抗肝纖維化青霉呋喃酮a化合物及其藥物組合物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及具有抗肝纖維化活性的呋喃酮聚酮類 活性化合物Penicilfuranone A及其制備方法，以該化合物為活性成分的藥物組合物，以及 其在制備治療肝纖維化疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】：
[0002] 呋喃酮類聚酮類化合物是一類有真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，目前見(jiàn)報(bào)道于真菌 Aspergillus rugulosus, Cephalosporium gregatum,以及 Penicillium daleae 的次生代 謝產(chǎn)物中。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道的呋喃聚酮類化合物不足20個(gè)化合物，且其分子量皆為300 左右。前人研究表明該類化合物具有抗菌，致植物枯萎，抑制哺乳動(dòng)物Y族DNA酶等作用。 本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎，分子量為486,與之前報(bào)道的該類化合物，結(jié)構(gòu)完全不一樣。迄今為 止，現(xiàn)有技術(shù)中尚未見(jiàn)有本發(fā)明的結(jié)構(gòu)新穎的呋喃酮聚酮類化合物被報(bào)道，同時(shí)也未見(jiàn)任 何文獻(xiàn)報(bào)道該類呋喃酮類化合物具有抗肝纖維化活性的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0003] 本發(fā)明目的在于提供從內(nèi)生真菌Penicillium daleae中分離得到的咲喃聚酮類 化合物A，其制備方法，在藥物中特別是在抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)本明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0005] 下述結(jié)構(gòu)式（I)所示的青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，
[0007] 藥物組合物，其包含所述的青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和至少一 種藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。
[0008] 根據(jù)所述的青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中所述的藥學(xué)上可接 受的鹽為鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、甲酸鹽、乙酸鹽、 乙二酸鹽。
[0009] 本發(fā)明同時(shí)提供了青霉呋喃酮A化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，取青 霉咲喃酮A Penici 11 ium daleae發(fā)酵物，用有機(jī)溶劑提取，濃縮得浸膏，分別用乙酸乙酯萃 取，硅膠層析柱，制備型高效液相色譜等方法得結(jié)構(gòu)式（I)化合物。
[0010] 更具體的制備方法如下：取Penicillium daleae菌絲體接種于滅菌馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)液中PDA，于室溫下以170轉(zhuǎn)每分鐘在搖床中震蕩五天，做成種子液，將種子液轉(zhuǎn)接 到滅菌的大米培養(yǎng)基中，28°C條件下無(wú)菌培養(yǎng)40天，用乙酸乙酯提取利用大米培養(yǎng)基培養(yǎng) 40天后的菌絲體，共提取四次，得到乙酸乙酯提取物，利用硅膠柱色譜，高效液相色譜質(zhì)譜 聯(lián)用，制備型高效液相色譜處理乙酸乙酯提取物，最后得到青霉呋喃酮A，其制備液相色譜 條件為：12mL/min，UVX_ 230nm，MeCN-H20 45:55,保留時(shí)間 15.0min。
[0011] 上述制備方法中，青霉咲喃酮A化合物可進(jìn)一步與適當(dāng)?shù)乃岢甥}，適當(dāng)?shù)乃徇x自 鹽酸、氫溴酸、硝酸、硫酸、磷酸、酒石酸、檸檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸或其他適合的有機(jī)酸或 無(wú)機(jī)酸。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述的青霉呋喃酮A化合物或藥物組合物在制備抗肝纖維化的 藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的藥物組合物，能作為適宜口服或注射給藥的制劑形式。
[0014] 其中所述的口服給藥的制劑形式為片劑、緩釋片、控釋片、錠劑、硬或軟膠囊、滴 丸、微丸、水性或油混懸劑、乳劑、可分散的散劑或顆粒劑、口服溶液、糖漿劑或酏劑，所述的 注射給藥的制劑形式為滅菌的水性或油性溶液、無(wú)菌粉末、脂質(zhì)體、乳劑、微乳劑、納米乳劑 或微囊。
[0015] 本發(fā)明化合物青霉呋喃酮A結(jié)構(gòu)新穎，分子量為486,與之前報(bào)道的該類化合物結(jié) 構(gòu)完全不一樣，且具有明顯的抗肝纖維化活性，其機(jī)制與阻斷TGF-β 1刺激肝星狀細(xì)胞的 過(guò)度激活和細(xì)胞外基質(zhì)的形成能力有關(guān)，在低于32 μ Μ的濃度下，Penicilfuranone A未見(jiàn) 明顯的肝細(xì)胞毒性。
【附圖說(shuō)明】：
[0016] 圖1為本發(fā)明Penicilfuranone A的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0017] 圖2為本發(fā)明Penicilfuranone A的X-單晶衍射結(jié)構(gòu)示意圖；
[0018] 圖3為本發(fā)明Penicilfuranone A對(duì)正常人肝臟細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響（MTT法；處 理 48h);
[0019] 圖4為本發(fā)明Penicilfuranone A抑制TGF-β 1誘導(dǎo)下，肝星狀細(xì)胞纖維化形成相 關(guān)蛋白的表達(dá)（western blot法；A為大鼠 T6肝星狀細(xì)胞株，B為人LX-2肝星狀細(xì)胞株）。
