專利名稱：可光固化和光構(gòu)圖的二氫唑酮共聚物基水凝膠基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可光固化和光構(gòu)圖的組合物，含有光交聯(lián)劑和具有二氫唑酮官能度的聚合物。該組合物可以在基底上進行高分辨率地構(gòu)圖，用于結(jié)合生物學(xué)活性分子。
背景技術(shù)：
目前已有多種將生物分子固定在基底上的方法。
US5,552,270涉及一種DNA測序方法，其中的DNA寡核苷酸固定在由基底支承的凝膠方格基質(zhì)中。DNA與基底的結(jié)合是通過氧化附加的3′端3-甲基尿苷，然后與結(jié)合在基底上的肼反應(yīng)，生成“相對穩(wěn)定的嗎啉衍生物”(′270，第5欄，第41-47行)。其中的凝膠方格的邊長為25-100μm，彼此間隔2倍寬度(′270，第2欄，第60-64行)。
US5,744,305涉及一種生物芯片板，具有通過“光定向合成”原位合成的DNA或肽寡聚物斑，其中，在每次加入單體前，利用掩模通過光反應(yīng)選擇性地去除保護基。各寡聚物鏈最初的堿基顯然是通過胺官能團與基底結(jié)合的(′305，

圖1和2)。
US4,871,824涉及一種低溶脹的二氫唑酮官能聚合物珠，用作固定生物反應(yīng)性分子的反應(yīng)性支持體。
US5,344,701涉及一種通過生物分子與二氫唑酮官能涂層結(jié)合將其固定于基底上的方法。其中，將具有自由基加成位點的二氫唑酮官能單體加到基底上，可以任選地加二乙烯基之類的自由基交聯(lián)劑，然后進行原位聚合。
US5,725,989涉及一種可激光定位熱轉(zhuǎn)移成像元件，具有支持體，光一熱轉(zhuǎn)換層，中間層和熱轉(zhuǎn)移層。
發(fā)明概述簡而言之，本發(fā)明提供一種可光固化和光構(gòu)圖的組合物，包含a)由1-99重量份至少一種二氫唑酮官能單體和0-99份至少一種共聚單體形成的至少一種共聚物；和b)至少一種光交聯(lián)劑；所述組合物用于結(jié)合生物學(xué)活性分子。
另一方面，本發(fā)明提供一種水凝膠，包含固化的本發(fā)明組合物，該凝膠能夠結(jié)合生物學(xué)活性分子。該凝膠的優(yōu)點在于可溶脹，因此在用作涂料時，可提供更高的單位面積上生物學(xué)活性分子濃度。
另一方面，本發(fā)明提供一種涂有本發(fā)明組合物的基底，可對該組合物進行高分辨率構(gòu)圖，并固化，該組合物能夠與生物分子反應(yīng)從而將其固定在基底上。
另一方面，本發(fā)明提供一種制造上述帶涂層基底的方法。
本領(lǐng)域尚沒有而由本發(fā)明提供的是用二氫唑酮官能聚合物與光交聯(lián)劑組合，用于固定化生物分子的組合物和方法。而且，可對本發(fā)明組合物進行高分辨率光構(gòu)圖。最后，所得固化凝膠可溶脹，提供了更高的單位面積上的生物分子濃度。
在本申請中“二氫唑酮”，“二氫唑酮官能團”和“二氫唑酮部分”表示通式Ⅰ所示的取代或非取代2-噁唑啉-5-酮基團和/或通式Ⅱ所示的2-噁嗪-6-酮基團 “二氫唑酮官能單體”指結(jié)構(gòu)中具有一個二氫唑酮部分的單體，該部分可以已經(jīng)通過二氫唑酮的開環(huán)反應(yīng)形成生物分子-二氫唑酮鍵而與生物分子結(jié)合；“水凝膠”是一種會在水中因吸附或吸收等物理作用，或因水解等化學(xué)作用而溶脹的聚合物材料，指的是在水中溶脹之前或之后的凝膠材料。
“光交聯(lián)劑”是這樣的化學(xué)物質(zhì)它能因電磁輻射作用而將兩個或多個聚合物分子結(jié)合，并能結(jié)合于聚合物分子上除增長鏈末端之外的位置。
“寡聚交聯(lián)劑”指這樣的化學(xué)物質(zhì)它能夠結(jié)合兩個或更多個聚合物分子，并能結(jié)合于聚合物增長鏈末端。
“生物學(xué)活性”包括生物化學(xué)、免疫化學(xué)、生理學(xué)或藥理學(xué)活性。
“生物學(xué)活性分子”與“生物分子”等同，包括抗體、抗原、酶、輔因子、抑制劑、激素、受體、凝集因子、氨基酸、組蛋白、維生素、藥物、細胞表面標(biāo)記、蛋白質(zhì)和多肽，DNA(包括DNA寡核苷酸)，RNA(包括RNA寡核苷酸)，PNA，以及以上物質(zhì)的衍生物；“取代”表示被不影響所需產(chǎn)物的常規(guī)取代基取代，例如，取代基可以是烷基、烷氧基、芳基、苯基、鹵素(F、Cl、Br、I)、氰基、硝基等。
本發(fā)明的優(yōu)點在于提供了一種用于將生物分子固定在基底上的組合物和方法，適用于多種生物分子，并可進行高分辨率的光構(gòu)圖。
附圖簡述圖1是本發(fā)明水凝膠塊放大200倍的顯微照片。定標(biāo)線代表100μm。
