專利名稱：快速檢測牛γ干擾素的試劑條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測牛Y干擾素的試劑條及其制備方法。
背景技術(shù)：
1.膠體金快速診斷技術(shù)的原理
膠體金(Colloidal gold),是由金離子還原而成的許多單個金顆粒組成的懸乳液，膠體 金顆粒是有一個基礎(chǔ)的晶核(原子金周圍包含有11個金原子的二十面體)及包圍在外的雙 離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子(AuCl2一)，外層離子層H+則分散在膠體間 溶液(見圖l)。金顆粒表面所包圍的陰性電荷層，叫做zata電位，可以使膠體金顆粒之間 相互排斥而使懸浮液保持穩(wěn)定。
膠體金顆粒可以從5 150nm不等，制備膠體金仍基于還原法，常用的有鞣酸、檸檬酸 三鈉、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等各種有機或無機化合物。還原劑的濃度和還原力越高， 那么所合成的膠體金顆粒就越小。膠體金2 5nm是桔黃色，10 20nm是酒紅色，大顆粒 30 64nm是深紅色。小分子的膠體金顆粒基本上是圓球形，30~80nm為偏心圓形。
膠體金標(biāo)記，實質(zhì)上就是蛋白質(zhì)等高分子物質(zhì)被吸附到膠體金顆粒表面的過程。蛋白 質(zhì)與金顆粒的結(jié)合機制大概有以下幾個方面帶負(fù)電荷的金顆粒與蛋白質(zhì)上的帶正電的氨 基反應(yīng)；其次，蛋白質(zhì)通過疏水作用吸附于金顆粒表面；配位鍵是通過蛋白質(zhì)中半胱氨酸 的硫殘基與金顆粒的電子層發(fā)生配位結(jié)合。在標(biāo)記后需要加入一定量的穩(wěn)定劑，常用的穩(wěn) 定劑有牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、明膠和干酪素等封閉金顆粒未被占據(jù)的位點
以減少非特異性反應(yīng)并穩(wěn)定懸膠溶液。
膠體金免疫快速診斷技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術(shù)、 層析分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上完善起來的一項固相標(biāo)記新型免疫檢 測技術(shù)。膠體金快速診斷技術(shù)是以膠體金作為示蹤物或顯色劑，將膠體金標(biāo)記在抗體上， 再利用抗原抗體的血清學(xué)反應(yīng)原理，把金顆粒連接到抗原上，當(dāng)抗原抗體反應(yīng)處達到一定密度時(即金顆粒l(^個/mm2)，出現(xiàn)肉眼可見的紅色斑點。膠體金標(biāo)記抗體實質(zhì)是抗體被 吸附到膠體金顆粒表面的過程，且這種吸附屬于物理吸附，對抗體的生物活性影響很小， 易獲得較高的標(biāo)記率；另外膠體金不屬于生物活性物質(zhì)，干擾檢測結(jié)果的因素大大減少。 目前在檢驗中的應(yīng)用主要是有2種形式穿流形式，又稱為膠體金免疫滲濾試驗 (Dot-immunogold filtration assay DIGFA);另一種為側(cè)向橫流形式，又稱為膠體金免疫層析 試驗(Gold immunochromatography assay, GICA)。膠體金免疫滲濾試驗始于1985年，最初 以酶作為標(biāo)記物。1989年Spielberg以膠體金為標(biāo)記物成功檢測了艾滋病病毒(HIV)抗體， 確立了免疫滲濾試驗的基本技術(shù)，即主要以層析微孔膜(硝酸纖維素膜，稱NC膜)為固相 載體，在NC膜上固定已知的抗原或抗體，封閉包被后，將其裝入免疫滲濾裝置(塑料小盒) 中，加待測樣品，洗滌后用膠體金探針檢測相應(yīng)的抗原或抗體。塑料小盒一般為扁平形， 里面裝滿吸水材料，盒分為底和蓋兩部分，蓋的中央有一直徑0.4 0.8cm孔，小孔下緊貼 吸水墊料放置硝酸纖維素膜。
