛伏期病人沒有明顯的臨 床癥狀，但具有高虔的傳染性。對(duì)HIV進(jìn)行檢測(cè)以發(fā)現(xiàn)傳染源和切斷傳播 途經(jīng)是防制AIDS最有效的手段。HIV免疫學(xué)檢測(cè)是最有效和最廣泛使用的 方法，HIV抗體篩查是我國(guó)法定的的四個(gè)血源性篩查項(xiàng)目之一。
HIV抗體檢測(cè)最常用的試劑為HIV抗體酶聯(lián)免疫試劑(ELISA)和膠體金 類試劑，采用雙抗原夾心法的第三代HIV抗體診斷試劑盒，靈敏度達(dá)到99% 以上，特異性大于97%。最短在HIV感染后十余天即可檢測(cè)出陽性。但由于 部分HIV感染在5-8個(gè)月才出現(xiàn)抗體，世界衛(wèi)生組織(WHO)將HIV感染的窗 口期定為6個(gè)月。HIV在窗口期內(nèi)已具有傳染性，為了進(jìn)一步減少窗口期傳 染情況的發(fā)生，目前國(guó)際上已出現(xiàn)了第四代HIV診斷試劑盒，試劑盒采用 了 HIV抗體和HIV p24抗原同時(shí)檢測(cè)的方法，能較HIV感染后抗體轉(zhuǎn)陽前4 一7天檢測(cè)HIV的感染。HIV感染后，最早出現(xiàn)的是p24抗原，然后才出現(xiàn) 相應(yīng)的特異性抗HIV抗體，隨抗體滴度的升高p24逐漸下降至檢測(cè)不出。在 病情發(fā)展后期p24抗原在血中又可檢測(cè)出，另外P24抗原的檢測(cè)適合對(duì)嬰 兒HIV感染的診斷。
到目前為止HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)主要應(yīng)用于ELISA試劑盒，尚無抗 原抗體聯(lián)合檢測(cè)的免疫層析膠體金類試劑盒出現(xiàn)。徐克沂等雖然發(fā)表了 "同 時(shí)檢測(cè)HIV抗體及p24抗原快速診斷試劑的研制"[徐克沂，張永新，王瑛 等，同時(shí)檢測(cè)HIV抗體及p24抗原快速診斷試劑的研制，中華實(shí)驗(yàn)和臨床 病毒學(xué)雜志，2002,16(4)377-279]，但采用并非免疫層析方法，實(shí)際方法 和ELISA的檢測(cè)方法類似，整個(gè)檢測(cè)過程分為多步，檢測(cè)時(shí)間超過l小時(shí)， 不符合快速診斷試劑的標(biāo)準(zhǔn)。膠體金類試劑的檢測(cè)原理如下利用膠體金
4標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè) 時(shí)當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體
相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成 肉眼可見的檢測(cè)(T)線，通過檢測(cè)線的有無實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定。HIV膠體金 類免疫層析快速診斷試劑具有ELISA不具備的優(yōu)勢(shì)檢測(cè)快速5-30分鐘 即出結(jié)果，操作簡(jiǎn)便，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，試劑的穩(wěn)定性好。 發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、靈敏度 和特異性高、適合于臨床診斷或篩査用的HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)免 疫層析試劑盒。技術(shù)方案如下 一種人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原 聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，包括盒蓋、盒底，其特征在于在盒蓋19的前面左側(cè) 設(shè)置兩個(gè)同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū)孔24，在B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示 25，在加樣標(biāo)示22,加樣標(biāo)示25的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)A加樣孔20， B加樣孔 21;在盒底31左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋D，在盒底31右側(cè)設(shè)置 兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋C，試紙A9的上樣墊1對(duì)應(yīng)A加樣孔20的位置 裝入盒底31的組合支撐肋C、組合支撐肋D上，將試紙BIO的上樣墊(14) 對(duì)應(yīng)B加樣孔(23)的位置裝入盒底(31)的組合支撐肋C、組合支撐肋D 上，盒蓋19上的所有凸柱27插入盒底31上的凸起孔35中，即為HIV抗 體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18;