圖2是本發(fā)明水凝膠圖案放大1000倍的顯微照片。定標(biāo)線代表40μm。
圖3是本發(fā)明水凝膠放大100倍的顯微照片。中心距為200μm。
優(yōu)選實施方式的詳細描述本發(fā)明提供一種可光固化和光構(gòu)圖的組合物，包含a)由1-99重量份至少一種二氫唑酮官能單體和0-99份至少一種共聚單體形成的至少一種共聚物；和b)至少一種光交聯(lián)劑；所述組合物用于結(jié)合生物學(xué)活性分子。
二氫唑酮官能單體的共聚物可以是聚烯烴、聚酰胺或聚酰亞胺等任意適宜類型。較好的是聚烯烴聚合物。該共聚物可以含有由二乙烯基化合物之類共聚交聯(lián)劑形成的交聯(lián)鍵。
所述二氫唑酮官能單體共聚物可用各種適宜的方法來制備，包括US4,451,619,US4,737,560,US5,200,471,US5,292,840,US5,336,742,US5,344,701,US5,403,902,US5,451,453和US4,871,824所述的方法。較好的是自由基聚合反應(yīng)。較好的是，共聚物的聚合反應(yīng)在與光交聯(lián)劑反應(yīng)前完成。
所述二氫唑酮官能單體可以是任何含二氫唑酮官能團的單體，包括具有結(jié)構(gòu)Ⅲ和Ⅳ的單體 其中，R1是可聚合物官能團，例如乙烯基、丙烯基和己烯基；R2各自是1-14個碳原子的烷基，3-14個碳原子的環(huán)烷基，5-12個環(huán)原子的芳基，含6-26個碳原子和0-3個S、N和非過氧性O(shè)雜原子的芳基，或者，兩R2取代基與相連的碳原子一起形成一個4-12個環(huán)原子的碳環(huán)。優(yōu)選二氫唑酮官能單體是2-乙烯基-4,4-二甲基-2-噁唑啉-5-酮(乙烯基二甲基二氫唑酮，VDM)。
共聚單體可以是任意合適的單體。優(yōu)選的單體包括含乙烯基和含丙烯?；幕衔?。此類單體的代表性一覽表包括丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，N,N-二甲基丙烯酰胺，雙丙酮丙烯酰胺，N-乙烯基吡咯烷酮，甲基丙烯酸羥基乙酯，2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸及其鹽，N-(3-甲基丙烯酰氨基丙基)-N,N,N-三甲基銨鹽，甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯，丙烯酸，甲基丙烯酸，衣康酸，和它們的混合物。優(yōu)選的共聚單體是N,N-二甲基丙烯酰胺和N-乙烯基吡咯烷酮。
可選的共聚交聯(lián)劑可以是任何具有2個或更多可聚合官能團的適宜的物質(zhì)。適宜的多官能交聯(lián)劑單體包括烯鍵式不飽和(α,β-不飽和)酯，例如二丙烯酸乙二酯，二甲基丙烯酸乙二酯，三羥甲基丙烷三丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；α,B-不飽和酰胺，例如亞甲基雙丙烯酰胺，亞甲基雙甲基丙烯酰胺，N，N′-二丙烯?；?1,2-二氨基乙烷，N,N′-二甲基丙烯?；?1,2-二氨基乙烷，和2-烯基二氫唑酮與短鏈二胺的反應(yīng)產(chǎn)物。
光交聯(lián)劑可以任選如下物質(zhì)能夠因電磁輻射而將兩個或多個聚合物分子結(jié)合，并能結(jié)合于聚合物上除增長鏈末端之外的位置。光交聯(lián)劑應(yīng)能夠在聚合物聚合反應(yīng)完成后結(jié)合在聚合物上。優(yōu)選的光交聯(lián)劑包括雙疊氮化合物，雙重氮羰基化合物和bisdiazirines化合物。就使用方便而言，最好的是雙疊氮化合物。疊氮基(-N3)受UV光作用而釋放氮氣(N2)，留下一個高度反應(yīng)性的二價氮，即氮賓。反應(yīng)性卡賓可通過重氮羰基化合物和diazirine光解產(chǎn)生。反應(yīng)性氮賓或卡賓可以插入預(yù)聚合聚合物上的許多鍵中，包括C-C鍵和C-H鍵。優(yōu)選疊氮化合物、雙疊氮化合物和偶氮羰基和雙重氮羰基交聯(lián)劑，因為它們可形成基底-聚合物連接，以及聚合物-聚合物交聯(lián)。優(yōu)選的雙疊氮化合物包括2,6-雙(4-疊氮基亞芐基)-4-甲基環(huán)己酮(BAMC),4,4′-二疊氮基二苯醚，4,4′-二疊氮基二苯基砜，4,4′-二疊氮基二苯基丙酮，4,4′-二疊氮基二苯基甲烷。優(yōu)選的雙重氮羰基化合物包括1,4-雙(α-重氮芐基)苯。光交聯(lián)劑可以既能熱固化又可光固化。