膠體金免疫層析技術(shù)原理與免疫滲濾技術(shù)基本一致，只是將原來的滲濾改為層析。它 同樣以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細(xì)管作用使樣品溶液在層析條上移動，并同時使 樣品中的待測物質(zhì)與層析材料上待測物的受體發(fā)生高特異高親和性的免疫反應(yīng)。層析過程 中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測帶)，通過直接可目測的標(biāo)記物膠 體金而得到直觀的實驗現(xiàn)象(如顯色)，而游離標(biāo)記物則越過檢測帶，達到與結(jié)合標(biāo)記物自 動分離的目的。 2.牛結(jié)核病的診斷
牛結(jié)核病是一種由牛分支桿菌和結(jié)核分支桿菌所引起的人畜共患的慢性消耗性傳染 ??；也是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定必須強制報告的疫病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計資 料,1986-1990年41.5%的發(fā)展中國家和25%的發(fā)達國家結(jié)核病的疫情在上升。1993年， WHO宣布人的結(jié)核處于全球緊急狀態(tài)。據(jù)估計,結(jié)核病每年在世界范圍內(nèi)造成多至300萬人 的死亡。研究表明在圣地亞哥的1931個結(jié)核病例中，分離的菌株中有7%被確定為牛分支桿 菌；而從兒童中分離的33%的菌株是牛分支桿菌。所以WHO專家又指出:"除非撲滅牛結(jié)核 病,否則人類結(jié)核病的控制是不會成功的"。因此，預(yù)防和根除牛結(jié)核病是擺在獸醫(yī)科技工 作者面前的嚴(yán)峻課題?？刂婆＝Y(jié)核病不僅關(guān)系到畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展，而且直接影響人類健 康。要控制牛結(jié)核病的發(fā)生與流行，必須加強對該病的診斷學(xué)研究,以便為控制和最終消滅牛 結(jié)核病提供技術(shù)保證。
4牛結(jié)核病血清學(xué)診斷試驗由于其敏感性低、特異性較差，迄今為止還未被醫(yī)學(xué)和獸醫(yī) 學(xué)實驗室用于常規(guī)診斷。細(xì)菌學(xué)方法用于診斷牛結(jié)核病很費時，且檢出率低、靈敏度差， 不能滿足臨床要求。 一些牛結(jié)核特異性基因已被確認(rèn),并建立了分子生物學(xué)實驗室鑒定技 術(shù)，但目前遠(yuǎn)不能用于基層推廣應(yīng)用。由于牛結(jié)核病是一類以細(xì)胞免疫反應(yīng)為主要特征的 疾病，因此在該病的診斷中應(yīng)以T細(xì)胞反應(yīng)機制為基礎(chǔ)。牛結(jié)核病的結(jié)核菌素診斷試驗就 是以細(xì)胞免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的一種診斷技術(shù)。自從1891年Koch首先提出以來，該技術(shù)雖然 在結(jié)核病診斷中被廣泛應(yīng)用，但也暴露出諸如靈敏度不高、檢測不快速以及影響因素多等 許多問題。在國外，目前建立了一種新穎的用于診斷牛結(jié)核病的牛Y干擾素的ELISA測定技 術(shù)。該方法通過全血培養(yǎng)、牛牛分支桿菌抗原PPD作為刺激物，利用牛Y干擾素特異性抗 體建立的ELISA方法檢測全血培養(yǎng)中釋放出的Y干擾素，從而對牛結(jié)核病進行診斷。而本發(fā) 明在于利用膠體金試紙條這種簡便快速，適于基層的操作方法檢測牛干擾素，迅速診斷牛 結(jié)核病。作為一種全新的牛結(jié)核病診斷技術(shù)，國外經(jīng)過近十年的研究證明檢測Y干擾素試驗 具有以下優(yōu)點。