還在于所述的試紙A9包括上樣墊1與緊密連接于所述上樣墊1 一端的 含有標(biāo)記HIV抗原gp41、 gp36的膠體金墊2、與所述膠體金墊2的另一端 緊密連接的硝酸纖維素NC膜3和緊密連接于所述NC膜3另一端的吸樣墊4， 所述NC膜包被有相互分離的檢測(cè)線5、 6和質(zhì)控線7，所述檢測(cè)線為包被在 NC膜上的HIVgp41、 gp36抗原，所述質(zhì)控線為包被在NC膜上的抗HIV抗原 的抗體，所述上樣墊1、膠體金墊2、 NC膜2和吸樣墊4粘貼到塑料支撐板 8上形成試紙A9;
試紙B(10)和試紙A結(jié)構(gòu)基本相同，但膠體金墊15為抗HIV p24抗體， 檢測(cè)線13為抗HIV p24抗體，質(zhì)控線12為抗鼠IgG抗體。
試劑盒的上樣墊為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。 試劑盒試紙A抗原的包被方法為以0. 01M pH 9. 0碳酸鹽緩沖液(CBS) 分別將gp41、 gp36抗原配制成lmg/ml、 0. 5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC 膜下部以lul/cm的參數(shù)分別劃線，包被T1， T2線，同時(shí)在NC膜上部包被 抗HIV抗體作為C線。試紙B包被方法為以0. 01M pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗p24抗體配制成1.5mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以 lul/cm的參數(shù)劃線，包被T3線，同時(shí)在NC膜上部包被鼠IgG抗體作為C 線。劃線后將NC膜在干燥間，溫度20-25。C，濕度小于30%，干燥8-10小 時(shí)，備用。
制備標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑 為30 — 50nm的膠體金溶液，制備完成后取100ml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用 0. 2M K2C03調(diào)至pH9. 0，按100ml膠體金溶液分別加入lmg抗原或抗體，室 溫?cái)嚢?小時(shí)，加入P/oBSA， 0. 1%PEG 20000，封閉20min， 12000r/m離心 30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml，按lml溶液鋪22cm2的比 例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無紡布上，再置干燥間(溫度20-25t:，濕度小 于30%)干燥2-4小時(shí)，制成膠體金墊，備用。
試紙條的裝配方法為在干燥室內(nèi)(溫度20-25。C，濕度小于30%)， 取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板板的中部粘貼，在NC 膜T線一側(cè)搭接膠棘金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭 接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸 樣墊的1/10);試紙A和試紙B的區(qū)別為試紙A所用的膠體金墊標(biāo)記的 為HIV gp41、 gp36抗原，NC膜包被的為HIV gp41、 gp36抗原，試紙B用 的膠體金墊標(biāo)記的為抗HIV p24抗體，NC膜包被的為抗HIV p24抗體。最 后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3皿寬的試紙條。切好的試紙A和試紙B平 行裝入塑料盒，形成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒。
試劑盒的檢測(cè)方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試劑盒平放， 由加樣孔在試紙A和試紙B上樣墊上分別加入50 — 100ul被檢樣品，樣品 溶解膠體金并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在30分鐘內(nèi).C、 T線的 出現(xiàn)情況，并判定檢測(cè)結(jié)果。若試紙A出現(xiàn)T線，說明樣品中含有抗HIV 抗體，若試紙B出現(xiàn)T線，說明樣品中含有HIV p24抗原。若T線不出現(xiàn)，
說明樣品為陰性或含量低于試劑盒的最低檢測(cè)限。
人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18是由盒蓋19、 盒底31構(gòu)成，盒蓋19、盒底31均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋19、 盒底31均是兩個(gè)長(zhǎng)方形盒狀體。