另一實施例中，光交聯(lián)劑是一種雜一雙官能化合物，其第一官能團與聚合物結(jié)合，另一官能團在光照后形成交聯(lián)。例如，4-[對重氮水楊酰氨基]丁胺(ASBA,購自Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)具有一個結(jié)合二氫唑酮的胺官能團，和一個在UV光照后與另一聚合物鏈交聯(lián)的重氮官能團。
當(dāng)光交聯(lián)劑通過占據(jù)聚合物的二氫唑酮官能團而與聚合物結(jié)合時，交聯(lián)劑必須少于1當(dāng)量，從而不至于占據(jù)結(jié)合生物分子所需的所有二氫唑酮位點。換言之，光交聯(lián)劑上的二氫唑酮反應(yīng)性官能數(shù)必須少于聚合物上二氫唑酮官能的總數(shù)。然而，如果生物分子結(jié)合在光交聯(lián)之前，即組合物已含有生物分子-二氫唑酮鍵，則不必拘泥于上述要求。
可將本發(fā)明組合物加到基底上，固化(光交聯(lián))，構(gòu)圖，并與生物分子反應(yīng)。通過改變方法，以上四步驟可按任意順序進行。許多技術(shù)，例如光刻構(gòu)圖和激光誘導(dǎo)的熱成像(LITI)構(gòu)圖(見后文)，涉及同時或幾乎同時的組合物涂布、固化或構(gòu)圖步驟。
基底可以是聚合物能粘著的任何適宜材料?？捎玫幕装o機固體，例如玻璃、陶瓷、未燒制金屬和非金屬氧化物、黏土、沸石和有機聚合物。優(yōu)選的是易與光交聯(lián)劑反應(yīng)的基底。當(dāng)光交聯(lián)劑含有疊氮基官能團時，所述優(yōu)選基底包括有機聚合物和表面處理過的玻璃，包括硅氧烷改性玻璃。
可用各種合適的方法將組合物加到基底上。涂層的厚度為1nm-5mm，以0.05-100μm為佳，最好是1-20μm。
組合物在涂布時可加或不加溶劑。合適的方法包括旋涂、噴涂、刮圖、蘸涂或輥涂?？蛇x擇性地涂布組合物以形成有圖案的表面。此類方法包括已知的印刷方法，例如噴墨印刷，膠印，苯胺印刷等。也可將所述組合物刮圖到具有顯微結(jié)構(gòu)的表面(例如具有微米級凹陷和槽的表面)上，使之留存在顯微結(jié)構(gòu)中，形成有圖案的組合物陣列。
本發(fā)明組合物可用電磁輻射來固化，以UV光為佳，最好是UV-A光?？赏ㄟ^選擇性曝光進行組合物的選擇性固化。選擇性曝光的方法包括通過掩?；蛘障嗟灼毓?，或用定向光束或激光曝光。然后，可通過例如洗滌去除未固化的組合物，得到有圖案的涂層。然后，可用光或熱固化，進一步固化組合物。有時，可用熱固化完全取代光固化，特別是不對凝膠進行構(gòu)圖，或用化學(xué)方法等非光構(gòu)圖方法進行構(gòu)圖時。
可用各種方法進行構(gòu)圖，包括將組合物選擇性地涂在基底上，選擇性地固化組合物，或選擇性地從基底上去除組合物。本發(fā)明的優(yōu)點在于，可通過選擇性固化對組合物進行2μm以下分辨率的光構(gòu)圖?；映叽缫话阈∮?000μm。較好的是，有圖案涂層上的花樣尺寸小于200μm，小于20μm更好，小于2μm最好。以上尺寸是所涂花樣的面內(nèi)尺寸，或所涂花樣之間的間隔尺寸。
組合物在基底上的構(gòu)圖可通過激光定位熱轉(zhuǎn)移成像法進行，例如美國專利5,725,989所述。該方法中，熱轉(zhuǎn)移供體具有一支持層、光-熱轉(zhuǎn)換層和含有待構(gòu)圖組合物的轉(zhuǎn)移層。當(dāng)熱轉(zhuǎn)移供體與受體接觸，并依圖案進行輻射時，發(fā)生熔粘轉(zhuǎn)移過程，含組合物的轉(zhuǎn)移層于是影印到受體上。本發(fā)明的可光交聯(lián)二氫唑酮組合物可用在此類系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移層中。該可光交聯(lián)二氫唑酮組合物可在加到轉(zhuǎn)移層中之前，加入該層之后，或在激光定位熱轉(zhuǎn)移到受體上之后，與生物分子反應(yīng)。本發(fā)明的二氫唑酮組合物可在轉(zhuǎn)移過程之前或之后進行熱交聯(lián)或光化學(xué)交聯(lián)。這樣就可能將不同的生物分子在含有本發(fā)明二氫唑酮組合物的轉(zhuǎn)移層上預(yù)先構(gòu)圖，然后將各二氫唑酮-生物分子共軛對激光定位熱成像在受體基底上?？稍谵D(zhuǎn)移步驟之間自動改變供體-受體合模，從而使被轉(zhuǎn)移元件在受體上形成所需的陣列間隔和尺寸，不同于生物分子在轉(zhuǎn)移層上的圖案。激光定位熱成像具有高分辨率和高合模精度。本發(fā)明的獨特優(yōu)點之一是能夠在熱成像之前或之后結(jié)合生物分子，并提供了在轉(zhuǎn)移后將樣品熱固化或光化學(xué)固化在受體上的方法。
聚合物的二氫唑酮官能團可結(jié)合生物分子上的多種結(jié)合性官能團，包括伯胺、仲胺、羥基和巰基。有或沒有合適催化劑存在下，這些基團與二氫唑酮發(fā)生親核加成反應(yīng)，產(chǎn)生一個與二氫唑酮官能團殘基結(jié)合的生物分子殘基。