(1) 靈敏度髙高靈敏的診斷技術(shù)對牛結(jié)核病的控制與消滅尤為重要。用，IFN試驗和結(jié) 核菌素試驗對已知感染牛結(jié)核的牛群的比較檢測表明，Y-IFN試驗的敏感性為93.6n/0, 而結(jié)核菌素試驗只為65.6%。
(2) 特異強澳大利亞對非結(jié)核感染區(qū)的6000頭牛試驗后得出Y干擾素試驗的特異性為 96.3%。愛爾蘭初步應(yīng)用該技術(shù)也表明，牛丫干擾素試驗有98.5%的特異性。同樣，澳 大利亞研究表明，人丫干擾素試驗的敏感性和特異性也分別達到90%和98%左右。
(3) 快速性"/千擾素試驗報告可在24h內(nèi)完成，而結(jié)核菌素試驗則需要72h后得出結(jié)論； 而且結(jié)核菌素試驗中，動物往往由于抗原沒有進入體內(nèi)而被延誤診斷。Y干擾素試驗 還具有可隨時重復(fù)性；而結(jié)核菌素試驗在檢測后60天內(nèi)，牛不能再次用結(jié)核菌素試 驗對其進行檢測。
(4) 標(biāo)準(zhǔn)化由于Y干擾素試驗采用的是全血培養(yǎng)，結(jié)果判定明確，易標(biāo)準(zhǔn)化。目前，國 外已經(jīng)有相應(yīng)的ELISA試劑盒生產(chǎn)，但試紙條方法還沒有。
由于用于牛結(jié)核病診斷的Y干擾素試驗具有以上優(yōu)點，牛Y干擾素檢測的廣泛臨床試驗已 在世界上許多國家(包括澳大利亞、愛爾蘭、新西蘭、阿根廷、西班牙、意大利和美國)完 成。在澳大利亞j干擾素試驗已被農(nóng)業(yè)委員會確認(rèn)為牛結(jié)核的診斷試驗，被稱為自20世 紀(jì)結(jié)核菌素試驗問世以來診斷牛結(jié)核病的最新診斷試驗方法。因此，Y干擾素試驗的發(fā)展是牛結(jié)核病診斷的一個主要發(fā)展趨勢。近年，本課題組對牛Y干擾素進行了一系列研究。 目前我們已經(jīng)成功克隆了牛Y干擾素基因，獲得了牛Y干擾素基因的原核以及真核表達蛋 白，利用牛Y干擾素基因重組蛋白研制出了多株穩(wěn)定分泌牛Y干擾素特異性單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞，并對牛Y干擾素生物學(xué)功能進行了探索研究。在此前期工作的基礎(chǔ)上，本發(fā) 明是利用研制出的多株牛Y干擾素特異性單克隆抗體，通過標(biāo)記膠體金顆粒，建立牛y干 擾素快速檢測試紙條，以用于牛結(jié)核病診斷，為牛結(jié)核病的快速診斷、控制以及消滅提供 強有力的保證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測牛Y干擾素的試劑條及其制備方法。 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是.-
一種快速檢測牛rf擾素的試紙條由標(biāo)記好對照線和檢測線的NC膜、免疫金墊、樣 品墊和吸水濾紙和PVC底板構(gòu)成，樣品墊、免疫金墊、NC膜和吸水濾紙依次設(shè)置在PVC底 板上，并且它們的接頭處有疊壓，使層析能順利進行；其中所說的對照線的成分是抗鼠IgG， 檢測線的成分是抗牛r-IFN單克隆抗體；所說的免疫金墊是載有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的 玻璃棉。
上述的試紙條可以和塑料卡組成更便于使用的試劑條，所說的塑料卡分為底座和面蓋 兩部分；底座上有一個放試紙條的固定槽以及與面蓋嵌合的卡齒；面蓋有一個加樣孔和一 個觀察窗以及與底座嵌合的卡齒；察窗旁邊分別印有字母T和C，T表示檢測線，在近加樣孔 一側(cè)，C表示對照線，在遠(yuǎn)加樣孔一側(cè)。