盒蓋19的長(zhǎng)、寬、高以試紙A9、試紙B10的長(zhǎng)、寬、高配合設(shè)置，在 盒蓋19的前面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的長(zhǎng)方形孔為B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反 應(yīng)區(qū)孔24，在B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)箭頭形狀 的凸起為加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25，在加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25的右側(cè) 各設(shè)置一個(gè)圓形孔為A加樣孔20， B加樣孔21;在盒蓋19的后面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū) 孔24左側(cè)邊緣各設(shè)置兩個(gè)同樣大小的凸柱28、凸柱29，在B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)縱向各設(shè)置兩條同樣長(zhǎng)、寬、高的凸起為肋26、肋30， 在盒蓋19的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個(gè)凸柱27，凸柱27高比凸柱28、凸 柱29的高度要高。
在盒底31左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋D，組合支撐肋D是由 類似"["形狀的凸起肋36，在凸起肋36兩側(cè)外邊緣橫向，向右各設(shè)置一 個(gè)凸起肋37，在凸起肋37里邊緣向右設(shè)置一向右各設(shè)置一"]"形狀的凸 起肋39，在凸起肋39右側(cè)縱向各設(shè)置兩個(gè)同樣大小的凸起肋40;在盒底 31右側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋C，組合支撐肋C是由類似"["形 狀的凸起肋32，凸起肋32的高度是由左向右逐漸降低形成的，在凸起肋 32里側(cè)內(nèi)縱向設(shè)置兩個(gè)同樣大小的兩個(gè)凸起肋33，個(gè)凸起肋32右側(cè)外邊 緣設(shè)置一個(gè)"]"形狀的凸起肋34，在盒底31的邊緣有間隔地設(shè)置多個(gè)凸 柱27，凸柱27高比凸柱28、凸柱29的高度要高的后面邊緣有間隔地設(shè)置 多個(gè)凸起孔35，以便與在盒蓋19的上的凸柱27配合連接。
本實(shí)用新型的有益效果如下采用HIV抗體和抗原聯(lián)合檢測(cè)，使目前 的HIV膠體金類診斷試劑由第三代進(jìn)入第四代，能提高HIV的檢出率，縮 短HIV檢測(cè)的窗口期，達(dá)到和第四代HIV ELISA診斷試劑盒類似的效果， 同時(shí)保持膠體金試劑適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，5-30分鐘即出結(jié)果，操作簡(jiǎn)單，試劑 的穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
本試劑盒采用了試紙A和試紙B裝入同一個(gè)塑料盒中，分別檢測(cè)HIV 的抗體和抗原。雖然采用了兩條試紙，但檢測(cè)時(shí)只需要直接加入被檢樣品， 并不增加檢測(cè)的步驟和復(fù)雜性。而釆用兩條試紙，極大地減少了產(chǎn)品研制 的復(fù)雜性試紙A用于HIV抗體的檢測(cè)在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上不用作任何的 改變[李洲，人類免疫缺陷病毒(HIV)l+2型抗體三條線快速檢測(cè)板，中國(guó)專 利(公開)號(hào)CN2501049]。單獨(dú)研制出HIV P24抗原檢測(cè)試紙就可以實(shí)現(xiàn) 同時(shí)對(duì)HIV抗體和抗原的聯(lián)合檢測(cè)。而在ELISA試劑盒中，由于要將HIV 抗原和抗體包被在同一個(gè)酶標(biāo)板孔中，常常引起產(chǎn)品的靈敏度的明顯下降， 需要改變各自的工藝，增加了產(chǎn)品制造的難度，到目前為止，同時(shí)檢測(cè)HIV 抗體和抗原的ELISA試劑的靈敏度都低于相應(yīng)的單獨(dú)檢測(cè)試劑。


圖1試紙A結(jié)構(gòu)示意圖。 圖2試紙B結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3 HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒蓋主視圖。圖4 HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒蓋后視圖。 圖5 HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒底俯視圖。