典型的反應(yīng)途徑為 其中，R1是H或CH3。
R2和R3各自可以是1-14個碳原子的烷基，3-14個碳原子的環(huán)烷基，5-12個環(huán)原子的芳基，具有6-26個碳原子和0-3個S、N和非過氧性O(shè)雜原子的芳基，或者，R2和R3與所在碳原子共同形成一個4-12個環(huán)原子的碳環(huán)；n是整數(shù)0或1，X可以是-O-、-S-、-NH-或NR4，其中R4可以是C1-20烷基，C6-30芳基或連接G的二次鍵，HXG是具有結(jié)合性官能團HX-的生物分子，XG是HXG與聚合物結(jié)合后保留的殘基。
根據(jù)生物分子的結(jié)合性官能團，要獲得有效的結(jié)合反應(yīng)速度，可能需要催化劑。伯胺官能團不需要催化劑。對羥基和仲胺官能團有效的是三氟乙酸、乙磺酸、甲苯磺酸等酸催化劑。對羥基和巰基有效的是三乙基胺、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一-7-烯(DBU)和1,5-二氮雜雙環(huán)[4.3.0]壬-5-烯(DBN)(均購自Aldrich ChemicalCo.,Milwaukee,WI)等胺堿。催化劑用量一般為每100份二氫唑酮1-10份催化劑，以1-5份為佳。本發(fā)明二氫唑酮官能團的優(yōu)點在于能優(yōu)先地末端結(jié)合多肽和聚核苷酸。
生物分子與聚合物結(jié)合的步驟可在涂布之前或之后，固化之前或之后，以及構(gòu)圖之前或之后進行。
生物分子結(jié)合后，可加入加帽劑以占據(jù)所有未被使用的二氫唑酮官能團，以免凝膠被不需要的物質(zhì)污染。較好的是，加帽劑易于與二氫唑酮反應(yīng)，且不影響所需的凝膠特性。較好的是，加帽劑是水溶性的，這可以提高凝膠的溶脹性。優(yōu)選的加帽劑是伯胺和水。
所得固化凝膠的優(yōu)點在于具有溶脹性，因為可溶脹的凝膠可在給定基底面積內(nèi)結(jié)合更多生物分子。這一單位面積上密度的提高增強了檢測能力(例如靶位點的光學(xué)讀數(shù))，并允許進一步的小型化。在水中浸過夜后，凝膠可溶脹至干體積的至少2倍，以至少3倍為佳，至少4倍更好，至少5倍最好。溶脹程度可通過光交聯(lián)劑用量來控制。
本發(fā)明可用于使用生物分子的分析儀器中，可作為檢測探針或參照標(biāo)準(zhǔn)，特別適用于需要在緊湊的基底面積內(nèi)使用多種不同生物分子的場合。
例如，將DNA測序操作微化至微芯片上可提供高速和低耗的優(yōu)點。含寡核苷酸的本發(fā)明凝膠塊可用來制造高密度DAN芯片，在該芯片表面上可具有成千至上百萬的探針。在雜交測序法中，可將整個寡核苷酸探針陣列(例如全部1024種可能的五聚體，或全部65,536種八聚體)構(gòu)圖到一基底上，使待測序DNA樣品與該陣列特異性雜交。分析與靶序列形成完好雙螺旋體的覆蓋共聚物組，即可鑒定出靶DNA序列。例如，這樣的芯片可用于需要對多基因突變進行測序的應(yīng)用，例如檢測多基因疾病所需要的那樣。
低密度DNA芯片一般最多有300個探針，特別適合需要檢測一種特定微生物或菌株或進行一組測試的診斷性用途。如果是低密度陣列，可將含有寡核苷酸的本發(fā)明凝膠構(gòu)圖在可單獨尋址的微電極上，作為可尋址可程控電子基質(zhì)用于自由場電泳控制靶DNA雜交，參見美國專利5,632,957和5,605,662所述。DNA樣品從一個顯微位置電泳移動到下一個。利用電子嚴謹度控制將與捕捉探針匹配的DNA留在各顯微位置。
本發(fā)明的含酶凝膠陣列可用來篩選具有酶抑制或酶活化作用的化合物。將各凝膠片與不同劑量的靶化合物接觸，通過測定各凝膠片內(nèi)的酶活性來跟蹤劑量應(yīng)答。
天然或基因工程微生物也可固定在本發(fā)明的凝膠片上。微生物表面的生物分子起著與凝膠結(jié)合的錨著點的作用。由此，可監(jiān)測微生物對化學(xué)刺激物或其他環(huán)境條件的生物學(xué)反應(yīng)?；蛘撸蓪⑦@樣的含微生物的凝膠片單獨用作生物反應(yīng)器。
可用上述方法和組合物構(gòu)圖含有能促進細胞結(jié)合和生長的生物分子(例如生長因子或膠原)的凝膠。所得的有圖案凝膠可用來產(chǎn)生兩維細胞結(jié)構(gòu)，例如神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，皮膚或血管。
本發(fā)明的組合物還可用來支承免疫試驗板，候選藥物試驗板(drugs ofabuse)，酶電極和酶光極。此外，凝膠塊陣列可用來定量吸收內(nèi)含待測微生物的液體?？稍谀z塊內(nèi)加入生長營養(yǎng)素和熒光探針?？蓪⑽⑸飻?shù)量與發(fā)出熒光的凝膠塊數(shù)量相關(guān)聯(lián)。