本發(fā)明的快速檢測牛Y干擾素的試紙條可通過以下步驟制備
(1) 膠體金標(biāo)記抗體在膠體金上標(biāo)記抗牛Y干擾素特異性單克隆抗體
(2) 噴金將膠體金標(biāo)記的抗體噴到玻璃纖維上，制成膠體金墊，
(3) 制作硝酸纖維素膜將兔抗鼠IgG和抗牛r-IFN單克隆抗體分別噴到硝酸纖維素 膜上，制成對照線和檢測線；
(4) 將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙組裝在PVC底板上，然后切條得
試紙條。
上述方法中，所說的抗牛r-IFN單克隆抗體優(yōu)選抗牛r-IFN單克隆抗體4A3。 本發(fā)明的試紙條能用于檢測細(xì)胞中釋放的牛Y干擾素，從而對牛結(jié)核病迸行診斷。該方法簡便、快速，可以用肉眼直接觀察，5-10分鐘即出結(jié)果，適用于基層各級獸醫(yī)部門和 出入境牛結(jié)核的快速大量篩選檢測。該方法所需成本低廉，經(jīng)濟效益顯著、應(yīng)用前景廣泛。


圖1.膠體金顆粒結(jié)構(gòu) 圖2.試紙條組裝示意圖
1-PVC底板；2-樣品墊；3-免疫金墊；4-NC膜；5-吸水墊；T-檢測線；C-對照線。
圖3.試紙條檢測結(jié)果圖解 圖4.試紙條特異性試驗
具體實施方式
實例
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的含義。
下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例
只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用
試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標(biāo)明，其后所用相同
試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。
本發(fā)明中抗牛r-IFN單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞林4A3(李瑞芳，秦愛建，許金俊.抗奶 牛Y-干擾素特異性單克隆抗體的研制及其特性，中國人獸共患病雜志，2006， 22 (8): 755-758 )由江蘇省動物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。 一、主要材料制備方法概述 1.1牛r-IFN單克隆抗體的制備
以原核表達牛r-IFN免疫8周齡Balb/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)將免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞融合，篩選和建立穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性的抗牛r-IFN單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 (4A3)。采用體內(nèi)誘生腹水法進行單克隆抗體制備。以高親和力和高特異性的單克隆抗體為 基礎(chǔ)，保證了檢測試紙的敏感性與特異性。 1.2兔抗鼠IgG的制備
將小鼠IgG免疫2kg左右家兔，3次皮下注射免疫后，當(dāng)血清瓊脂凝膠沉淀試驗(AGP) 效價^1:40時采血，分離血清。然后以飽和硫酸鹽鹽析法和凝膠層析法提取兔抗鼠IgG 。
71.3膠體金的制備
用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑為30nm的膠體金，4'C保存。
1.4檢測方法的建立
