一種電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的制備方法。屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]呋喃唑酮(痢特靈)是一種硝基呋喃類抗生素，為廣譜抗菌藥。作為獸藥使用時，呋喃唑酮對防治某些原蟲病、水霉病、細(xì)菌性爛鰓、赤皮病、出血病等有良好藥效。在養(yǎng)殖業(yè)中，呋喃唑酮可用于治療畜禽腸道感染，如仔豬黃、白痢。在水產(chǎn)業(yè)中，呋喃唑酮對鮭亞目感染腦粘體蟲有一定療效。但我國農(nóng)業(yè)部將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動物性食品中檢出。FDA也于2002年禁止了硝基呋喃類(包括呋喃唑酮)在動物性食品中的使用。
[0003]目前，檢測呋喃唑酮的方法主要有色譜法、質(zhì)譜法等。此類方法儀器貴重、操作復(fù)雜，化驗(yàn)人員需要專業(yè)培訓(xùn)后才能進(jìn)行檢測。因此，研發(fā)成本低、檢測快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的呋喃唑酮傳感器具有重要意義。
[0004]電致化學(xué)發(fā)光傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。制備性能優(yōu)越的電致化學(xué)發(fā)光傳感器，其最關(guān)鍵技術(shù)就是發(fā)光強(qiáng)度及穩(wěn)定性和免疫分子的有效固定及重現(xiàn)性等性能的提高。二氧化鈦是應(yīng)用最為廣泛的一種光催化劑材料，由于片狀二氧化鈦納米材料能夠暴露更多的高指數(shù)晶面，具有更高的光催化活性，二氧化鈦納米片具有比納米粒子更好地應(yīng)用前景，對于二氧化鈦納米片的研究也備受關(guān)注。同時，二氧化鈦導(dǎo)電性差也限制了由單一二氧化鈦納米材料構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光傳感器的靈敏度普遍不高，不利于實(shí)際應(yīng)用。但是，在半導(dǎo)體納米材料上修飾或復(fù)合特殊的納米材料，可以有效提高半導(dǎo)體表面的共振能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生更強(qiáng)的發(fā)光強(qiáng)度，并大大提高檢測靈敏度。因此，設(shè)計(jì)、制備高效、穩(wěn)定的二氧化鈦納米片及其修飾物是制備電致化學(xué)發(fā)光傳感器的關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡單、靈敏度高、檢測快速、特異性強(qiáng)的電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的制備方法，所制備的傳感器，可用于呋喃唑酮的快速、靈敏檢測?；诖四康模景l(fā)明首先制備了一種新型二維納米復(fù)合材料，即錳摻雜二氧化鈦納米片原位復(fù)合氮化碳二維納米復(fù)合材料Mn-Ti02/g_C3N4，利用該材料的良好的生物相容性和大的比表面積，負(fù)載上呋喃唑酮抗體，然后通過戊二醛的交聯(lián)作用固定辣根過氧化物酶，在進(jìn)行檢測時，由于辣根過氧化物酶可以催化過氧化氫原位生成02，并與底液中的K2S2O8進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電致化學(xué)發(fā)光信號，再利用抗體與抗原的特異性定量結(jié)合對電子傳輸能力的影響，使得電流強(qiáng)度降低，從而降低發(fā)光強(qiáng)度，最終實(shí)現(xiàn)了采用無標(biāo)記的電致化學(xué)發(fā)光方法檢測呋喃唑酮的生物傳感器的構(gòu)建。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
1.一種電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的制備方法，所述的電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器由工作電極、Mn-Ti02/g-C3N4、呋喃唑酮抗體、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根過氧化物酶組成;所述的Mn-Ti02/g-C3N4為錳摻雜二氧化鈦納米片原位復(fù)合氮化碳二維納米復(fù)合材料；
其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟:
a.Mn-Ti02/g-C3N4的制備;
b.電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的制備；
其中，步驟a制備Mn-Ti02/g-C3N4的具體步驟為:
首先，取0.8?1.2 mmol錳鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.5?0.8mL氫氟酸，160?200 "€下在反應(yīng)爸中反應(yīng)18?24小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50°C下真空干燥;其次，取150?250 mg干燥后的固體與400mg三聚氰胺混合，并研磨成粉末;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為I?3 °C/min，在480?560°C下煅燒0.5?5小時;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得Mn-Ti02/g-C3N4 ；
所述的錳鹽選自下列之一:硫酸錳、氯化錳、硝酸錳；
步驟b制備電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的具體步驟為:
(1)以ITO導(dǎo)電玻璃為工作電極，在電極表面滴涂8?12uL的Mn-Ti02/g-C3N4溶膠，室溫下晾干；
(2)將步驟(I)中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8?12pL 10 μg/mL的呋喃唑酮抗體溶液，4 0C冰箱中保存晾干；
(3)將步驟(2)中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8?12pL濃度為100 pg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 0C冰箱中保存晾干；
(4)將步驟(3)中得到的電極用I3BS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂2?4pL的戊二醛溶液，40C冰箱中保存晾干；
(5)將步驟(4)中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂6?10pL濃度為SOyg/mL的辣根過氧化物酶溶液，4 0C冰箱中保存晾干；
(6)將步驟(5)中得到的電極用PBS清洗，在4°C冰箱中保存晾干后，即制得電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器；
所述的Mn-Ti02/g-C3N4溶液為將50 mg的Mn-Ti02/g_C3N4粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4 ；
所述的戊二醛溶液為體積比為2.5%的戊二醛水溶液。
[0007]2.本發(fā)明所述的制備方法所制備的電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于，包括如下應(yīng)用步驟:
a.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液；