以下實施例將進一步體現(xiàn)本發(fā)明的目的和優(yōu)點，但不應(yīng)將其中的具體物質(zhì)、具體量，以及其他條件和細節(jié)認為是對本發(fā)明的限定。
實施例除非另作說明，所有化合物和試劑均來自Aldrich Chemical Co.,Milwaukee,WI。實施例1:1∶1二甲基丙烯酰胺∶乙烯基二甲基二氫唑酮(DMA∶VDM)共聚物的制備將70份二甲基丙烯酰胺(DMA)和70份2-乙烯基-4,4-二甲基-2-噁唑啉-5-酮(乙烯基二甲基二氫唑酮，VDM，購自SNPE,Princeton,NJ)溶于210份甲基·乙基酮(MEK)，將該溶液與0.7份N,N′-偶氮二(異丁腈)引發(fā)劑(AIBN，購自WakoChemicals USA,Inc.,Richmond,VA的VAZO64TM)混合。該混合物在反應(yīng)瓶中以氮氣鼓泡5分鐘，然后密封，并在耐洗實驗器的60℃水浴中翻滾24小時。將樣品在120℃蒸發(fā)3小時后，所得反應(yīng)混合物根據(jù)比重分析顯示含40.6％固體。實施例2用2,6-二(4-疊氮基亞芐基)-4-甲基環(huán)己酮(BAMC)光交聯(lián)劑∶二甲基甲酰胺(DMF)溶液進行(DMA∶VDM)的石印構(gòu)圖將50∶50(w/w)DMA∶VDM共聚物(實施例1所制備)在甲基·乙基酮(MEK)溶劑中制成40％(w/w)的溶液。在真空干燥器中抽除MEK,24小時。將干燥的共聚物在二甲基甲酰胺中重溶成40％(w/w)溶液。在微光條件下(＜0.1英尺燭光(fc)，用Spectroline DIX-555A檢測器(Spectonics Corp.,Westbury,CT)在555nm測得)，28mg濕2,6-二(4-疊氮基亞芐基)-4-甲基環(huán)己酮(BAMC)(含水30％)在真空干燥器內(nèi)于23℃,0.1mtorr干燥，然后加到2g DMA∶VDM溶液中。用刮刀將所得混合物手工涂布在1.5cm×2.0cm×1mm厚的聚(甲基丙烯酸甲酯)片(PMMA,DRG-100,Atohaas Americas,Inc.,Philadelphia,PA)上。熔融二氧化硅光刻掩模(MRS-3,Geller Microanalytical Laboratory,Topsfield,MA)蘸涂脫模劑即十二烷基硫酸鈉的1％水溶液，然后以氮氣吹干。手工將光掩模蓋到有涂層的PMMA片上，使圖案與DMA∶VDM涂層接觸，該層合件于UV光源(ELC4001型，Electro-liteCorp.,Danbury,CT,400WHg燈，18mW/cm2，用Spectroline DIX-365檢測儀(Spectronics Corp.,Westbury,CT)在365nm處測得)下曝光3分鐘。微光條件下(如前所述)去除掩模，用100％異丙醇洗掉PMMA上未曝光的聚合物。在氮氣下干燥所得的石印構(gòu)圖的DMA∶VDM水凝膠，得到高分辨率的凝膠陣列。200倍顯微顯示(用DMRX型Leica顯微鏡，Leica,Wetzler,Germany)，可方便地制得20μm×20μm的凝膠塊，以及小到5μm×20μm的凝膠塊。參見圖1。
用類似方式，用上述MRS-3掩模在PMMA上進行水凝膠構(gòu)圖，得到了分辨率達2μm以下的圖案。1000倍顯微顯示(用DMRX型Leica顯微鏡，Leica,Wetzler,Germany)，二氫唑酮水凝膠可進行分辨率2μm以下的石印圖案。參見圖2。實施例3用BAMC光交聯(lián)劑MEK/乙酸丁酯溶劑混合物進行DMA∶VDM石印構(gòu)圖50∶50DMA∶VDM共聚物(實施例1制備)的40％MEK溶液與等量2.86％(w/w)的BAMC(30％水懸浮液)乙酸丁酯溶液混合。在Photo-resist旋轉(zhuǎn)器(1-ECl01D-R435型，Headway Research Inc.,Garland,TX)上，以4,500rpm將所得混合物的乙酸丁酯溶液旋涂到1.5cm×2.0cm×1mm的PMMA片上。涂層在真空干燥器內(nèi)于23℃，約0.1mtorr干燥1小時。如實施例2所述的石印過程得到顯微鏡下分辨率與實施例2基本相同的凝膠圖案。
讓這些凝膠在水中水解溶脹過夜。凝膠溶脹至約500％,30天后沒有明顯變形。重要的是，溶脹后的凝膠仍與PMMA支持層結(jié)合。