采用細(xì)胞工程技術(shù)和現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)制備、篩選、純化高親和力特異的單克隆抗體， 以擰檬酸三鈉還原法制備優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)的膠休金，將純化的單抗和膠體金按比例進行標(biāo)記。以 高親和力特異的單克隆抗體和膠體金技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)雙抗體夾心膜層析原理進行設(shè)計， 將膠體金標(biāo)記單抗吸附于實驗篩選的玻璃纖維，將檢測線(牛r-IFN)和對照線(兔抗鼠IgG)固 化于篩選的硝酸纖維素膜，而后連同其它所需的吸水纖維、支撐材料、覆蓋材料等按照設(shè) 計工藝進行制作和組裝，制成快速檢測試紙，并進行嚴(yán)格的質(zhì)量檢驗合格后，用于快速檢
二、快速檢測試紙生產(chǎn)工藝 2.1生產(chǎn)過程
2.1.1抗牛r-IFN單克隆抗體的制備
2丄U制備
將牛r-IFN 4A3株雜交瘤細(xì)胞系置5。/。二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)37'C培養(yǎng)。Balb/c小鼠(接種細(xì) 胞前10日注射滅菌液體石蠟0.5ml)腹腔內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞106-107個，l周后抽取腹水， ELISA效價應(yīng)^1:104。用飽和硫酸銨鹽析法提純單抗，用生理鹽水2-8'C透析24-48小時，然 后用GE公司的ffiTrapProteinG純化，透析后置-2(TC保存。 2丄1.2檢驗
用SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)檢測蛋白純度應(yīng))90n/c)，用分光光度計法檢 測蛋白含量應(yīng)不低于5mg/ml,用間接ELISA法檢測效價應(yīng))l:105 2.1.2兔抗鼠IgG的制備及檢驗 2丄2.1制備
將小鼠IgG與福氏佐劑乳化后，對2kg左右家兔進行皮下注射，當(dāng)血清AGP效價》1:40 時采血，分離血清。然后用飽和硫酸鹽鹽析法和凝膠層析法提取兔抗IgG。 2丄2.2檢驗
用AGP法檢測效價應(yīng)》1:40。 2丄3檢測線和對照線的制備及檢驗
2丄3.1硝酸纖維素膜(NC膜)印跡(簡稱NC印膜)，購自Whatman公司2丄3丄1NC膜
寬度為2.5cm，孔徑為5n。 2丄3丄2制備
將NC膜放Bio-Dot三維噴點平臺上展平，并放上壓條，分別將抗牛r-IFN單克隆抗體4A3 和兔抗鼠IgG放在兩個貯存池中。開機后，抗牛r-IFN單克隆抗體4A3及兔抗鼠IgG分別呈線 條狀噴于NC膜上形成檢測線和對照線。置室溫自然干燥后，用BSA-PBS37'C溫育2小時， 然后用PBST洗滌三次，每次10min，待室溫干燥后再冷凍抽真空。 2.1.4膠體金標(biāo)記的單克隆抗體玻璃棉的制備及檢驗 2丄4.1膠體金的制備及檢驗 2丄4丄1制備
各取200ml去離子水置于1000ml潔凈的錐形瓶中煮沸，棄去沸水，以預(yù)熱系統(tǒng)。重新 加入400ml，加入4ml 1%氯金酸溶液，待煮沸后加入6ml新鮮配制的l。/。檸檬酸三鈉,混勻， 煮沸，當(dāng)顏色由黃色變?yōu)楹谏?，再變?yōu)樽霞t色時，繼續(xù)煮沸10min，取下攪拌冷卻至室溫， 用K2C03調(diào)pH值至適當(dāng)。膠體金溶液用鋁箔包裹，4'C保存。 2丄4丄2檢驗
肉眼觀察應(yīng)為紫紅色、無沉淀、透明狀，或用電鏡觀測膠體金粒徑應(yīng)為20-30nm。 2丄4.2膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備及檢驗 2丄4.2.1制備