附圖符號(hào)說明
1:上樣墊2:膠體金墊
3: NC膜4:吸樣墊
5: gp41檢測(cè)線6: gp36檢測(cè)線
7:質(zhì)控線(C)8:塑料支撐板
9:試紙A10:試紙B
11:吸樣墊12:質(zhì)控線(C)
13: P24檢測(cè)線(T3)14:上樣墊
15膠體金墊16: NC膜
17-塑料支撐板18:試劑盒
19: "^蓋20: A加樣孔
21: B加樣孔22:加樣標(biāo)示
23: B反應(yīng)區(qū)孔24: A反應(yīng)區(qū)孔
25:加樣標(biāo)示26:肋
27:凸柱28:凸柱
29:凸柱30:肋
31:盒底32:凸起肋
33:凸起肋34:凸起肋
35:凸柱36:凸起肋
37:凸起肋38:凸起肋
39:凸起肋40:凸起肋
C:組合支撐肋D:組合支撐肋
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)檢測(cè)試紙A9 、試紙B10的制備 1主要材料
l.l重組抗原:HIV gp41、 gp36:美國(guó)Biotech Atlantic Inc(BAI.)產(chǎn)品， 用于試紙A的包被和標(biāo)記；抗HIVP24抗體配對(duì)BAI公司產(chǎn)品，用于試紙 B的包被和標(biāo)記；氯金酸Sigma公司產(chǎn)品，NC膜Millipore公司產(chǎn)品； BSA， PEG 20000，水解酪蛋白Sigma產(chǎn)品。其它常用試劑均為分析純?cè)噭?1.2 HIV抗體國(guó)家參考品(膠體金類)中國(guó)藥品生物制品檢定所檢研制。 包括20份陽性血清，20份陰性血清，3份靈敏度血清，l份精密度血清。 HIV1 P24抗原國(guó)家參考品，包括括10份陽性血清，20份陰性血清，10份靈敏度血清，2份精密度血清。 2方法
2.1 HIV抗原、抗體的膠體金標(biāo)記氯金酸一檸檬酸三鈉還原法制備直徑 為40nm的膠體金溶液，制備完成后取3份膠體金溶液，用分別用0. 2M K2C03 將溶液調(diào)到pH7.0、 pH8.0和pH9.0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪 拌，按每100ml溶液加入0. 5mg、 lmg、 1. 5mg將重組抗原或抗體緩慢滴加 到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌l小時(shí)，再滴加入到終濃度為0. 1%的PEG2000 和1。/o的BSA封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000 r/m離心，棄上清，沉淀按 原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液(Tris緩沖液，含BSA、水解酪蛋白， 蔗糖和表面活性劑)中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按lml溶液鋪22cm2的比例 加樣于無紡布上，在干燥間(溫度20-25°C ，濕度小于30%)干燥2-4小時(shí)， 制成膠體金墊，干燥備用。
2.2 HIV抗原與抗體的包被在試紙A中，以0.01MpH9.0的CBS分別將 gp41、 gp36抗原配制成0.5mg/ml、 lmg/ml、 1. 5 mg/ml的溶液，用噴膜儀 在NC膜下部以lul/cm的參數(shù)分別劃線，包被T1， T2線，同時(shí)在NC膜上 部包被抗HIV抗體作為C線。試紙B包被方法為以0. 01M pH 7. 2 PBS將 抗P24抗體配制成0.5mg/ml、 lmg/ml、 1. 5 mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC 膜下部以lul/cm的參數(shù)劃線，包被T3線，同時(shí)在NC膜上部包被抗鼠IgG 抗體作為C線。劃線后將NC膜在干燥間(溫度20-25°C ，濕度小于30%)干 燥8-10小時(shí)，備用。
2.3 HIV快速診斷試紙條的組裝在干燥室內(nèi)(溫度20-25'C，濕度小于 30%)，取塑料支撐板板，將已包被韻NC膜放置在塑料支撐板板的中部粘 貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/3)粘貼，在膠體金 墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5);在NC膜C線一側(cè)搭接吸 樣墊(搭吸樣墊的1/10);試紙A和試紙B的區(qū)別為試紙A所用的膠體 金墊標(biāo)記的為HIV gp41、 gp36抗原，NC膜包被的為HIV gp41、 gp36抗原， 試紙B用的膠體金墊標(biāo)記的為抗HIV p24抗體，NC膜包被的為抗HIV p24 抗體。然后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3mm寬的試紙條。切好的試紙A和 試紙B平行裝入塑料盒，形成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒。