為了表明光交聯(lián)組合物的反應(yīng)性，制備了第二份樣品，并如下處理將含有熒光素報道探針的胺封端寡聚八核苷酸(5′-FITC-T8-3′NH2,Genemed Synthesis,SSan Francisco,CA；FITC=熒光素異硫氰酸酯)溶于20μl碳酸鹽碳酸氫鹽緩沖液(0.05M,pH9.2)。用EFD32號平頭針(EFD Corp.,E.Providence,RI)將寡核苷酸溶液點到光固化的DMA∶VDM涂層上。樣品在密封、保濕容器內(nèi)室溫下放置2小時，然后用去離子(DI)水洗滌，在去離子水中浸10小時。用落射熒光顯微鏡(Leica)觀察熒光亮斑以檢測FITC報道劑，表明寡核苷酸通過胺與二氫唑酮官能團的反應(yīng)而與光交聯(lián)凝膠共價結(jié)合。
在對照樣品中，固化的DMA∶VDM涂層在DI水中浸1小時以水解二氫唑酮環(huán)，以氮氣吹干后進行胺封端寡核苷酸溶液點樣，并在保濕容器內(nèi)放置2小時。用DI水洗滌樣品，在熒光顯微鏡下檢視。在相同的檢測儀增益下沒有觀察到熒光斑。
以上結(jié)果支持以下說法(1)反應(yīng)性二氫唑酮官能團在光交聯(lián)步驟中被保留，(2)胺封端的寡核苷酸通過與這些完好的二氫唑酮環(huán)反應(yīng)而迅速形成共價結(jié)合，和(3)加帽反應(yīng)(將殘留的二氫唑酮轉(zhuǎn)化為羧酸酯)完成后，沒有發(fā)生非特異性的寡核苷酸結(jié)合。實施例4用4-(對疊氮基水楊酰氨基)丁胺(ASBA)進行DMA∶VDM石印構(gòu)圖微光條件下(如前所述)，將25mg4-(對疊氮基水楊酰氨基)丁胺(ASBA，購自Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)和10mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺促進劑(EDC,HCI鹽，Pierce Chemical Co.,Rockford,IL)溶于0.5ml 95∶5(v/v)異丙醇∶水。將該溶液和1滴1N HCl水溶液加入50∶50DMA∶VDM共聚物(實施例1)的40％MEK溶液中。室溫下進行2小時的ASBA丁胺部分與二氫唑酮官能團偶聯(lián)反應(yīng)。將所得混合物的MEK溶液旋涂到PMMA基底上，真空干燥器內(nèi)干燥15分鐘。用MRS-3掩模，將樣品在18mW/cm2(365nm處測得)UV光下曝光3分鐘，通過所結(jié)合的ASBA的疊氮基部分發(fā)生光交聯(lián)。去除掩模，用純異丙醇徹底清洗樣品。用Leica DMRX型顯微鏡觀察分辨率與實施例2相當(dāng)?shù)哪z圖案。與雙疊氮化物交聯(lián)劑相比，以上雙重固化法提高了交聯(lián)效率。實施例5用UV-可固化丙烯酸酯膠粘劑進行DMA∶VDM石印構(gòu)圖本實施例表明具有二氫唑酮官能度的凝膠能用二氫唑酮聚合物與UV-可固化聚合物的混合物進行石印構(gòu)圖。該方法的優(yōu)點在于可通過改變UV-可固化聚合物與二氫唑酮聚合物的混合比改變二氫唑酮密度。
50∶50DMA∶VDM共聚物(實施例1)的40％(w/w)MEK溶液與不同量UV可固化丙烯酸酯膠粘劑(Ⅵ類，醫(yī)用級膠粘劑，4M01型，Electro-lite Corp.,Danbury,CT)按1∶1-1∶30(v/v)的比例混合。手工將該混合物涂布到PMMA上。如實施例2所述進行石印，然后UV曝光5分鐘。5份丙烯酸酯膠粘劑∶2份二氫唑酮共聚物(v/v)凝膠陣列的分辨率與實施例2的相當(dāng)。實施例6用BAMC光交聯(lián)劑進行的激光誘導(dǎo)的DMA∶VDM熱成像(LITI)激光誘導(dǎo)熱成像(LITI)供體片由聚對苯二甲酸乙二酯基底上的二氫唑酮水凝膠層、聚丙烯酸酯中間層和炭黑光-熱轉(zhuǎn)換層構(gòu)成。如下制備上述供體片用Yasui Seiki CAG-150型實驗室涂布機(Yasui Seiki Co.,Bloomington,Ind.)，用每英寸線距90螺槽的微槽輥，將炭黑在輻射可固化樹脂中所成的水性分散系涂在4milPET基底上，制備成光-熱轉(zhuǎn)換層。涂料組合物為1份三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(SartomerTMSR351HP,Sartomer Co.Inc.,Exton,PA),1.15份3M匹配圖案底片黑色研磨料(Matchprint Negative Black Millbase)(3M Co.St.Paul,MN)和5％2-羥基-2,2-二甲基乙酰苯光引發(fā)劑(DarocurTM1173,Ciba SpecialityChemicals Co.,Tarrytown,NY)。然后在涂布機上在線干燥和UV固化該涂層。1060nm處的涂層膜透射(transmission)光密度(TOD=-logT,T是測得的透光度分數(shù))為2.35。