2丄4.2丄1標(biāo)記蛋白濃度確定
用0.01M磷酸鹽緩沖液將待標(biāo)記抗牛r-IFN3A4株單抗作倍比稀釋成l:10, 1:20， 1:320， 設(shè)置不加單抗作對照，每個稀釋度各加lml膠體金溶液。5min后，各加入100ul 10 % NaCl 溶液，觀察1小時，以顏色由紅變藍(lán)的前l(fā)管蛋白濃度為最適標(biāo)記濃度，標(biāo)記時增加10%蛋 白用量。
2丄4.2丄2單抗的膠體金標(biāo)記
以標(biāo)記100ml膠體金為例，在200ml體積燒杯中(經(jīng)過泡酸，干烘處理過)加入100ml 膠體金溶液，置于磁力攪拌器上攪拌，待其溫度升為室溫時，逐滴加入與之標(biāo)記的單抗， 攪拌30min，加入2ml 10。/。BSA溶液，繼續(xù)攪拌30min，然后逐滴加入5ml 10%PEG-20000， 攪拌30min后，置4。C靜置2hr。
1500rpm4'C離心20min分鐘，棄去底部未結(jié)合的雜質(zhì)成分， 然后10000rpm4。C離心60min，棄去上清。用3ml 0.02M PB、 250ul PEG-20000重新懸浮膠體金。貼標(biāo)簽，置4'C保存。 2丄4.2.2檢驗
用分光光度計法，檢測膠體金標(biāo)記單克隆抗體結(jié)合物在524nm波長處的OD值應(yīng)〉1.50。 2丄4.3膠體金標(biāo)記的單克隆抗體玻璃棉的制備及檢驗 2丄4.3.1制備
用緩沖液(100ul 10% NaCl溶液，200ul 10%BSA,800ul 0.01M PB)將膠體金標(biāo)記抗體作 1:1倍稀釋。然后用BIO-DOT三維噴點儀將標(biāo)記抗體噴射在規(guī)格為lcmx30cm玻璃棉上制成 膠體金抗體棉，自然干燥后，冷凍抽真空，置2—8'C保存。 2丄4.3.2檢驗
玻璃棉上的膠體金著色均勻為合格。 2丄5試紙芯制備及檢驗 2丄5.1 NC印膜粘貼
將NC印膜4平貼于7.5x30cmPVC支持板l的中央，應(yīng)注意伸展平貼，貼后不能有空隙 或氣泡。
2丄5.2試紙芯樣品端的制備及檢驗 2丄5.2.1制備
2丄5.2丄1膠體金抗體玻璃棉(免疫金墊)粘貼
將lx30cm的膠體金抗體玻璃棉(免疫金墊)3平貼于NC印膜4檢測線T的下方，重疊印 膜0.25 cm;然后均勻平壓即可。 2丄5.2丄2玻璃棉(樣品墊)粘貼
將2.8x30cm的空白玻璃棉2，平貼于膠體金抗體玻璃棉3的下方，重疊膠體金抗體玻璃 棉0.3cm，然后均勻平壓即可。 2.1.5.2.2檢驗
粘貼后的試紙芯樣品端應(yīng)為邊沿整齊、平展、無空隙。 2丄53試紙芯吸水端的制各及檢驗 2.1.5.3.1制備
吸水濾紙5的粘貼將3.25x30cm吸水濾紙5平放于NC印膜4對照線C的一端，重疊NC 印膜0.25cm，平放后均勻平壓即可。
2丄5.3.2檢驗粘貼后試紙芯手柄端應(yīng)為邊沿整齊、平展、無空隙。2.1.6切割
將標(biāo)記好C、 T線的NC膜4、制備好的免疫金墊3、樣品墊2和吸水濾紙5先后粘貼在PVC 底板1上(見圖2),調(diào)整NC膜的粘貼位置及相互間重疊長度，然后啟動CM4000型BIO-DOT 切割機，選擇設(shè)定試紙芯寬度及切割速度，進行切割。切條機切割成3 5mm寬的試紙條。
2.1.7試紙裝配
試紙由塑料卡和試紙芯組成，塑料卡分為底座和面蓋兩部分。底座上有一個放試紙芯 的固定槽以及與面蓋嵌合的卡齒。面蓋有一個加樣孔和一個觀察窗以及與底座嵌合的卡齒。 察窗旁邊分別印有字母T和C,T表示檢測線，在近加樣孔一側(cè)，C表示對照線，在遠(yuǎn)加樣孔
將試紙芯固定在底座固定槽中，再將底座和面蓋嵌合在一起即成試紙盒。注意加樣孔 與試紙芯的樣品墊相對應(yīng)，觀察窗與試紙芯的包被膜相對應(yīng)，其旁邊印有的T和C分別與包 被膜上的檢測線和對照線相對應(yīng)。 2丄8試紙檢測 2丄8.1陽性檢測液的處理