2.4檢測(cè)方法將缺檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑 盒平放，檢測(cè)時(shí)，在試紙A和B上樣墊上分別加入50 — 100ul被檢樣品， 若樣品中含抗HIV抗體、P24抗原，則和樣品墊上的標(biāo)記的膠體金結(jié)合，形 成復(fù)合物，并擴(kuò)散到NC膜上進(jìn)一步層析，當(dāng)遇到包被在NC膜上T線處的 配對(duì)抗原、P24抗體時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗原、P24抗體結(jié)合，被捕獲在包被處，當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，則形成肉眼可見的T
線。若試紙A出現(xiàn)T線，說明樣品中含有抗HIV抗體，若試紙B出現(xiàn)T線， 說明樣品中含有HIV p24抗原。若T線不出現(xiàn)，說明樣品為陰性或含量低 于試劑盒的最低檢測(cè)限。C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽性和陰性樣品檢測(cè)時(shí) 均會(huì)出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在15、 20、 30和45分鐘內(nèi)C、 T線的出現(xiàn)情況， 并判定檢測(cè)結(jié)果。
2.5反應(yīng)體系工藝評(píng)價(jià)方法不同參數(shù)制備的試劑研制小樣后，以HIV抗 體國(guó)家參考品(膠體金類)、HIV1 P24抗原國(guó)家參考品為質(zhì)控，進(jìn)行檢測(cè)， 確定最佳的產(chǎn)品反應(yīng)體系和工藝路線。 3結(jié)果
根據(jù)小樣的檢測(cè)結(jié)果，確定了試紙的最佳標(biāo)記HIV抗原、抗體pH值為 為9.0;最佳標(biāo)記量均為lmg每100ml膠體金溶液；最佳的膠體工作液為 50mMTris緩沖液，pH9. O，含O. 5%BSA、 1%的水解酪蛋白、2%蔗糖和0. 2% Tween 20;最佳的gp41抗原包被濃度為lmg/ml， gp36抗原包被濃度為0. 5mg/ml， P24抗體包被濃度為1. 5mg/ml。檢測(cè)結(jié)果的最佳判定時(shí)間為在5-30分鐘內(nèi) 判定。
實(shí)施例2: HIV抗體抗原聯(lián)合快速診斷試劑盒的性能分析 1主要材料
1.1 HIV抗體抗原聯(lián)合快速診斷試劑盒制備方法見實(shí)施例一；
1.2 HIV抗體、抗原國(guó)家參考品中國(guó)藥品生物制品檢定所檢研制，說明 見實(shí)施例一；
1.3含干擾物血清包括常見干擾物高血脂、溶血、黃疸血清各10份， 含相關(guān)傳染病HAV、 HBV、 HIV、 TP和HP抗體陽性血清各10份，含不同抗 凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿各10份，由本公司在天津地區(qū)相關(guān)醫(yī)院收 集驗(yàn)證并保存，以上血清或血漿經(jīng)兩種以上ELISA檢測(cè)均為HIV抗體和抗 原陰性血清。
1.4臨床血清HIV陽性血清600份，由公司在天津地區(qū)相關(guān)醫(yī)院收集， 為門診采集檢驗(yàn)用血清，經(jīng)兩種以上ELISA檢測(cè)均為HIV抗體和抗原陰性 血清。HIV陽性血清20份，由公司在相關(guān)AIDS?？漆t(yī)院獲得，確證為HIV 抗體陽性血清，已滅活。 2方法
2.1樣品檢測(cè)方法見實(shí)施例一，在30分鐘內(nèi)判定檢測(cè)結(jié)果。
2.2 HIV抗體國(guó)家參考品(膠體金類)檢測(cè)取出HIV抗體國(guó)家參考品(膠
體金類)血清盤，平衡到室溫后用本試紙進(jìn)行檢測(cè)。
102.3 HIV1P24抗原國(guó)家參考品的檢測(cè)取出國(guó)家參考品血清盤，平衡到室 溫后用本試紙進(jìn)行檢測(cè)。
2.4分析特異性評(píng)估用試紙對(duì)公司保存的含干擾物樣品進(jìn)行檢測(cè)。 2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)將本試紙?jiān)谑覝貤l件下保存，在l、 3、 6、 12、 18個(gè)月 取出部分試紙，以國(guó)家參考品進(jìn)行測(cè)試；將本試紙置于37'C、 5(TC條件下， 每隔7天取出部試紙，以國(guó)家參考品進(jìn)行測(cè)試。
2.6臨床樣品評(píng)估由企業(yè)從相關(guān)醫(yī)院收集臨床血清，用本試劑盒進(jìn)行檢 領(lǐng)U，若遇到檢測(cè)陽性樣品，再以兩種以上商用ELISA試劑進(jìn)行檢測(cè)，以確 證結(jié)果。 3結(jié)果