制備的聚丙烯酸酯中間層為固含量20％的溶液，即331.5g甲基·乙基酮中含130g三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(SartomerTMSR351HP),130g3∶1混合物(固含量25％(w/w))和聚乙烯醇縮丁醛(ButvarTMB98,Monsanto Co.,St.Louis,MO),221g1-甲基-2-丙醇，8.13DarocurTM1173，然后將溶液在光-熱轉(zhuǎn)換層上涂成1.0-1.2μm厚，在Radiation Polymer Corporation(Plainfield,Ill.)的QC1202AN3TR型UV處理儀(中壓UV燈，總曝光能量100毫焦耳/cm2,N2氣氛)中通過光化學(xué)輻射固化，形成中間層。
如實施例2所述，將60∶40(w/w)DMA/VDM共聚物(按實施例1制備，56份DMA和84份VDM)固體在環(huán)己酮中分散成40％(w/w)溶液。將28mg30％BAMC交聯(lián)劑水性懸浮液干燥后的殘留物溶解在2ml聚合物-環(huán)己酮溶液中，弱光條件下，將所得混合物手工涂到中間層上至5μm厚，就此完成LITI供體基底。
材料通過LITI被轉(zhuǎn)移到玻璃受體片上。所用的LITI裝置是以連續(xù)波長(cw)模式運行的YAG激光儀(Control Laser Corporation,Orlando,FL的2600型)。cw輸出光入射到231A型rf驅(qū)動器驅(qū)動的1201E-2型聲-光調(diào)節(jié)器(AOM)上，驅(qū)動器和調(diào)節(jié)器均購自Isomet Corporation,Springfield,VA。用三部件，2.5″焦距物鏡通過一透光孔選擇YAG激光束中經(jīng)AOM衍射成第一級的部分，聚焦于一個直徑100μm的點上。在Aerotech Inc.,Pittsburg,PA的ATS50030xy平移平臺上，將與玻璃受體接觸的LITI供體片置于該物鏡的焦點。用Hewlett-Packard,SantaClara,CA的8116A型函數(shù)發(fā)生儀(function generator)開關(guān)AOM的rf驅(qū)動器。用這種方法，使LITI供體片/受體組合件的不同區(qū)域移動到激光束中，激光束開關(guān)產(chǎn)生脈沖寬度0.1-100msec的光脈沖。供體片吸收這些激光脈沖，迅速加熱上述DMA/VDM共聚物層，將共聚物熱轉(zhuǎn)移到玻璃受體上。
用0.128W(用Molectron Detector,Inc.Portland,OR的J3-09型檢測儀測定)的激光功率進行熱轉(zhuǎn)移實驗。在這些實驗中，光脈沖寬度在2-7msec之間變化。我們發(fā)現(xiàn)，共聚物不含BAMC交聯(lián)劑的供體片上，沒有照到激光束的區(qū)域也有部分共聚物發(fā)生轉(zhuǎn)移。此供體片上去除殘留的環(huán)己酮可以減少這種轉(zhuǎn)移，但不能完全消除。交聯(lián)后的共聚物沒有任何結(jié)塊傾向。用Leica DMRX型顯微鏡放大100倍觀察可以看到以6和7msec的脈沖寬度可由交聯(lián)供體片產(chǎn)生直徑50μm，厚4μm的凝膠塊。參見圖3。實施例7用BAMC光交聯(lián)劑進行的結(jié)合于DMA∶VDM的酶的激光誘導(dǎo)熱成像(LITI)如實施例6所述制備激光誘導(dǎo)熱成像(LITI)供體片，但進行以下改變用以50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.6)配制的β-D-葡糖苷酶1mg/ml溶液處理不同位置的二氫唑酮水凝膠涂層，任其干燥。這使得酶通過其反應(yīng)性側(cè)基與水凝膠組合物的二氫唑酮官能團反應(yīng)，與供體片的二氫唑酮轉(zhuǎn)移層共價結(jié)合。
用類似實施例6的方法，通過LITI將浸漬了酶的二氫唑酮轉(zhuǎn)移到PVdC(聚偏1,1-二氯乙烯)打底的PET受體片上。此例中，在受體上形成了寬100μm的條形，然后進行交聯(lián)。有些條對應(yīng)于供體片上有酶的區(qū)域。有些對應(yīng)于沒有酶的對照區(qū)。給所有條形接種以指示劑(4-甲基-繖形基(umbelliferyl)-β-D-葡糖苷)的0.05mM溶液，該指示劑會因β-D-葡糖苷酶酶解而發(fā)熒光。用Leica落射熒光顯微鏡可觀察到浸有酶的條形有亮藍色的熒光，對照條形則沒有。以上結(jié)果表明，與水凝膠組合物共價結(jié)合后，組合物的LITI轉(zhuǎn)移，組合物的交聯(lián)，而且，酶活性被保留。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本發(fā)明范圍內(nèi)的各種修改是顯而易見的，不應(yīng)認為本發(fā)明僅限于以上說明性實施例。