采集已知感染牛結(jié)核病的牛的全血5-10 mL，全血混勻后分散至消毒的培養(yǎng)板中培養(yǎng)， 并加入分支桿菌抗原刺激物，血樣和抗原混勻。培養(yǎng)一定時間后收集上清，4。C1000rpm離 心8min，取上清分裝于1.5mL的指形管，-20〔保存?zhèn)溆??；蛉≈亟M桿狀病毒表達的牛r-IFN 基因產(chǎn)物作為對照，分裝于1.5mL的指形管，4'C保存?zhèn)溆谩?2丄8.2陰性檢測液的處理
采集己知未感染牛的全血5-10 mL，全血混勻后無菌分散至消毒的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，并 加入分支桿菌抗原刺激物，血樣和抗原混勻。培養(yǎng)一定時間后收集上清，4。C1000rpm離心 8min，取上清分裝于1.5mL的指形管，-20<€保存?zhèn)溆谩?2丄8.2待檢檢測液的處理
采集待檢牛的全血5-10mL，全血混勻后等分無菌分散至消毒的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，并分 別加入分支桿菌抗原刺激物和對照抗原，血樣和抗原混勻。培養(yǎng)一定時間后收集上清， 4'Cl000rpm離心8min，取上清即為待檢樣品。 2丄8.3試紙條檢測結(jié)果判定
用移液器吸取60nL待檢樣品直接滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向 前移行，在移行過程中NC膜上會出現(xiàn)肉眼可見的紅色條帶，于加樣后3 10min觀察結(jié)果，200810242893.5
目測結(jié)果的陰性和陽性(如圖3)。
若C、 T線同時出現(xiàn)，說明樣品中含有待檢抗原，判定為陽性；若C線出現(xiàn)而T線 未出現(xiàn)，說明樣品中不含待檢抗原，判定為陰性；若C、 T線均未出現(xiàn)或T線出現(xiàn)C線未 出現(xiàn)，檢測無效，說明試紙條出現(xiàn)質(zhì)量問題或操作不當(dāng)，應(yīng)重新檢測或更換試紙條。 2丄8.4試紙條特異性檢測
用試紙條分別對PPD刺激的牛結(jié)核陽性牛全血細(xì)胞培養(yǎng)物、PPD刺激的豬全血細(xì)胞 培養(yǎng)物、PPD刺激的羊全血細(xì)胞培養(yǎng)物、PPD刺激的犬全血細(xì)胞培養(yǎng)物檢測，并同時以PBS 和PPD刺激的牛結(jié)核陰性的牛全血細(xì)胞培養(yǎng)物檢測作對照。結(jié)果PPD刺激的牛結(jié)核陽性 的牛全血細(xì)胞培養(yǎng)物檢測牛r-IFN陽性，檢測液試紙的檢測線(T線)對照線(C線)同時出現(xiàn)， 而其他樣品檢測試紙T線無條帶。 2.1.9半成品檢驗 2丄9.1物理性狀
試紙外觀呈長方形，外層為環(huán)保性質(zhì)的塑料外殼，中間為試紙芯。外殼面蓋上有一個 加樣孔和一個觀察窗，觀察窗兩端分別印有字母T和OT在近加樣孔一側(cè)，C在遠(yuǎn)加樣孔一 側(cè)。試紙芯寬度均勻一致，材料粘貼規(guī)范，附著牢固，NC印膜無損傷。 2.1.9.2檢測線和對照線檢驗
用移液器吸取6(HiL待檢樣品直接滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向 前移行，在移行過程中NC膜上會出現(xiàn)肉眼可見的紅色條帶，于加樣后3 10min肉限觀察其 測試結(jié)果，5-10分鐘檢測線(T線)和對照線(C線)兩條線一并出現(xiàn)，為陽性；用PBS檢測，只 有C線出現(xiàn)條帶,T線無條帶，判為陰性。且顯色均勻一致、線形規(guī)則。若C、 T線均未出現(xiàn) 或T線出現(xiàn)C線未出現(xiàn)，檢測無效，說明試紙條出現(xiàn)質(zhì)量問題或操作不當(dāng)，應(yīng)重新檢測或更 換試紙條。