3.1 HIV抗體國(guó)家參考品(膠體金類)檢測(cè)對(duì)國(guó)家參考品(膠體金類) 血清盤進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果和預(yù)期完全一致(表l)，通過國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。 表l本試劑盒對(duì)HIV抗體國(guó)家參考品(膠體金類)的測(cè)試結(jié)果
檢驗(yàn)項(xiàng)目
標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定
HIV ( + )
20
20/20
20/20
HIV ( — )
20
》18/20
20/20
精密性樣品
1
+
+
靈敏度樣品
51
52
53
+ +
+ +
3.2 HIV1P24抗原國(guó)家參考品檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果表明能通過國(guó)家參考品陰性 和陽性參考品的檢測(cè)，P24抗原檢測(cè)靈敏度至10U/ml (表2)。 表2本試劑盒對(duì)HIV1 P24國(guó)家參考品的測(cè)試結(jié)果
檢驗(yàn)項(xiàng)目
標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定
檢測(cè)結(jié)果
P24 ( + )
10
10/10
10/10
HIV ( — )
20
20/20
20/20
精密性樣品L
P24單獨(dú)檢測(cè)參考品
+
未做
精密性樣品V 聯(lián)合檢測(cè)參考品
1
+
+
靈敏度樣品
L1-L10 ELISA檢測(cè)至10U/ml及以
20-0.078U/ml 10U/ml 上為陽性
3. 3分析特異性評(píng)估檢測(cè)結(jié)果表明本試紙對(duì)常見干擾物高血脂、溶血-黃疸血清檢測(cè)均為陰性，對(duì)含相關(guān)傳染病HAV、 HBV、 HIV、 TP和HP抗體陽 性血清檢測(cè)均為陰性，對(duì)含不同抗凝劑肝素、EDTA和枸椽酸鈉血漿檢測(cè)均 為陰性。說明對(duì)以上物質(zhì)沒有非特異性反應(yīng)。
3.4穩(wěn)定性分析本試紙?jiān)谑覝貤l件下保存，用國(guó)家參考品進(jìn)行測(cè)試；1、 3、 6、 12個(gè)月?lián)鞙y(cè)均能通過測(cè)試，結(jié)果無顯著性差異。37"C條件下加速破 壞性試驗(yàn)，共檢測(cè)到6周，5(TC條件下加速破壞性試驗(yàn)，共檢測(cè)到3周， 均能通過測(cè)試，試紙性能無顯著下降。根據(jù)加速破壞試驗(yàn)結(jié)果，試紙的穩(wěn) 定性在室溫條件下應(yīng)該在18個(gè)月以上。
3.5臨床樣品試驗(yàn)共檢測(cè)了企業(yè)收集的臨床樣品600份，本試劑共檢測(cè) 出陽性8份，經(jīng)ELISA試劑復(fù)檢為陰性。特異性=592/600=98.7%。 20份陽性血清檢測(cè)均為陽性，靈敏度為二20/20二100 實(shí)施例3:制備HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18:
圖3 HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒蓋主視圖。圖4 HIV抗體和 抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒蓋后視圖。圖5 HIV抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試 劑盒底俯視圖。如圖3、圖4、圖5所示，人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體 和抗原聯(lián)合快速試劑盒18是由盒蓋19、盒底31構(gòu)成，盒蓋19、盒底31 均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋19、盒底31均是兩個(gè)長(zhǎng)方形盒狀體。
盒蓋19的長(zhǎng)、寬、高以試紙A9、試紙B10的長(zhǎng)、寬、高配合設(shè)置，在 盒蓋19的前面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的長(zhǎng)方形孔為B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反 應(yīng)區(qū)孔24，在B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)箭頭形狀 的凸起為加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25，在加樣標(biāo)示22，加樣標(biāo)示25的右側(cè) 各設(shè)置一個(gè)圓形孔為A加樣孔20, B加樣孔21;