【具體實(shí)施方式】：
[0020] 下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以 此來(lái)限定本發(fā)明。
[0021] 實(shí)施例1 :
[0022] 化合物 Penicilfuranone A 的制備：
[0023] 分離流程：取少量Penicillium daleae菌絲體接種于1000ml滅菌馬鈴薯葡萄 糖培養(yǎng)液中（PDA)，于室溫下以170轉(zhuǎn)每分鐘在搖床中震蕩五天，做成種子液。將種子 液轉(zhuǎn)接到2. 0公斤滅菌的大米培養(yǎng)基中，25度條件下，無(wú)菌培養(yǎng)35天。用乙酸乙酯5L 提取利用大米培養(yǎng)基培養(yǎng)35天后的菌絲體，共提取五次，每次5L，得到乙酸乙酯提取物 18g。利用硅膠柱色譜，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，制備型高效液相色譜處理18g的乙酸乙 酯提取物，最后得到Penicilfuranone A 12mg，其制備液相色譜條件為：12mL/min，UVAmax230nm，MeCN-H2045:55,保留時(shí)間 15. Omin。
[0024] 實(shí)施例2 :
[0025] Penicilfuranone A 結(jié)構(gòu)解析：
[0026] 化合物Penicilfuranone A，金色針狀晶體，[a ]22D - 6 (c 0· 2, MeOH) iSI-MS譜給 出準(zhǔn)分子離子峰為m/z 509[M+Na]+，結(jié)合高分辨正離子HR-ESI-MS(m/z[M+Na]+509. 1792， 計(jì)算值為C26H3Q09Na，509. 1782)和13C NMR、DEPT譜提供的信息，確定其分子式為C26H3Q09,不 飽和度為12。UV光譜在196 (4. 5)，222 (4. 6)，359 (4. 0)，495 (2. 6) nm處有吸收，說(shuō)明分子中 存在大共輒基團(tuán)。分析4和13C NMR譜（表1)，再結(jié)合HSQC，HMBC，4-? C0SY，以及R0ESY 譜表明得到化合物Penicilfuranone A的結(jié)構(gòu)。最后，通過(guò)X-單晶衍射分析進(jìn)一步證實(shí)了 以上分析，并確定了其立體構(gòu)型（圖2)。Penicilfuranone A的X-單晶衍射數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳 到應(yīng)該劍橋大學(xué)單晶數(shù)據(jù)庫(kù)www. cede, cam, ac. uk,其登記號(hào)為:CO)C 1042018。
[0027] 表 1. Penicilfuranone A 的 NMR 波譜數(shù)據(jù)（δ in ppm, Jin Hz)
[0029] 11試于600MHz儀器，溶劑為DMSO-d 6.b測(cè)試于600MHz儀器，溶劑為acetone-d 6.
[0030] 實(shí)施例3 :
[0031] Penicilfuranone A對(duì)正常人肝細(xì)胞的毒性檢測(cè)：
[0032] 正常人肝臟細(xì)胞（L-02細(xì)胞株）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源 中心；RPMI 1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；二甲基亞砜 (DMSO)和噻唑藍(lán)（MTT)為sigma公司產(chǎn)品；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)，Thermo公司）；恒溫C02培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo公司）；正常人肝細(xì)胞L-02細(xì)胞株用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%滅 活胎牛血清，100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素）于37°C、飽和空氣濕度、含5% 0)2的 培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。取指數(shù)生長(zhǎng)期L-02細(xì)胞株，1000 Xg離心5min，棄去上清液，用相 應(yīng)的培養(yǎng)基打勻，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后稀釋成濃度為3 X 104個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，接種 于96孔板，每孔200 μ L，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱24h后給藥，分別設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組和11個(gè)濃度的 Penicilfuranone A 樣品組（0· 125、0· 25、0· 5、1、2、4、8、16、32、64、128 μΜ)，每個(gè)濃度設(shè)置 3個(gè)復(fù)孔，加藥后將96孔板分別培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中48h后，每孔加20uL ΜΤΤ溶液（用PBS 將MTT粉末配成5mg/mL的儲(chǔ)存液），在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后離心棄去上清液，每孔 加入100uL DMS0,輕微振蕩使紫色晶體完全溶解，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定每孔吸光度（0D 值），計(jì)算3個(gè)復(fù)孔0D值平均值，并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（％) =(給藥組細(xì)胞0D 均值一背景0D均值V (對(duì)照組細(xì)胞0D均值一背景0D均值）X 100%。
[0033] 肝細(xì)胞損傷往往被認(rèn)為是發(fā)生肝臟纖維化的誘發(fā)因子，因此，藥物可以通過(guò)保護(hù) 肝細(xì)胞的方式來(lái)阻止肝臟纖維化進(jìn)程，至少其本身應(yīng)沒(méi)有肝細(xì)胞毒性。MTT檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)Penicilfuranone A各濃度處理48h后，