2.1.9.3試紙條質(zhì)量鑒定
用試紙分別對牛r-IFN陽性檢測液、牛r-IFN陰性檢測液進行檢測，其中檢測牛r-IFN陽 性檢測液試紙的檢測線(T線)對照線(C線)同時出現(xiàn)，判定為陽性；而其他樣品檢測試紙T線 無條帶，判定為陰性；若C、 T線均未出現(xiàn)或T線出現(xiàn)C線未出現(xiàn)，檢測無效，說明試紙條 出現(xiàn)質(zhì)量問題或操作不當(dāng)，應(yīng)重新檢測或更換試紙條。
1權(quán)利要求
1、一種快速檢測牛γ干擾素的試紙條，其特征在于由標(biāo)記好對照線和檢測線的NC膜、免疫金墊、樣品墊和吸水濾紙和PVC底板構(gòu)成，樣品墊、免疫金墊、NC膜和吸水濾紙依次設(shè)置在PVC底板上，并且它們的接頭處有疊壓，使層析能順利進行；其中所說的對照線的成分是抗鼠IgG，檢測線的成分是抗牛r-IFN單克隆抗體；所說的免疫金墊是載有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的玻璃棉。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測牛Y干擾素的試紙條，其特征在于所說的抗牛r-IFN 單克隆抗體是抗牛r-IFN單克隆抗體4A3。
3、 一種快速檢測牛Y干擾素的試劑條，其特征在于，由權(quán)利要求l所述的試紙條和塑料 卡組成，所說的塑料卡分為底座和面蓋兩部分；底座上有一個放試紙條的固定槽以及與面 蓋嵌合的卡齒；面蓋有一個加樣孔和一個觀察窗以及與底座嵌合的卡齒；察窗旁邊分別印 有字母T和C，T表示檢測線，在近加樣孔一側(cè)，C表示對照線，在遠(yuǎn)加樣孔一側(cè)。
4、 一種制備權(quán)利要求1所說的快速檢測牛Y干擾素的試紙條的方法，其特征在于，包括 以下步驟1) 膠體金標(biāo)記抗體在膠體金上標(biāo)記抗牛Y干擾素特異性單克隆抗體；2) 噴金將膠體金標(biāo)記的抗體噴到玻璃纖維上，制成膠體金墊；3) 制作硝酸纖維素膜將抗鼠IgG和抗牛r-IFN單克隆抗體分別噴到硝酸纖維素膜 上，制成對照線和檢測線；4) 將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙組裝在PVC底板上，然后切條得試 紙條。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速檢測牛γ干擾素的試紙條及其制備方法。所說的試紙條由標(biāo)記好對照線和檢測線的NC膜、免疫金墊、樣品墊、吸水濾紙和PVC底板構(gòu)成。其中所說的對照線的成分是抗鼠IgG，檢測線的成分是抗牛r-IFN單克隆抗體；所說的免疫金墊是載有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體的玻璃棉。上述試紙條包括膠體金標(biāo)記抗體、噴金、制作硝酸纖維素膜和組裝的步驟。本發(fā)明的試紙條用于檢測樣本中的牛γ干擾素，從而可以用于牛結(jié)核病等疫病檢測和診斷。該方法簡便、快速，可以用肉眼直接觀察，5-10分鐘即出結(jié)果，適用于基層各級獸醫(yī)部門和出入境牛結(jié)核的快速大量篩選檢測。該方法所需成本低廉，經(jīng)濟效益顯著、應(yīng)用前景廣泛。
文檔編號G01N33/577GK101452000SQ20081024289
公開日2009年6月10日 申請日期2008年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月30日
發(fā)明者尹天燕, 秦愛建, 趙士學(xué), 邵紅霞, 金文杰 申請人:揚州大學(xué)