在盒蓋19的后面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū) 孔24左側(cè)邊緣各設(shè)置兩個(gè)同樣大小的凸柱28、凸柱29，在B反應(yīng)區(qū)孔23 、 A反應(yīng)區(qū)孔24的右側(cè)縱向各設(shè)置兩條同樣長(zhǎng)、寬、高的凸起為肋26、肋30， 在盒蓋19的后面邊緣有間隔地設(shè)置多個(gè)凸柱27，凸柱27高比凸柱28、凸 柱29的高度要高。
在盒底31左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋D，組合支撐肋D是由類 似"["形狀的凸起肋36，在凸起肋36兩側(cè)外邊緣橫向，向右各設(shè)置一個(gè) 凸起肋37，在凸起肋37里邊緣向右設(shè)置一向右各設(shè)置一"]"形狀的凸起 肋39，在凸起肋39右側(cè)縱向各設(shè)置兩個(gè)同樣大小的凸起肋40;在盒底31 右側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋C，組合支撐肋C是由類似"["形狀 的凸起肋32，凸起肋32的高度是由左向右逐漸降低形成的，在凸起肋32 里側(cè)內(nèi)縱向設(shè)置兩個(gè)同樣大小的兩個(gè)凸起肋33，個(gè)凸起肋32右側(cè)外邊緣設(shè)置一個(gè)"]"形狀的凸起肋34，在盒底31的邊緣有間隔地設(shè)置多個(gè)凸柱 27，凸柱27高比凸柱28、凸柱29的高度要高的后面邊緣有間隔地設(shè)置多 個(gè)凸起孔35，以便與在盒蓋19的上的凸柱27配合連接。
本實(shí)用新型試劑盒的組裝方法將試紙A9的上樣墊1對(duì)應(yīng)A加樣孔20 的位置裝入盒底31的組合支撐肋C、組合支撐肋D上，將試紙B10的上樣 墊14對(duì)應(yīng)B加樣孔23的位置裝入盒底31的組合支撐肋C、組合支撐肋D 上，然后將盒蓋19上的所有凸柱27插入盒底31上的凸起孔35中，即為 完成HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒18的組裝。
權(quán)利要求1、一種人類免疫缺陷病毒抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)試劑盒，包括盒蓋、盒底，其特征在于在盒蓋(19)的前面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)，在B反應(yīng)區(qū)孔(23)、A反應(yīng)區(qū)孔(24)的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)，在加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)A加樣孔(20)，B加樣孔(21)；在盒底(31)左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋(D)，在盒底(31)右側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋(C)，試紙A(9)的上樣墊(1)對(duì)應(yīng)A加樣孔(20)的位置裝入盒底(31)的組合支撐肋(C)、組合支撐肋(D)上，將試紙B(10)的上樣墊(14)對(duì)應(yīng)B加樣孔(23)的位置裝入盒底(31)的組合支撐肋(C)、組合支撐肋(D)上，盒蓋(19)上的所有凸柱(27)插入盒底(31)上的凸起孔(35)中，即為HIV抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒(18)；還在于所述的試紙A(9)包括上樣墊(1)與緊密連接于所述上樣墊(1)一端的含有標(biāo)記HIV抗原gp41、gp36的膠體金墊(2)、與所述膠體金墊(2)的另一端緊密連接的硝酸纖維素NC膜(3)和緊密連接于所述NC膜(3)另一端的吸樣墊(4)，所述NC膜包被有相互分離的檢測(cè)線(5)、(6)和質(zhì)控線(7)，所述檢測(cè)線為包被在NC膜上的HIVgp41、gp36抗原，所述質(zhì)控線為包被在NC膜上的抗HIV抗原的抗體，所述上樣墊(1)、膠體金墊(2)、NC膜(2)和吸樣墊(4)粘貼到塑料支撐板(8)上形成試紙A(9)；試紙B(10)和試紙A結(jié)構(gòu)基本相同，但膠體金墊(15)為抗HIV p24抗體，檢測(cè)線(13)為配對(duì)的抗HIV p24抗體，質(zhì)控線(12)為抗鼠IgG抗體。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè) 試劑盒，其特征在于，試紙A(10)標(biāo)記和包被用抗原為重組表達(dá)HIV抗原 gp41、 gp36，亦可再增加或替換為HIV其它特異性抗原gp160、 gpl20、 P24 及0亞型gp41等，試紙B標(biāo)記和包被用抗體為抗HIV p24抗體。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè) 試劑盒，其特征在于所述的上樣墊(l) (14)為玻璃纖維膜或無紡布，吸樣 墊(4) (ll)由吸水濾紙構(gòu)成。