權(quán)利要求
1．一種可光固化和光構(gòu)圖的組合物，包含a)1-99重量份至少一種二氫唑酮官能單體與0-99重量份至少一種共聚單體形成的至少一種共聚物；和b)至少一種光交聯(lián)劑；其中，如果該組合物不含生物分子-二氫唑酮鍵，光交聯(lián)劑上的二氫唑酮反應(yīng)性官能團數(shù)少于該組合物中所含的二氫唑酮官能團數(shù)。
2．一種制品，含有含權(quán)利要求1所述組合物的水凝膠，所述組合物已光固化，所述水凝膠與基底結(jié)合。
3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的制品，所述水凝膠被分隔成離散的各區(qū)，各自與所述基底結(jié)合，各區(qū)的大小以及區(qū)際間隔在所述水凝膠層面內(nèi)的最小尺寸小于200μm。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，還包含與二氫唑酮官能團殘基共價結(jié)合的生物學(xué)活性分子。
5．根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制品，還包含與所述水凝膠二氫唑酮官能團殘基共價結(jié)合的生物學(xué)活性分子。
6．根據(jù)權(quán)利要求3所述的制品，還包含與所述不同水凝膠離散區(qū)的二氫唑酮官能團殘基共價結(jié)合的不同生物學(xué)活性分子。
7．一種制品的制造方法，包括以下步驟a)將權(quán)利要求1所述的可光固化組合物加到基底上；和b)用電磁伯輻射該層，使得該層的至少一部分固化。
8．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中的輻射步驟包括通過光掩模選擇性地使所述層部分地接受輻射。
9．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的可光固化組合物層在所述基底上呈圖案形式，覆蓋基底的某些部分，而使另一些部分不被覆蓋。
10．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括在固化之前去除所述可光固化組合物層的某些部分，以形成圖案。
11．根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，還包括在固化之后去除所述可光固化組合物層的某些部分，以形成圖案。
12．根據(jù)權(quán)利要求7-11中任一項所述的方法，還包括在所述可光固化組合物層固化前，通過與所述水凝膠的二氫唑酮官能團反應(yīng)，將生物學(xué)活性分子固定于所述制品的一部分。
13．根據(jù)權(quán)利要求7-11中任一項所述的方法，還包括在所述可光固化組合物層固化后，通過與所述水凝膠的二氫唑酮官能團反應(yīng)，將生物學(xué)活性分子固定于所述制品的一部分。
14．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述二氫唑酮官能單體中至少其一是2-乙烯基-4,4-二甲基-2-噁唑啉-5-酮(乙烯基二甲基二氫唑酮，VDM)單體。
15．根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述光交聯(lián)劑中至少其一選自2,6-二(4-疊氮基亞芐基)-4-甲基環(huán)己酮(BAMC)和4-(對疊氮基水楊酰氨基)丁胺(ASBA)。
16．根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的制品，所述生物學(xué)活性分子至少其一是微生物的一部分，該微生物由此固定于所述制品上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可光固化并可光構(gòu)圖的組合物,其中包含:a)1－99重量份二氫唑酮官能單體與0－99重量份至少一種共聚單體形成的至少一種共聚物;和b)至少一種光交聯(lián)劑。本發(fā)明還公開了一種具有基底和以上固化組合物凝膠層的制品,可對其進行高分辨率的光構(gòu)圖,并用于將生物分子與基底結(jié)合。
文檔編號C08K5/00GK1325505SQ99813055
公開日2001年12月5日 申請日期1999年3月8日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月30日
發(fā)明者劉杰, J·G·本特森 申請人:美國3M公司