b.工作電極修飾:將如權(quán)利要求1所述的制備方法所制備的電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器為工作電極，將步驟a中配制的不同濃度的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，4 °C冰箱中保存；
c.工作曲線繪制:將Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，與步驟b所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接到電致化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備上;在電解槽中先后加入15 mL的K2S2O8溶液和100 uL的H2O2溶液；用循環(huán)伏安法對組裝的工作電極施加循環(huán)電壓；根據(jù)所得的電致化學(xué)發(fā)光的光信號強(qiáng)度與呋喃唑酮抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制工作曲線；空白標(biāo)樣的光信號強(qiáng)度記為Do，含有不同濃度的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的光信號強(qiáng)度記為Di,響應(yīng)光信號強(qiáng)度降低的差值為AD = Do-Di，AD與呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C之間成線性關(guān)系，繪制AD — C工作曲線；
d.呋喃唑酮的檢測:用待測樣品代替步驟a中的呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟b和c中的方法進(jìn)行檢測，根據(jù)響應(yīng)光信號強(qiáng)度降低的差值A(chǔ)D和工作曲線，得到待測樣品中呋喃唑酮的含量；
所述的K2S2O8溶液由I mol K2S2O8和I mol KCl溶于10 L的pH=6.5緩沖溶液中制備得到，所述的pH=6.5緩沖溶液為pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液；
所述的H2O2溶液為過氧化氫水溶液，所述的過氧化氫水溶液的濃度為10%。
[0008]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明所述的電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器制備簡單，操作方便，實(shí)現(xiàn)了對樣品的快速、靈敏、高選擇性檢測，并且成本低，可應(yīng)用于便攜式檢測，具有市場發(fā)展前景；
(2)本發(fā)明首次制備了新型基質(zhì)材料Mn-Ti02/g-C3N4，由于猛在二氧化鈦納米片上的原位生長而充分與二氧化鈦納米片接觸，利用錳的金屬表面等離子體作用，有效提高了半導(dǎo)體基質(zhì)共振能量轉(zhuǎn)移能力，解決了二氧化鈦納米片雖然比表面積比較大及介孔特性適用于電致化學(xué)發(fā)光基質(zhì)材料，但是電致化學(xué)發(fā)光信號不穩(wěn)定的技術(shù)問題；同時由于氮化碳g_C3N4的良好的導(dǎo)電性和電致化學(xué)發(fā)光的特性，再加上二氧化鈦納米片在其上的充分分散，極大地增大了電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，解決了二氧化鈦納米片導(dǎo)電性差和電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度弱而不利于制備電致化學(xué)發(fā)光傳感器的技術(shù)問題，因此，該材料的有效制備，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值；
(3)本發(fā)明首次將Mn-Ti02/g-C3N4應(yīng)用于電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備中，顯著提高了電致化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，大大提高了電致化學(xué)發(fā)光傳感器的檢測靈敏度，使得電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器實(shí)現(xiàn)了在實(shí)際工作中的應(yīng)用;該材料的應(yīng)用，也為相關(guān)生物傳感器，如光電化學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器等提供了技術(shù)參考，具有廣泛的潛在使用價值。
【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)施例1Mn-Ti02/g-C3N4 的制備
首先，取0.8 mmol錳鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.5 mL氫氟酸，160 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)24小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 °C下真空干燥；其次，取150 mg干燥后的固體與400 mg三聚氰胺混合，并研磨成粉末;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為I V /min，在480 °C下煅燒5小時;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得Mn-Ti02/g-C3N4;
所述的錳鹽為硫酸錳。
[0010]實(shí)施例2Mn-TifVg-C3Nd^iJS
首先，取1.0 mmol錳鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.6 mL氫氟酸，180 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)21小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 °C下真空干燥；其次，取200 mg干燥后的固體與400 mg三聚氰胺混合，并研磨成粉末;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為2 °C/min，在520°C下煅燒2小時;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得Mn-Ti02/g-C3N4;
所述的錳鹽為氯化錳。
[0011]實(shí)施例3Mn-TifVg-C3Nd^iJS
首先，取1.2 mmol錳鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過程中，緩慢加入0.8 mL氫氟酸，200 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)18小時，冷卻至室溫后，用超純水和無水乙醇離心洗滌三次后，50 °C下真空干燥；其次，取250 mg干燥后的固體與400 mg三聚氰胺混合，并研磨成粉末;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為3 °C/min，在560°C下煅燒0.5小時?’最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得Mn-Ti02/g-C3N4;
所述的錳鹽為硝酸錳。
[0012]實(shí)施例4電致化學(xué)發(fā)光呋喃唑酮生物傳感器的制備方法
(1)將寬為Icm、長為4 cm的ITO導(dǎo)電玻璃作為工作電極，在電極表面滴涂8 yL的Mn-Ti02/g-C3N4溶膠，室溫下晾干；
(2)將步驟(I)中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8uL 10 pg/mL的呋喃唑酮抗體溶液，4 0C冰箱中保存晾干；<