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人類免疫缺陷病毒抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè) 試劑盒，其特征在于所述的試劑盒(18)的盒蓋(11)、盒底(20)均是 采用塑料注塑一體形成的，盒蓋(11)、盒底(20)均是兩個(gè)上角為圓弧 形狀的長(zhǎng)條形狀且其下邊中部設(shè)置向上的方形凹陷；人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速試劑盒(18)是由盒蓋(19)、盒底(31)構(gòu) 成，盒蓋(19)、盒底(31)均是采用塑料注塑一體形成的，盒蓋(19)、盒底(31均是兩個(gè)長(zhǎng)方形盒狀體。盒蓋(19)的長(zhǎng)、寬、高以試紙A (9)、試紙B (10)的長(zhǎng)、寬、高 配合設(shè)置，在盒蓋(19)的前面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的長(zhǎng)方形孔為B反 應(yīng)區(qū)孔(23) 、 A反應(yīng)區(qū)孔(24)，在B反應(yīng)區(qū)孔(23) 、 A反應(yīng)區(qū)孔(24) 的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)箭頭形狀的凸起為加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)， 在加樣標(biāo)示(22)，加樣標(biāo)示(25)的右側(cè)各設(shè)置一個(gè)圓形孔為A加樣孔 (20) ， B加樣孔(21);在盒蓋(19)的后面左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的B反應(yīng)區(qū)孔(23) 、 A 反應(yīng)區(qū)孔(24)左側(cè)邊緣各設(shè)置兩個(gè)同樣大小的凸柱(28)、凸柱(29)， 在B反應(yīng)區(qū)孔(23) 、 A反應(yīng)區(qū)孔(24)的右側(cè)縱向各設(shè)置兩條同樣長(zhǎng)、 寬、高的凸起為肋(26)、肋(30)，在盒蓋(19)的后面邊緣有間隔地 設(shè)置多個(gè)凸柱(27)，凸柱(27)高比凸柱(28)、凸柱(29)的高度要 高。在盒底(31)左側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐肋(D)，組合支撐肋 (D)是由類似"["形狀的凸起肋(36),在凸起肋(36)兩側(cè)外邊緣橫 向，向右各設(shè)置一個(gè)凸起肋(37)，在凸起肋(37)里邊緣向右設(shè)置一向右 各設(shè)置一 "]"形狀的凸起肋(39),在凸起肋(39)右側(cè)縱向各設(shè)置兩個(gè) 同樣大小的凸起肋(40);在盒底(31)右側(cè)設(shè)置兩個(gè)同樣大小的組合支撐 肋(C)，組合支撐肋(C)是由類似"["形狀的凸起肋(32)，凸起肋(32) 的高度是由左向右逐漸降低形成的，在凸起肋(32)里側(cè)內(nèi)縱向設(shè)置兩個(gè) 同樣大小的兩個(gè)凸起肋(33)，個(gè)凸起肋(32)右側(cè)外邊緣設(shè)置一個(gè)"]"形 狀的凸起肋(34)，在盒底(31)的邊緣有間隔地設(shè)置多個(gè)凸柱(27)，凸 柱(27)高比凸柱(28)、凸柱(29)的高度要高的后面邊緣有間隔地設(shè)置 多個(gè)凸起孔(35)，以便與在盒蓋(19)的上的凸柱(27)配合連接。
專利摘要本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人類免疫缺陷病毒(HIV)抗體和抗原聯(lián)合快速檢測(cè)的免疫層析試劑盒。試劑盒由兩條獨(dú)立的試紙A、B和存放試紙的塑料盒C組成，試紙A用于檢測(cè)HIV抗體。試紙B用于檢測(cè)HIV p24抗原。將試紙A和試紙B平行裝入塑料盒中組成試劑盒。檢測(cè)時(shí)將被檢樣品加在試紙條的上樣墊上，然后直接觀察免疫反應(yīng)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。本試劑盒用于HIV感染的篩查或臨床診斷，同時(shí)檢測(cè)HIV抗體和抗原，較單純的抗體檢測(cè)能有效縮短HIV檢測(cè)的窗口期，具有反應(yīng)快速、操作簡(jiǎn)便、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK201331527SQ200820074600
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2008年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者洲 李, 楊發(fā)青 申請(qǐng)人:天津中新科炬生物制藥有限公司